布鲁氏菌基因缺失株TaqMan荧光定量PCR检测方法

Establishing a method for detecting the deletion strains of Brucella gene with TaqManfluorescence quantitative PCR

摘要

[目的]建立布鲁氏菌基因缺失株荧光定量PCR方法，为其他布鲁氏菌毒株和基因缺失株鉴别诊断提供技术支持。[方法]根据GenBank中布鲁氏菌赤藓糖醇基因（eryA基因）设计合成特异性引物和探针，对引物、探针浓度、退火温度等反应条件进行优化后，检测该方法的特异性、敏感性和重复性。[结果]重组质粒标准品在1.56×10～8～1.56×10 copies/μL呈良好线性关系；特异性试验结果显示，该方法对其他14种常见细菌病毒均无交叉反应；敏感性试验结果显示该方法对布鲁氏菌的检测敏感度为100 copies/μL。重复性试验结果显示，组内和组间变异系数均小于2%。[结论]TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、稳定性好，可用于布鲁氏菌基因缺失株和其他布鲁氏菌株的鉴别诊断。

关键词

布鲁氏菌 / TaqMan荧光定量PCR / 检测方法 / 鉴别诊断 / 基因缺失

Key words

Brucella / TaqMan fluorescence quantitative PCR / method of detection / identification and diagnosis / gene deletion

布鲁氏菌病（以下简称布病）是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患传染病。布鲁氏菌感染家畜可引起母畜流产，公畜睾丸炎等，也可引起其他症状（如子宫炎、乳腺炎），人感染该病菌后出现关节肿大、马耳他热，且不易恢复，给畜牧业健康发展和公共卫生安全造成了重大威胁^[1]。目前，布鲁氏菌病在我国分布范围广，不同省区布鲁氏菌病疫情的严重程度差距很大，Ran等^[2]通过回归分析对2008—2018年奶牛血清效价的有关研究发现，北方部分地区奶牛的阳性率较高。研究显示，我国南方2006—2021年布病占比6.34%，而在北方地区布病占比93.67%，近年来南部地区布病发病病例有所增加，这可能与北方地区牛羊活体调运有关^[3]。该病原具有组织趋向性，如子宫、生殖器官、乳腺和与之相关的淋巴结等组织，乳腺、淋巴结等都是布鲁氏菌逃避免疫防御机制并进行繁殖的常见组织^[4]。这种趋向性和广泛繁殖性可促进该菌在易感动物体内生长，并上调其主要毒力因子和中枢代谢关键酶的表达，通过控制细胞内外赤藓糖醇的浓度，发现若细胞外赤藓糖醇含量高于细胞内时，细胞外布鲁氏菌的含量就会升高。Sangari等^[5]对B.abortus 2 308株赤藓醇基因（eryA基因）的研究显示，该基因全序列有7 714 bp，操纵子、启动子位于5′-ery A并含IHF（整合宿主因子）结合点，eryA基因影响整个基因的转录表达，而除减毒株S19基因外，其他布鲁氏菌株均能利用赤藓糖醇。而减毒株由于缺乏赤藓糖醇的702 bp基因使其成为不能利用赤藓糖醇的菌株。因此，该基因在布鲁氏菌毒力代谢中发挥着重要作用，对其深入研究也能对布病防控起到重要作用。

目前该病主要通过疫苗进行预防控制，但现有检测方法大多不能用于区分野毒感染。Bricker等^[6]通过AMOS PCR对牛种、羊种、绵羊及猪种布鲁氏菌进行鉴定，但无法区别疫苗株和野毒株。Nan等^[7]通过利用单核苷酸多态性（SNP）的相关差异进行研究，建立的PCR方法仅能从具有代表性的18株布鲁氏菌中分离出羊种布鲁氏菌104 M毒株。本研究根据GenBank中布鲁氏菌赤藓糖醇基因（eryA基因）设计合成特异性引物和探针，成功建立了布鲁氏菌基因缺失株荧光定量PCR方法。该方法具有较高的敏感性及特异性，能有效对该基因缺失株进行鉴别诊断，并对待测样品中布鲁氏菌基因缺失株含量进行检测，可以进行定量分析。同时，对布鲁氏菌病的预防、控制、净化、消灭起到至关重要的作用。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

所需菌株及试剂：羊种布鲁氏菌Rev.1、S19、A19及S2菌株试剂、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a感受态细胞、DNA Marker、T4连接酶、限制性内切酶、2×Es Taq MasterMix、细菌质粒小提取试剂盒、细菌基因组提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、TSB培养基、琼脂粉、马血清。

