GH基因在贵州从江香猪不同器官和组织中的表达水平研究

Expression level of the GH gene in different organs/tissues of Congjiang Xiang pigs from Guizhou Province

摘要

目的 为解决贵州从江香猪生长性能低、繁殖能力薄弱等问题，合理保护、开发利用优质种质资源。 方法 选取6头1岁左右、体况相近（体重50 kg左右）的贵州从江香猪，分别采集肺、心脏、脾脏、胃、肾脏、肝脏、大肠、脂肪组织、小肠以及背最长肌等组织器官样品并提取总RNA。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，测定GH基因在的相对表达量。 结果 GH基因在贵州从江香猪检测的所有器官和组织中均有表达，在肝脏的表达水平最高，其次为小肠，且这2个组织中的表达量显著高于其他组织；而背最长肌、肾脏、肺脏、脾脏的表达量显著高于心脏、脂肪、大肠和胃。 结论 GH基因在从江香猪的不同器官和组织中的表达量存在一定差异，未来应进一步研究GH基因在缩短育种时长、优化家畜品种遗传特性方面的作用机制。

Abstract

Objectives The problems of low growth performance and weak reproductive ability of Congjiang Xiang pigs from Guizhou Province were solved to reasonably protect, develop and utilize germplasm resources with high-quality. Methods 6 Congjiang Xiang pigs from Guizhou Province around 1 year old with similar physical condition( body weight of about 50 kg) were used to extract total RNA from the lungs, heart, spleen, stomach, kidneys, liver, large intestine, adipose tissue, small intestine, and longissimus dorsi muscle. The real-time quantitative PCR technology was used to determine the relative expression levels of the GH gene in these different tissues and organs. Results The GH gene was expressed in all tested organs and tissues of Congjiang Xiang pigs, with the highest level of expression in the liver, followed by in the small intestine. The level of expression in these two tissues was significantly higher than that in other tissues(P<0.05). The level of expression in the longissimus dorsi muscle, kidneys, lungs, and spleen were significantly higher than that in the heart, fat, large intestine, and stomach (P<0.05). Conclusions There were certain differences in the expression level of the GH gene in different organs and tissues of Congjiang Xiang pigs, and the mechanism of the GH gene in shortening the breeding period and optimizing the genetic characteristics should be further studied.

Graphical abstract

关键词

从江香猪 / GH基因 / 表达水平 / 器官 / 组织 / 基因调控

Key words

Congjiang Xiang pigs / GH gene / expression level / organs / tissues / gene regulation

从江香猪（Sus scrofa）是贵州省黔东南州从江县特有的地方猪种资源，获得全国农产品地理标志，具有肉质香嫩、体型小、性成熟早等特点^[1]，但其生长迟缓、生产性能无法满足高效发展的需求，短期内使从江香猪得到快速的遗传增益是当下亟需解决的问题之一。

目前，越来越多的学者利用基因组与生产性能的关联性来取得快速的遗传增益。生长激素（GH）是由脑垂体前叶合成并分泌的1种蛋白质类激素，其作为动物生长与繁殖过程中的1个关键生理调节因子，发挥着促进新陈代谢、加速生长发育以及增强免疫功能等多种重要的生物学作用，尤其是对肌肉和骨骼等组织细胞的增殖、分化具有显著作用^[2]。此外，GH基因通过编码低分子质量多肽调控细胞增殖与胚胎发育进程，并在机体生长、发育及代谢稳态的维持中发挥着核心调控作用^[3]。

近年来，关于GH基因调控猪、羊、马等动物生长发育的研究已成为热点。如袁建等^[4]研究了藏姜杂交母猪摘除卵巢后GH的变化量，发现GH表达水平先降后升。宋海燕等^[5]对GH基因在蒙古马多种组织中的表达水平存在显著差异。GH基因被广泛运用于探究不同牛品种间的基因多态性、生产性能的关联性研究。但目前关于GH基因在贵州从江香猪不同器官或组织中表达情况的相关报道较为匮乏。因此，本研究对从江香猪不同器官及组织中的GH基因表达水平进行测定，旨在为从江香猪的分子育种工作提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

