茜草素对鸭肠炎病毒体外复制的影响

Effects of Alizarin on the in vitro replication of duck enteritis virus

摘要

目的 探究中药活性成分茜草素对鸭肠炎病毒（DEV）体外复制的抑制作用，缓解当前养殖业中DEV引发的高死亡率、抗生素滥用及耐药性等问题，提供安全、天然的“替抗”候选药物。 方法 试验通过设空白对照组（A组）、茜草素对照组（B组）、DEV感染组（D组）和茜草素干预组（E组）分别处理鸭胚成纤维细胞（DEF）后，测定DEV的半数组织细胞感染剂量（TCID₅₀），利用CCK-8法确定茜草素的最大安全浓度（TC₀），并通过细胞病变观察（CPE）和荧光定量PCR（q-PCR）技术分析茜草素对DEV增殖的抑制作用。 结果 DEV⁃GZ贵州分离株TCID₅₀为3.98×10^-5/0.1 mL；茜草素TC₀为0.05 mg/mL；空白对照组和茜草素对照组无细胞病变（CPE），而DEV感染组细胞出现皱缩变圆、脱落等CPE现象，茜草素干预组细胞病变程度较DEV感染组轻；空白对照组和茜草素对照组未检测出DEV，而DEV感染组病毒相对表达量高，茜草素干预组病毒相对表达量低。 结论 茜草素可减轻DEV引起的细胞病变并抑制病毒增殖，具有抗DEV潜力。

Abstract

Objectives The effects of Alizarin, an active ingredient in traditional Chinese medicine (TCM), on inhibiting the in vitro replication of duck enteritis virus (DEV) were studied to alleviate the problems of the high mortality rate, antibiotic abuse, and drug resistance caused by DEV in the current farming industry and provide the safe and natural candidate drugs for " alternatives for antibiotics ". alleviating the high mortality rate, antibiotic abuse, and resistance caused by DEV in the current aquaculture industry, and providing safe and natural candidate drugs for "alternative resistance". Methods The 50% tissue culture infectious dose (TCID50) of DEV was determined after treating duck embryonic fibroblasts (DEF) with blank control group (group A), alizarin control group (gGroup B), DEV-infected (group D), and alizarin-intervention (group E). The maximal atoxic concentration (TC₀) of alizarin was measured with CCK-8 assay. Cellular pathological effects (CPE) and viral proliferation inhibition were analyzed with microscopic observation and quantitative PCR (q-PCR). Results TCID₅₀ of the DEV-GZ Guizhou isolate was 3.98×10^-5/0.1 mL. TC₀ of Alizarin was 0.05 mg/mL. There was no cytotoxicity (CPE) in group A and group B. the cells in group D had CPE phenomena including shrinking, rounding and shedding. The degree of cytotoxicity in group E was milder than that in group D. DEV expression was not detected in group A and group B, while the relative level of DEV expression was high in group D and low in group E. Conclusions Alizarin can mitigate DEV-induced CPE and suppress the proliferation of virus, with the potential to resist DEV.

Graphical abstract

关键词

茜草素 / 鸭肠炎病毒 / 最大安全浓度 / 细胞病变 / 相对表达量 / 体外复制

Key words

Alizarin / duck enteritis virus (DEV) / maximum safe concentration / cellular pathology / relative level of expression / in vitro replication

鸭肠炎病毒（duck enteritis virus，DEV）是DNA病毒，属于疱疹病毒科α病毒亚科，主要引起鸭、鹅和雏禽类发生肠道出血坏死、免疫器官损伤以及实质性器官退行性病变等为特征病变的急性、热性、败血性、高度传染性病，其发病速度快、死亡率高、流行范围广。目前，该病已经成为危害养鸭业的主要疫病之一，对我国乃至全球的水禽养殖业造成巨大经济损失^[1-2]。

随着“减抗、替抗”时代的到来，研发安全、环保的新型抗病毒药物已成为当务之急，中药及其有效活性成分在新型冠状病毒感染疫情期间发挥了重要的作用，越来越多学者将目光投放到中药及其有效活性成分上，且其在畜禽病毒性疾病防治上也取得了相应的成就。近年来，各种组学分析技术已经被广泛应用于研发药物、探究生物体的生理生化过程和研究疾病与药物的相互作用机制^[3-5]。目前，已有研究报道金银花、板蓝根、鱼腥草、茜草等中草药都具有抗病毒作用。茜草(Rubia cordifolia L.)为茜草科植物，又被称为茜根、拉拉藤、活血草、血见愁等^[6]，广泛分布于世界各地。茜草干燥的根或者茎性寒味苦，归肝经，具有凉血止血、活血祛瘀的药理作用，从而被广泛应用于治疗吐血、溢血和外伤出血等^[7]。随着现代医学化学分析技术的发展，发现茜草含有的化学物质成分十分丰富，如蒽醌及其苷类、萘醌及其苷类、环己肽类、萜类、多糖类和微量元素，除此之外还含有一些如β-谷甾醇、胡萝卜苷等植物甾醇类物质；茜草具有止血化瘀、抗肿瘤、抗氧化和免疫调节等多种药理作用，茜草的提取物可以减少艾滋病病毒（HIV）感染人时病毒的生成，来抑制病毒的复制，发挥抗病毒作用^[8-11]。通过更深的药理作用分析发现，茜草除了传统中医中的止血、保肝的功效外，还有许多其他的药理作用，如Itokawa等^[12]发现其对多种癌细胞均有抑制作用；Lodi等^[13]发现茜草乙醇提取物可以提高SOD和CAT的活力从而抑制脂质过氧化；杨胜利等^[14]研究发现茜草提取物具有免疫抑制作用；崔颖等^[15]研究发现茜草具有较强的抗菌作用等；有研究证实蒽醌类化合物是发挥抗炎症功能的主要化合物等^[11]。茜草入药有悠久的历史，加上现代中医药技术的结合，极具良好的发展前景。