1.2 仪器设备

超速离心机、高速冷冻离心机、荧光定量PCR仪、恒温培养箱、恒温振荡器、水浴锅等。

1.3 引物和探针设计

通过GenBank软件：利用U57100.2找到eryA基因，然后利用SNAPgene软件进行引物和探针设计，并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，探针5′端标记荧光基团FAM，探针3′端标记淬灭基团BHQ2（表1）。

1.4 质粒标准品的制备

按照DNeasy Blood & Tissue Kit血液/组织DNA试剂盒提取布鲁氏菌Rev.1株的基因组DNA为模板，采用表1引物，通过已经优化的PRC反应体系（表2），在反应条件为：95 ℃变性3 min；94 ℃变性45 s，35个循环，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，最后72 ℃延伸10 min，进行扩增128 bp目的片段扩增后，进行胶回收，利用T4连接酶连接后转入DH5a感受态细胞中，得到经PCR检测并测序正确的质粒pMD-19T-eryA。扩大培养后提取质粒及质粒浓度测定，并根据拷贝数计算公式，换算成拷贝数。

1.5 荧光定量PCR方法建立及条件优化

将合成的引物及探针稀释为10 μmol/L，以反应体系为25 µL的阳性模板重组质粒pMD-19T-eryA进行荧光定量PCR反应。分别摸索出最佳引物浓度（0.25、0.50、0.75、1.00 µmol/L）、探针浓度（0.25、0.50、0.75、1.00 µmol/L）以及不同退火温度（52、56、58、62 ℃），在循环数为45条件下的扩增效率。

1.6 敏感性试验

将提取的质粒以10倍梯度稀释成1.56×10⁸、1.56×10⁷、1.56×10⁶、1.56×10⁵、1.56×10⁴、1.56×10³、1.56×10²、1.56×10 copies/µL，分别以其为模板进行该方法的荧光定量敏感性验证。

1.7 特异性试验

分别选取7个细菌基因组：大肠杆菌、腐败梭菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、地衣芽孢杆菌、铜绿假单胞菌及布病Rev.1株；7个病毒基因组：羊口疮病毒（ORFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒（PCV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、牛副流感病毒（BPIV）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBR）及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS）为模板，每个样品重复3次，观察PCR反应的特异性，建立荧光定量PCR反应特异性。

1.8 重复性试验

分别以稀释成的阳性质粒1.56×10⁸、1.56×10⁷、1.56×10⁶、1.56×10⁵、1.56×10⁴、1.56×10³、1.56×10²、1.56×10 copies/µL为模板，每组进行3个重复，根据Ct值计算组内变化情况及差异，探究荧光定量方法的稳定性（表3）。

2 结果与分析

2.1 标准品的制备

通过NCBI对eryA基因进行查找，利用引物设计软件进行过引物设计（由上海生工进行合成）。对引物进行稀释，并进行PCR扩增，扩增的目的片段大小为128 bp，结果如图1所示。对其进行测序后并进行BLAST比对，与预期结果一致。对扩增的目的片段进行胶回收后，根据pMD-19T连接试剂盒的操作说明进行连接，构建体系为10 µL：pMD-19T载体1 µL、eryA 4 µL、Solution 5 µL，16 ℃进行过夜连接。将连接产物转至DH5a感受态细胞中，在恒温培养箱中过夜培养，然后进行挑菌鉴定，并测序验证。将验证正确的菌落进行摇菌及质粒提取。

2.2 反应体系、条件优化及标准曲线的建立

用Qibit对提取的质粒pMD-19T-eryA进行浓度测定。应用公式计算重组质粒pMD-19T-eryA的拷贝数，并进行10倍梯度稀释，依次稀释至1.56×10⁸、1.56×10⁷、1.56×Ct10⁶、1.56×10⁵、1.56×10⁴、1.56×10³、1.56×10²、1.56×10 copies/µL，进行实时荧光定量PCR检测，结果如图2所示。检测结束后以各标准品的浓度Log值（X轴）和其相应循环数（值）（Y轴）作图，绘制标准曲线，结果如图3所示。反应完成后，结果显示其扩增效率E为89.7%，R ²为0.999，这表明标准曲线具有良好的线性关系，相关系数达0.999，扩增效率高。由此，可根据临床样品的Cq值，准确计算出待检样品的拷贝数。这些参数表明：该方法准确性和可靠性较高，适用于实际样品的定量分析。

2.3 特异性试验

采用已建立的eryA TaqMan单重荧光定量PCR检测方法，对7种相关细菌、7种病毒核酸以及Rev.1-∆eryA基因缺失株进行检测。每个样品设置2个重复，并设立阴性和布鲁氏菌缺失株的阳性对照。结果显示，除Rev.1-∆eryA布鲁氏菌核酸出现扩增曲线，且Ct值＜35外，其他病原菌和阴性对照均无特异性曲线，表明该方法对鉴别布鲁氏菌基因缺失株和其他布鲁氏菌毒株具有较强特异性（图4）。

