1例疑似猪伪狂犬病病毒疫苗引起免疫耐受的病例分析

Analyzing a suspected immunological tolerance caused by porcine pseudorabies virus vaccine

摘要

目的 贵州省某生猪养殖场猪群经过多次伪狂犬病病毒疫苗免疫，但抗体阳性率为0，为确定导致该猪场猪群伪狂犬病病毒抗体水平急剧下降的关键因素。 方法 2023年，采集该养殖场猪群血液样本10份，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和聚合酶链反应（PCR）扩增技术进行检测，并进行流行病学调查等。 结果 ELISA和病原学检测结果显示，PRV-gB和PRV-gE抗体为阴性，PRV-gD基因PCR检测为阳性，gE全基因检测呈阴性；现场调研发现疫苗质量标准、免疫剂量合理，饲养环境清洁，猪场兽药和饲养管理规范，猪群未表现出任何猪伪狂犬病的临床症状，但对伪狂犬病病毒疫苗进行高频率、高密度免疫；猪只外周血淋巴细胞的增殖活性较低，细胞因子如干扰素－γ、白细胞介素-2等的分泌量也显著减少，且该猪群其他疫苗免疫抗体水平正常。 结论 综合分析T细胞反应弱、调节性T细胞增多，但其他疫苗抗体水平正常等指标发现猪群PRV-gB和PRV-gE抗体水平低可能与猪场高密度免疫，引发猪群的伪狂犬病病毒免疫耐受有关。

Abstract

Objectives The key factors causing a dramatic decrease in the level of pseudorabies virus (PRV) antibodies in pig herds at a pig farm in Guizhou Province underwent multiple immunizations against PRV but exhibited the antibody positivity rate of 0 were identified. Methods The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and polymerase chain reaction (PCR) amplification techniques were used to detect the 10 blood samples collected from the pig population of the farm in 2023. Epidemiological investigations were subsequently conducted. Results The results of ELISA and etiological analyses showed that antibody against PRV gB and PRV gE was negative. The results of PCR detection showed that antibody against PRV gD was positive. The results of detecting the full-length of gene showed that antibody against PRV gE was negative. On-site investigations confirmed compliance with vaccine quality standards, appropriate immunization dosages, hygienic rearing conditions, standardized veterinary drug usage, and proper husbandry management in the pig farm. had No clinical symptoms of porcine pseudorabies were observed in pig herds, but high-frequency and high-density immunizations against PRV pseudorabies virus were conducted. The proliferative activity of peripheral blood lymphocytes in pigs was low, and the secretion of cytokines including interferon-γ and interleukin-2 was significantly reduced. The levels of antibody for other vaccines in this pig herds were normal. Conclusions The results of comprehensively analyzing indexes including weakened T-cell responses, increased regulatory T-cells, and normal antibody levels for other vaccines showed that the low titer of PRV-gB and PRV-gE antibody in pig herds may be related to high-density immunity in pig farms, leading to the immunological tolerance of pseudorabies virus in pig herds.

Graphical abstract

关键词

猪伪狂犬病 / 伪狂犬病病毒 / ELISA / 免疫耐受 / 流行病学调查 / PCR扩增检测

Key words

Porcine pseudorabies / pseudorabies virus (PRV) / enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / immunological tolerance / epidemiological investigation / polymerase chain reaction (PCR)

猪伪狂犬病（porcine pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起人或动物的一种急性传染病，成年猪呈隐性感染，常伴有上呼吸道卡他性症状；妊娠母猪发生流产、死胎及呼吸系统症状，无奇痒症状；哺乳仔猪表现神经症状和败血症症状，最后死亡；该病也可以发生于其他家畜和野生动物^[1]。1902年，Aujeszky等在匈牙利首次证实该病原由PRV引起^[2]，1947年猪伪狂犬病传入我国^[3]，贵州省于1962年报道分离到PRV^[4]，尽管伪狂犬病（PR）在我国属于动物三类传染病，且未被列入我国人畜共患传染病目录，其对公共卫生安全的威胁程度尚无明确结论，然而鉴于多例PRV感染导致人患脑炎的病例，证实了人类确实能够感染PRV^[5]。PRV已对全球养猪业造成严重危害，由于其传播途径极为广泛，该病长时间肆虐，且当前还没有特效治疗药物，疫苗免疫便成为预防与控制猪伪狂犬病最为有效的手段^[6]。然而，在错综复杂的自然环境以及养殖条件下，以往的动物疫病防治方法已无法妥善应对多样化的疫病形势。部分家养动物免疫力每况愈下，免疫失败的现象愈发频繁，极易引发大规模的疫情扩散。因此，加深对动物疫病的认知，并剖析免疫失败（immunological failure）的根源，已是当务之急。某猪场猪群为外购育肥猪，猪群购进时PRV抗体阳性率尚符合国家规定的群体阳性率标准，但之后抗体水平降至0。本研究采集了猪群血液样本，运用ELISA、PCR等检测技术，对猪群的特异性抗体和病原进行了分析；同时，综合多方面的检测结果与调查分析，初步确定该猪场猪群PRV抗体水平急剧下降与免疫耐受相关，为后续制定科学合理的防控策略提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料及主要试剂