采样动物来自贵州大学的香猪育种场，选取6头（3头公猪，3头母猪）1岁左右的体况相近（体重50 kg左右）的贵州从江香猪，并分2次进行屠宰，分别肺、心脏、脾脏、胃、肾脏、肝脏、大肠、脂肪组织、小肠以及背最长肌组织等的样本。

1.2 主要试剂

dNTP Mix、DTT 0.1 mol/L、HiFiScript、RNA模板、Gold View Ⅰ型核酸染料试剂、TAE、ddH₂O、琼脂粉、PCR Master Mix、cDNA等。

1.3 试验仪器

PCR仪、凝胶成像仪、微波炉、离心机、qRT-PCR仪、凝胶电泳仪、超微量紫外分光光度计、移液枪等。

1.4 引物设计

以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参基因，利用Primer 5.0和Oligo软件，分别设计上游引物（序列为5′-3′GCTTTCGCCCTGCTCTG）和下游引物（序列为5′-3′AAACTCCTTGTAGGTGTCGG），并送上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.5 总RNA提取

利用Trizol法^[5]分别提取从江香猪各组织样品的RNA，采用1% DEPC处理水配制的电泳缓冲液和琼脂糖凝胶电泳的测定方法。先从提取的总RNA中吸取2 µL样本，使用超微量紫外分光光度计来测定RNA的浓度，同时记录OD_{260 nm}/OD_{230 nm}和OD_{260 nm}/OD_{280 nm}的比值，以此来评估RNA的纯度，并记录下总RNA的浓度值，最后将提取的总RNA调节至相同浓度，存于-80 ℃冰柜，备用。

1.6 cDNA的合成

准备20 µL RNA反转录反应体系时，先将RNA模板、Primer Mix、DTT、RT Buffer、HiFiScript以及RNase-Free Water这些组分溶解，并放置于冰上,备用。RNA 20 µL反应体系如下：4 µL 2.5 mmol/L的dNTP Mix（最终浓度500 μmol/L），2 µL Primer Mix，1 µL RNA模板（最终含量50 pg~5 µg），4 µL 5× Fast RT Buffer（最终比例1×），2 µL 0.1 mmol/L的DTT（最终浓度10 mmol/L），1 µL 200 U/µL HiFiScript，最后用6 µL RNase-Free Water补足总体积。

1.7 PCR扩增

PCR扩增体系的制备：将cDNA模板、dNTP Mix、ddH₂O、上下游引物溶解，置于冰上备用。PCR 20 µL反应体系的制备：1 µL上游引物、1 µL下游引物、1 µL cDNA模板、10 µL dNTP Mix、7 µL ddH₂O，加样后进行旋涡振荡，短暂离心；放在多任务模式梯度PCR相应位置，设定相应的反应程序进行反应。PCR反应程序如下：首先在95℃下进行3min预变性处理，随后进入循环阶段，95 ℃变性30 s、52.7 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，最后72 ℃反应7 min，反应完成将反应物置于4 ℃冰箱中，备用。

1.8 qRT-PCR反应体系

qRT-PCR 10 µL反应体系：EvaGreen Super Mix 5 µL、ddH₂O 3 µL、cDNA模板1 µL(将逆转录的cDNA稀释2倍)、上游引物0.5 µL、下游引物0.5 µL，在暗室条件下，按照上述反应体系加样，进行离心。采用SYBR Green荧光染料技术，在荧光定量PCR仪器上执行qRT-PCR反应。首先在95 ℃下进行5 min的预变性处理，随后进入循环阶段，95 ℃变性45 s、52.7 ℃退火40 s、72 ℃延伸45 s，并在延伸步骤结束后收集荧光信号，40次循环结束后，进行熔解曲线分析。该过程始于95 ℃维持10 s，之后60 ℃维持15 s，再以每10 s升温0.5 ℃的速度，从60 ℃逐步升温至95 ℃。

1.9 数据分析

利用SPSS软件对所有数据进行处理，采用单因素方差分析（ANOVA）比较各组的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 荧光定量PCR产物的特异性分析

