环介导等温扩增技术在牛病毒性腹泻检测中的应用

Application of loop mediated isothermal amplification in the detection of bovine viral diarrhea

摘要

[目的]基于环介导等温扩增（loop mediated isothermal amplification,LAMP）技术，研究1种快速、灵敏检测牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）检测方法，为牛病毒性腹泻的快速诊治提供参考。[方法]参考GenBank上BVDV序列，依据BVDV的结构蛋白5'-UTR保守序列设计出多组引物探针，从中优选出1组扩增效果最佳的引物探针，经过优化反应体系和退火温度，建立BVDV的环介导等温扩增技术（LAMP）检测方法。随后对该方法的敏感性、特异性进行了评估，并应用该检测方法进行临床样品检测。[结果]所建立的LAMP方法展现出高度特异性，仅对BVDV产生扩增信号，与牛常见病原（如口蹄疫、沙门氏菌等）无交叉反应；通过梯度稀释重组质粒验证，其检测灵敏度为102 copies/μL，较常规PCR提升10倍；临床样本检测结果与PCR法完全一致（符合率100%）。[结论]本研究建立的BVDV LAMP检测方法敏感性高、特异性强，适用于牛病毒性腹泻病的临床诊治。

关键词

牛病毒性腹泻病毒 / 环介导等温扩增技术 / 快速检测 / 临床诊治 / 应用

Key words

bovine viral diarrhea virus (BVDV) / loop-mediated isothermal amplification (LAMP) / rapid detection / clinical diagnosis and treatment / application

牛病毒性腹泻（bovine viral diarrhea, BVD）是一种高度传染性疾病，给全球养牛业带来了巨大的经济损失。牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）是BVD的病原体，属于黄病毒科的瘟病毒属^[1-2]，具有广泛的宿主范围，可感染各种物种，如牛、骆驼、猪、绵羊和鹿等^[3]。世界动物卫生组织（WOAH）将其列为法定报告病因，中国农业农村部将该病毒引起的牛病毒性腹泻列为三类动物疫病^[4]。该病毒在动物中引起急性、发热和高度接触性的传染病，临床上表现为严重腹泻、妊娠奶牛流产、生殖障碍和免疫功能障碍等症状^[4]。BVDV可感染各年龄段牛群，其中幼畜及妊娠母牛更易出现重症临床表现，主要是生殖能力下降。在缺乏能够完全治愈感染动物的治疗的情况下，BVDV的检测依赖于高度灵敏和选择性的诊断方法。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是Notomi于2000年开发的一种快速恒温核酸扩增技术^[5]。LAMP技术基于Bst DNA聚合酶的链置换活性，通过设计3对特异性引物（包括F3/B3、FIP/BIP及环引物LF/LB），靶向基因组的6个保守区域，在恒温条件下（通常60~65 ℃）实现核酸的高效扩增，无需热循环仪辅助。该方法在等温条件下以高特异性和高效率扩增DNA；该方法的优势还在于快速，该目标序列可以在1 h内扩增完成。此外，LAMP分析设备操作简单、体积小且便于携带，可以随时在现场使用。目前，LAMP检测方法已广泛用于检测食品和动物疫病临床样本中的病原体^[6-7]。

BVDV是1种单股正链RNA病毒，病毒形态类似球形，病毒大小在20~60 nm，基因组约为12.3 kb^[4]。传统的BVDV检测方法主要依赖ELISA、RT-PCR等，但成本高、费时费力，且基于血清学的检测结果判断BVDV流行具有一定偏差^[8]。因此，本研究基于BVDV保守区段设计了特异性引物，并通过对各反应条件的优化建立BVDV的LAMP检测方法，使其具有特异性，与牛其他常见病原无交叉反应，同时与常规PCR在灵敏度和临床样本的检出符合率方面进行比较研究，旨在为临床BVDV感染的诊断提供1种更快速、成本低廉的检测方法，强化肉牛临床诊断与防控效能。

1 材料与方法

1.1 病毒及基因组

BVDV分离株及含目的基因的BVDV克隆菌株pMD18-BVDV-5'-UTR，均由本实验室保存；口蹄疫O型(FMDV-O)、牛轮状病毒(BRV)、牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、牛白血病病毒(BLV)、沙门氏菌、巴氏杆菌、C型产气荚膜梭菌核酸模板由本实验室保存。

1.2 主要试剂与设备

所用LAMP反应试剂（Bst 3.0 DNA Polymerase）购自New England Biolabs（NEB, USA）；酶预混液（DNA反应液）及DNA Marker分别购自康为世纪（中国北京）和诺唯赞公司（中国南京）。

恒温扩增仪（GeneAMP^® LAMP System）由汉唐基因（中国武汉）提供；高速冷冻离心机（Centrifuge 5425R）及组织裂解系统（DS1000）分别购自Eppendorf（德国）和武汉新纵科生物技术有限公司。