随机采集某猪场育肥猪最后1次免疫后第3周的血样10份（两两混合成5份，编为①、②、③、④和⑤号）。购买武汉科前生产的猪伪狂犬病毒gB和gE蛋白ELISA抗体检测试剂盒，TaKaRa MinBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.5.0核酸提取试剂盒。参照GenBank中公布的PRV序列设计扩增PRV-gE全基因组和PRV-gD保守系列的特异性引物并委托宝生物工程（大连）有限公司合成，预扩增片段依次为1 700、340 bp。

1.2 流行病学调查

对猪群的饲养环境展开全面检查，涵盖饲料质量的优劣、水源卫生是否达标、圈舍通风状况以及清洁程度等方面，以此来评定环境因素给猪只免疫系统带来的潜在影响；针对猪群的疫苗接种程序及其实际执行状况进行探究，回溯疫苗的来源渠道、所属批次、储存环境条件，调研接种剂量是否精准、接种方式是否正确等情况，从而排除其他有碍于PRV抗体生成或者致使抗体水平降低的因素。

1.3 酶联免疫吸附测定

将①、②、③、④和⑤号全血分别离心取血清，应用武汉科前生产的相应ELISA抗体检测试剂盒进行PRV-gB和PRV-gE抗体检测。

1.4 聚合酶链式反应扩增检测

用TaKaRa MinBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.5.0核酸提取试剂盒提取①、②、③、④和⑤号血清核酸，用PRV-gD特异性引物（扩增片段在gD全基因的区域）和PRV-gE全基因特异性引物，运用PCR扩增技术，对样品进行PRV病原检测，并均设有阳性和阴性对照。

gD、gE基因PCR扩增采用50.0 μL体系：dNTP 8.0 μL、2×GC buffer Ⅱ 25.0 μL、上下游引物各4.0 μL、LA Taq酶0.5 μL、DNA模板8.5 μL。反应条件：96 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，退火（gD基因57 ℃、gE基因58.5 ℃）1 min，72 ℃ 2 min，38个循环。反应结束后，分别取5 μL PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳中检测，并记录结果。将PCR扩增产物进行胶回收后，进行基因测序和比对分析。

2 结果与分析

2.1 疾病流行情况

经调查，该猪场共有育肥猪30头，猪群（日龄90 d左右）为外购，原种猪场母猪按照规范的免疫程序对PRV进行免疫，猪群购进时PRV抗体阳性率尚符合国家规定的群体阳性率标准。引进后10 d进行PRV Bartha-K61弱毒疫苗免疫，120日龄左右时监测抗体，PRV-gB和PRV-gE抗体水平下降至0，故用PRV Bartha-K61灭活疫苗再次进行免疫；142日龄左右再次进行抗体检测，结果仍为0。同时，经委托其他机构检测，猪只外周血淋巴细胞的增殖活性较低，细胞因子如干扰素-γ、白细胞介素-2等的分泌量也显著减少，且据猪场技术人员描述，在饲养过程中其他疫苗免疫抗体水平处于正常范围。PRV疫苗生产厂家正规，同批次疫苗的质量差异不大，也符合质量标准要求。该猪场防疫人员具有丰富的临床经验，排除在免疫时接种针过短或打飞针等导致免疫剂量不足、注射部位掌握不准确等可能。猪群饲养密度小、环境卫生清洁，饲料质量严格控制，营养物质均衡，规范使用抗病毒和抗菌药物，不存在抗生素的滥用、乱用等情况。该猪场的猪群未表现出任何关于PR的相关临床症状。