选择GAPDH作为内部参照基因，运用qRT-PCR技术获取GH基因的熔解曲线。结果显示：GH目标基因与内参基因GAPDH的扩增曲线均展现出清晰的拐点、较高的斜率以及典型的S型曲线，这标志着良好的曲线平滑度和高效的扩增反应；同时，两者的熔解曲线皆呈现出为光滑的单峰形态，且在T_m温度附近并未观察到有明显的杂峰，这证明引物的高特异性和良好的重复性，几乎不存在引物二聚体产物的干扰，适用于后续的试验步骤。此外，GH基因的熔解温度确定为83 ℃（图1、图2）。

2.2 PCR扩增结果

所有样品的总RNA进行逆转录，然后使用逆转录得到的产物作为模板。采用PCR扩增6头从江香猪不同组织中的GH基因119～486 bp片段，用1%琼脂糖凝胶电泳检测观察，在香猪的肺、肾脏、肝脏、脾脏、小肠和背最长肌观察到与预期片段大小一致的清晰单一扩增条带，且未见显著杂带，这表明逆转录所得的cDNA质量较好，未受污染（图3）。

2.3 GH基因在不同组织的表达水平分析

由图4可见，在从江香猪的各个检测组织和器官中，GH基因均有表达。其中，肝脏的GH基因表达量最高，小肠位居第二，肝脏和小肠的表达量明显高于心脏、大肠等其他8个器官。相比之下，背最长肌、肾脏、肺脏和脾脏的表达量也相对较高，显著高于心脏、脂肪、大肠和胃的表达水平。

3 讨 论

GH基因的结构由5个内含子和5个外显子组成，总长度约为1 800 bp。GH是一种由脑垂体前叶的嗜酸性细胞分泌的肽链激素，由191个氨基酸残基构成，具有广泛的生物学活性，能够影响几乎所有类型组织和细胞的功能。除此之外，GH在组织生长发育、脂肪代谢调控以及生殖特性方面，如提升排卵效率、增强受精能力和优化胚胎质量等，均发挥着不可或缺的作用^[2]。在动物出生前，GH基因就已开始发挥核心作用，对细胞分裂、生长进程以及软骨的形成具有重要影响^[6]。

闫云峰等^[7]的研究显示，萨福克羊的GH基因与IGF-1基因在生长发育、免疫功能和繁殖性能方面具有显著影响。此外，Komy等^[8]的研究表明，在3月龄时，埃及水牛肌肉中GH基因的表达量高于1岁时，且随着年龄增长，其表达水平逐渐下降。这提示GH基因在幼年期的表达非常活跃，对机体的器官和肌肉组织的生长起到积极的促进作用。GH基因不仅通过产生GH来促进生长和发育，还能加速蛋白质合成，增加胶原组织的含量，并促进软骨细胞的增殖，从而提高软骨的生长速率。

本研究结果显示，在从江香猪的各器官/组织中皆有GH基因表达，其中在肝脏中的表达水平最高，小肠次之，且这2个组织中的GH基因表达量相较于其他组织显著增高；而背最长肌、肾脏、肺、脾脏的表达量又显著高于心脏、脂肪、大肠、胃。GH基因在肝脏中表达较高，说明在从江香猪1岁时其对心脏循环的发育起着关键的调节作用。这可能与动物日龄相关，徐金先等^[9]研究发现在180日龄后，GH基因在大白猪与二花脸猪垂体中的表达量显著下降。杨博璇等^[10]研究发现，GH基因在牦牛肝脏和心脏上也有着较高的表达量，但随着年龄的增长，表达量在逐渐降低。此外，傅芳等^[11]研究发现，GH基因在0.5~1.5岁龄牦牛群肌肉中的表达量较高，而在其他年龄段的表达相对较低。

综上，随着年龄的增长，GH基因表达量会到达峰值，后面阶段对动物生长发育的作用会减弱，而在不同器官/组织中的表达量又存在差异。因此，在应用GH基因促进家畜生长发育时，需要综合考虑上述因素。本研究表明在从江香猪的各器官和组织中均有GH基因表达，但不同的组织、器官之间表达量存在一定差异，在肝脏中的表达量最高，其次为小肠。未来可进一步深入探索GH基因在缩短育种时长、优化家畜品种遗传特性方面的作用机制。

参考文献

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[11] 傅芳,王利,字向东.麦洼牦牛不同生长阶段肝脏差异表达基因分析[J].兽类学报,2022,42(1):85-94.