1.3 BVDV引物设计

BVDV的基因组包含1个开放阅读框（ORF），该开放阅读框编码4种结构蛋白和8种非结构蛋白^[4]。根据Genebank上已公开的牛病毒性腹泻病毒基因组序列，经比对后选取高度同源的基因组序列，以多个BVDV毒株同源的基因序列817～1 651 bp位的834个核苷酸序列为靶区域设计特异性的LAMP引物组，共设计得到3个不同的引物组，每个引物组分别包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，各引物的核苷酸序列如表1所示。

参考已有的GenBank序列，比如BVDV-1 NADL株（NC_001461）和BVDV-2 890株（U18059），确定这些区域的具体位置，并确保引物设计在这些保守位点上。同时，使用Primer Explorer等工具验证引物的特异性和形成二级结构的可能性。另外，考虑到需要确保新的候选引物与之前的引物组不重叠，或者覆盖不同的保守区域，从而提供更多的验证选项。例如，在5'-UTR中，IRES区域可能有多个高度保守的位点，可以设计多组引物。在生成候选引物时，需要检查每个引物的T _m值是否适合LAMP反应（通常在60~65 ℃之间），并确保引物之间的互补性不会导致引物二聚体。同时，环引物（LF和LB）的存在可以加速反应，但并非必需，本试验可能需要选择是否包含这些环引物。

1.4 LAMP反应条件的优化

根据NEB公司Bst 3.0 DNA Polymerase(M0374S）说明书推荐的LAMP反应体系设置初始试验参数，进行3组引物的筛选。反应程序为65 ℃ 60 min，80 ℃灭活10 min。

采用单因素变量法依次优化Mg²⁺浓度（0.5~3.5 μL）、甜菜碱添加量（3.0~6.0 μL）等关键组分，每确定1个最优条件，便对体系中相应的条件进行替换，以最终确定最佳的反应体系。

1.5 LAMP引物特异性试验

使用建立的LAMP方法分别对引起牛常见病原巴氏杆菌、C型产气荚膜梭菌、D型产气荚膜梭菌以及口蹄疫O型(FMDV-O)、牛白血病病毒(BLV)、牛传染性鼻气管炎(BoHV-1)、牛结节性皮肤病病毒(LSDV)核酸模板进行检测，分析本研究建立的RT-LAMP方法的特异性。

1.6 LAMP灵敏度检测试验

牛病毒性腹泻病毒靶基因克隆的质粒DNA，测定其浓度，并根据质粒基因组大小，计算得到其拷贝数，用ddH₂O进行10倍的梯度稀释，分别稀释至10⁵、10⁴、10³和10² copies/μL浓度，以不同浓度的质粒DNA为样本分别做LAMP试验和PCR试验，比较其灵敏度。

1.7 临床样本检测

选用临床PCR检测阳性的样品，具体包括来自肝脏、脾脏、肾脏、血清、精液和胚胎组织的样品再采用本研究建立的LAMP方法对临床测试样品进行检测，进行临床样品检测，以评估本研究建立的LAMP方法针对临床样品的检测情况。

2 结果与分析

2.1 BVDV引物筛选

本研究针对BVDV 5'-UTR基因的3套候选LAMP引物和探针设计，基于不同保守区域优化，供验证试验选择。以初始体系进行LAMP扩增反应，反应程序为60 ℃、30 min。3组阴性对照均无扩增产物，阳性对照均出现标准LAMP扩增反应梯型条带，而引物组1的阳性对照扩增效果更好（表2），故选取引物组1作为最佳反应引物组进行后续试验。

2.2 LAMP反应条件的优化

在体系优化试验中，25 μL反应混合液分别在56、60、62和65 ℃的温度条件下反应30 min，每1 min采集1次FAM通道荧光信号，共30个循环。由表3可知，当T _m值为56 ℃时，获得的荧光信号强度最高，因此优选56 ℃。

25 μL反应混合液中分别加入3.0、4.0、5.0和6.0 μL浓度为5 μmol/L的甜菜碱，进行扩增。由表3可知，当加入3.0 μL浓度为5 μmol/L的甜菜碱，获得的荧光信号强度最高.因此，优选加入3.0 μL浓度为5 μmol/L的甜菜碱。

25 μL反应体系中分别加入0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50和2.00 μL浓度为10 μmol/L的正反向外引物（外引物F3和外引物B3）进行反应。由表3可知，当加入1.0 μL浓度为10 μmol/L的正反向外引物时，获得的荧光信号强度最高。

分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 μL浓度为10 μmol/L的正反向内引物（内引物FIP和内引物BIP）进行反应。由表3可知，当加入3.0 μL浓度为10 μmol/L的正反向内引物时，获得的荧光信号强度最高。

分别加入0、0.5、1.0、1.5和2.0 μL浓度为10 μmol/L的正反向环引物（环引物LF和环引物LB），当加入1.0 μL浓度为10 μmol/L的正反向环引物时，获得的荧光信号强度最高（表3）。