2.2 ELISA检测结果

鉴于送检猪群曾反复免疫过PRV疫苗，且之前多次抽样进行抗体检测均为阴性，故将①、②、③、④和⑤号全血分别离心取血清进行PRV-gB和PRV-gE抗体检测。检测结果（表1）显示，5份血清中PRV-gB和gE抗体均呈阴性，表明猪体内PRV免疫效果差，疫苗免疫失败。

2.3 PCL扩增结果

检测结果（图1）显示，用PRV-gD基因特异性引物检测到PRV-gD均呈阳性，阴阳对照均成立，表明猪群血液中存在PRV基因或病毒。

为确诊血样中PRV是野毒还是疫苗毒，对混合血清进行PRV的gE全基因PCR扩增检测，结果显示（图2），PRV-gE全基因检测呈阴性，阴、阳性对照成立。由于该猪场的猪群未表现出任何关于PR的相关临床症状，且将PCR PRV-gD扩增产物进行胶回收后，进行基因测序，得到序列为：TTATCGAGTACGCCGACTGCGACCCCAGGCAGATCTTTGGGCGCTGCCGGCGCCGCACCACGCCGATGTGGTGGACCCCGTCCGCGGACTACATGTTCCCCACGGAGGACGAGCTGGGGCTGCTCATGGTGGCTCCGGGGCGGTTCAACGAGGGCCAGTACCGGCGCCTGGTGTCCGTCGACGGCGTGAACATCCTCACCGACTTCATGGTGGCGCTCCCCGAGGGGCAAGAGTGCCCGTTCGCCCGCGTGGACCAGCACCGCACGTACAAGTTCGGCGCGTGCTGGAACGACGAGAGCTTCAGGCGGGGCGTGGACGTGATGCGATTCCTGACGCCGTTCTA。测序比对结果显示，所获得的PRV-gD基因与Bartha-K61等毒株的gD基因一致。说明样品中的PRV为gE缺失的毒株，系疫苗病毒。

3 讨 论

免疫耐受（immunological tolerance）是机体免疫系统接触某一抗原后形成的特异性无应答状态，是免疫应答的一种重要类型^[7]。免疫耐受有生理性和病理性2种表现形式，根据免疫耐受形成机制不同，又可以分为中枢免疫耐受和外周免疫耐受。与临床疾病密切相关的免疫耐受更多地涉及外周免疫耐受的形成、维持及打破机制，因而外周免疫耐受在当今人类医学上是免疫耐受研究领域的重点。免疫耐受性尽管在某种程度上有助于防范自身免疫疾病，对提升器官移植、胚胎移植的成功率有所裨益，然而这也伴随着若干潜在的不良作用与风险，诸如削弱机体抗感染的能力、助力肿瘤的滋生蔓延以及干扰器官移植成效等状况。同时，免疫耐受可以引起免疫失败，致使免疫调节机制失衡^[8]。免疫耐受形成过程中，频繁接种疫苗导致抗原持续刺激，可能激活调节性T细胞，抑制B细胞分化和抗体产生。研究表明，长期或过量抗原暴露可诱导外周耐受，表现为特异性抗体水平下降甚至无法检出^[9]。在国内，对猪群高密度免疫PRV疫苗，引发猪群的免疫耐受的情况鲜有报道。

本研究中血清样品的病原学检测结果显示存在PRV，然而猪群的PRV-gB及gE抗体阳性率均为0%，该猪场的猪群未表现出任何关于PR的相关临床症状。综合分析，检测出的PRV系gE缺失毒株，猪群PRV抗体持续阴性的原因可能与猪场高密度免疫有一定关系，进而引发的猪群免疫耐受。高密度地注射疫苗可能会对免疫系统产生负面影响，首先是增加免疫应激，频繁的疫苗接种可能会增加动物的免疫应激，导致免疫力下降。其次，干扰免疫反应，不同疫苗之间可能存在相互干扰，影响免疫反应的效果。此外，还会增加疫病风险。操作过程中的不当行为，如不规范的注射技术，可能会增加疫病暴发的概率。因此，在制定疫苗接种计划时，应考虑到疫苗的种类、免疫间隔、动物的免疫状态等因素，以科学合理的方式进行疫苗接种。总之，该猪场猪群经过多次PRV疫苗免疫，但抗体持续为阴性，初步推测为PRV疫苗进行高频率、高密度免疫引发了猪群的免疫耐受，进而导致PRV免疫失败。

参考文献

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