2.4 敏感性试验

采用10倍梯度稀释的质粒标准品进行敏感性比较，结果显示荧光定量PCR能检出的最高稀释度为10^-7 copies/µL。表明该研究建立的荧光定量PCR方法敏感性较高。

2.5 重复性试验

利用10倍梯度稀释的质粒标准品作为模板，进行组内和组间的重复性试验，并利用公式计算变异系数，发现其组内和组间变异系数均小于2%（表4），说明该研究建立的方法具有较好的重复性。

3 讨论

布鲁氏菌病是常见的人兽共患传染病，流行范围广，生存能力强，给养殖企业带来巨大的经济损失。尤其是人布鲁氏菌病，其防治、检测及净化是现阶段密切关注的重要问题。布鲁氏菌菌种多，且基因组同源性较高，但不同菌株之间的毒力差异较显著，这给临床诊断和疫苗防治造成了不利影响，因此，探索对布鲁氏菌检测及疫苗的创新研究很有必要。赤藓糖醇基因作为布鲁氏菌的保守基因，与布鲁氏菌的毒力及致病机制相关^[8]。研究^[9]表明，赤藓糖醇基因有eryA、B、C、D 4个基因组，也是布鲁氏菌进行赤藓糖代谢的必要基因组成，eryA基因编码赤藓糖醇激酶，并在该基因的上游含有启动子，对赤藓糖醇的代谢起着重要作用，因此赤藓糖醇基因在布鲁氏菌的代谢过程中具有重要意义。在动物体内，母畜胎盘可产生赤藓糖醇，被布鲁氏菌利用，促进其生长^[10]。Keppie等^[11]在关于豚鼠感染布鲁氏菌病的相关研究中发现，当给豚鼠模型注射赤藓糖醇后，豚鼠感染的严重程度明显增加。作为一种四元醇，在生产中，赤藓糖醇多利用酵母发酵葡萄糖大量生产，可作为甜味剂等^[12]。

基因缺失疫苗的研制，仍然是布病疫苗未来发展的方向。目前，布鲁氏菌疫苗主要以减毒活疫苗为主，其大致分为2种，一种是光滑型，另一种是粗糙型。吴冬玲等^[13]以A19疫苗株为亲本，通过缺失virB12基因成功构建了A19-∆virB12基因缺失株，其免疫保护率能达到80%～100%，且能进行野毒株和疫苗株的鉴别诊断。M5-90∆26基因缺失株是对M5-90进行bp26基因缺失，皮下注射接种，种畜和妊娠期母畜禁用，也能进行野毒和疫苗株的鉴别诊断^[14]。BA0711株是缺失冷蛋白A构建的基因缺失株，可用于奶牛和羊的免疫^[15]。Rev.1是1953年Elbrg从链霉素依赖性羊种布鲁氏菌中分离出了链霉素不依赖性的突变体，该突变体不仅恢复了对链霉素的敏感性，而且毒力也有所下降^[16]。通过动物试验发现：Rev.1株在3个月内可以从羊和豚鼠体内清除，但其强毒性能广泛存在于动物的组织中；经免疫学和血清学研究发现，该疫苗可显著提高山羊对布鲁氏菌感染的抵抗力，免疫持续至少15个月，因此Rev.1作为疫苗株有良好的应用前景^[17]。Rev.1毒株是OIE推荐的羊种疫苗毒株，主要通过眼结膜接种方式进行接种，不同品种羊群免疫情况存在差异，2023年该疫苗在我国注册上市，但该疫苗仍不能区分野毒和疫苗株感染^[18]。

本研究根据前期构建的Rev.1-∆eryA缺失株，建立了布病的荧光定量PCR方法，用于缺失株与亲本株的鉴别，为前期基因缺失株的筛选奠定了基础；也能用于对缺失株及布鲁氏菌菌株进行诊断，为后续布病的净化提供一种时荧光定量PCR检测方法，该方法使用上述引物和探针、或检测试剂盒对布鲁氏菌进行非诊断用途的定性、定量检测，对于与其他菌株的对比鉴定将在后续研究中进行。

前期研究^19]已成功构建了Rev.1-∆eryA基因缺失株，建立了布病的荧光定量PCR检测方法，为疫苗株和野毒株的诊断鉴别提供了思路。本研究根据基因缺失株的建立方法，对Rev.1-∆eryA基因缺失株和布鲁氏菌其他菌株进行鉴别诊断，该方法主要是对基因缺失株进行鉴别诊断，使其应用范围有一定的局限性。因此，在后续研究中，可以建立多重荧光定量PCR方法，不仅能对缺失株进行鉴别诊断，也能对布鲁氏菌阳性样品进行鉴定，对阻断病原传播以及公共卫生安全有重要作用。

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