25 μL反应体系中分别加入0.5、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 μL浓度为25 mmol/L的MgCl₂进行反应，当加入2.5 μL浓度为25 mmol/的MgCl₂时，获得的荧光信号强度最高（表3）。

分别加入2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 μL浓度为10 μmol/L dNTP进行反应，当加入3.0 μL浓度为10 μmol/L dNTP时，获得的荧光信号强度最高（表3）。

分别加入0.25、0.50、0.75、1.00和1.20 μL浓度为8 U/μL的Bst DNA Polymerase酶进行反应，当加入1.00 μL浓度为8 U/μL的Bst DNA 聚合酶时，获得的荧光信号强度最高（表3）。

因此，最终优化确定的25 μL反应体系为：甜菜碱 3.0 μL，F3/B3 1.0 μL，FIP/BIP 3.0 μL，LF/LB 1.0 μL，MgCl₂ 2.5 μL，dNTP 3.0 μL，Bst DNA Polymerase 1.0 μL，模板2.0 μL，无核酸酶水补至25 μL，反应程序为：56 ℃ 30 min。

2.3 LAMP引物检测特异性结果

使用经过条件优化后的LAMP体系分别以BVDV、口蹄疫O型(FMDV-O)、牛轮状病毒(BRV)、牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、沙门氏菌、巴氏杆菌、C型产气荚膜梭菌核酸为模板进行扩增。结果显示，牛病毒性腹泻病毒环介导等温扩增引物组能够特异性扩增牛病毒性腹泻病毒模板，快速完成牛病毒性腹泻病毒靶区域的高效扩增，而无法对其他病毒进行特异性扩增（表4）。

2.4 LAMP灵敏度

将10倍梯度稀释后的BVDV 模板分别使用PCR和LAMP进行检测。如表5所示，LAMP法可稳定检测至10² copies/µL的BVDV重组质粒，而常规PCR的检测下限为10³ copies/µL（图1），表明LAMP的灵敏度较PCR提升了1个数量级。

2.5 临床检测结果

选用临床PCR检测阳性的样品，具体包括来自心脏、肝脏、脾脏、肾脏组织等样品进行检测，如图2所示，编号2~7样本的LAMP反应结果均显示出现T _t值（小于25），且出现典型的扩增曲线，均为阳性；与临床PCR检测结果一致，准确率为100%。

3 讨论

BVDV是1种世界范围内的严重影响养牛业的“重要病原体”^[9]。1项针对欧洲地区牧场调查的结果显示，在有记录的动物疫情中，BVD所占比例达到5%~6%^[10]，这表明了该病毒感染在全球畜牧业中的普遍性，给养殖业带来了巨大的经济损失，凸显开发快速诊断技术的紧迫性。目前常用的检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、RT-PCR等，这些方法虽然具有较高的敏感性和特异性，但通常需要昂贵设备且操作复杂、耗时长^[11]。随着对BVD认识加深和技术发展，LAMP作为1种恒温核酸扩增技术逐渐受到关注，可以在特定温度下实现DNA的大片段高效扩增。相对于传统的PCR方法，其操作更为简便并且对设备要求较低，在现场使用时具有更高的灵活性。

近年来的研究表明，基于LAMP的分子生物学诊断方法已经成功应用于多种重要动物疫病的诊断当中，这些方法被证实非常敏感而且能在短时间内得出结论。李家伟等^[12]成功地利用LAMP方法检测了BVDV感染，研究结果显示这种方法可以有效替代传统的PCR技术。本研究结果表明，LAMP方法灵敏度（10² copies/µL）优于常规PCR法（10³ copies/µL），这可能与引物设计策略及反应体系优化有关。相较于传统实验室诊断手段需要昂贵仪器与长时间等待结果，LAMP更适合于养殖业者日常监测与早期干预的需求，不仅可以及时控制病毒扩散，还可以降低治疗成本，提高经济效益。

本研究针对BVDV基因组中具有高度保守的5'-UTR区域设计引物，通过多序列比对排除了单核苷酸多态性（SNP）及高频突变位点，确保引物组在病毒不同基因型（如BVDV-1和BVDV-2）中均具有广谱识别能力，这一策略显著提升了方法的敏感性，适用于复杂临床样本中低载量病毒的检测。本试验选择6个区域：F3、B3、FIP、BIP，还包括LF和LB环引物；确保这些区域的核苷酸GC含量合适，避免产生二级结构，同时满足LAMP反应的温度要求（通常60~65 ℃）。通过分析现有文献资料及案例研究^[12]，根据该疾病的流行情况、病原学特点，对于复杂的多病毒性疾病——牛病毒性腹泻，采用先进的LAMP技术能够有效提升检出速度和准确性，有利于实现肉牛养殖的实时监控和精准防治。

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基金资助

第二批国家级职业教育教师教学创新团队专业领域课题研究项目(ZI2021100108)

2020年度湖北省职业技术教育学会科学研究重点课题(ZJGA202045)