为探究茜草素对DEV增殖的影响，本研究通过对DEV半数组织细胞感染剂量(50% tissuecultureinfectivedose，TCID₅₀)的检测、茜草素最大安全浓度（maximal atoxic concentration，TC₀）测定、茜草素对DEV感染所致鸭胚成纤维细胞（duck embryo fibroblast, DEF）细胞病变（CPE）观察等，以期为阐明茜草素影响DEV体外增殖的分子机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）毒株与鸭胚。鸭肠炎病毒贵州分离株（DEV-GZ株）病毒液，保存于贵州大学动物科学学院预防兽医学实验室；清洁级鸭蛋购买于贵州某鸭场，相关病毒核酸检测为阴性，孵化至9~11日龄的鸭胚备用。

2）主要试剂。细胞培养及相关检测试剂：DMEM培养基、DEPC水、胎牛血清（FBS）、青链霉素混合液、Hanks缓冲液、0.25%胰蛋白酶和cell counting kits（CCK8）试剂均购自美国GIBCO公司；茜草素购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。核酸提取及q-PCR试剂：Trizol、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ和Premix Ex TaqTMⅡ均购自宝生物工程（大连）有限公司。

3）主要仪器。全自动孵化箱（FH1001），购自德州亚润农业科技有限公司；高压蒸汽灭菌锅（LDZM-80L-Ⅱ），购自上海申安医疗器械厂；电热鼓风干燥箱（101A-3E），购自上海实验仪器厂有限公司；纯水仪（Milli-Q Integral），购自美国密理博公司；生物安全柜（HR40-ⅡA2），购自青岛海尔生物医疗股份有限公司；恒温水浴锅（TU-100C），购自上海蓝豹实验仪器有限公司；微量核酸测定仪（Nanodrop One），购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；超低温冰箱（BCD-215K），购自青岛海尔生物医疗股份有限公司；倒置生物学显微镜（BX53F），购自日本OLYMPUS公司；颗粒制冰机（Grant XB70），购自美国Grant公司；台式高速冷冻离心机（Scan Speed 1730R），购自丹麦LABOGENE公司；二氧化碳培养箱（BPN-150CW），购自上海一恒科学仪器有限公司；全自动酶标仪（ELX808），购自Bio Tek Instruments Inc；荧光定量PCR仪（CFX96），购自美国BIO-RAD/伯乐公司。

1.2 方 法

1）DEF的制备。操作如下：

①配制含10% FBS的DMEM培养液、含1%青链霉素的预冷无菌PBS；

②取9~11日龄的鸭胚置于蛋座上，用碘酊来回擦拭气室表面，用75%乙醇脱碘；

③用镊子敲破气室部分卵壳，依次去除卵膜、绒尿膜和羊膜，将鸭胚提出并放入无菌培养皿中；

④剪去头、四肢和翅，剔除内脏，用PBS洗涤2~3次，移入新的培养皿中，用灭菌眼科剪剪碎，加入10倍体积的0.25%胰蛋白酶溶液，倒入10 mL无菌离心管，封口膜封口；

⑤放入37 ℃恒温水浴锅中水浴20 min，每5 min颠倒摇匀1次，直至组织块边缘呈现絮状、蓬松绒毛状物时取出，1 600 r/min离心5 min；

⑥弃去上清液，把组织倒入新的培养皿中，加入3 mL DMEM培养液终止消化，用细胞筛过滤，过滤后的细胞悬液置于倒置显微镜下观察密度后进行分瓶并做好标记，放入37 ℃ 5% CO₂培养箱培养备用。

2）DEV TCID₅₀的检测。取96孔细胞板，每孔加入2×10⁵个DEF，放入37 ℃ 5% CO₂培养箱培养至70%贴壁，将DEV-GZ病毒液按10^-1~10^-10倍比稀释，接种到96孔细胞板中，每个稀释度接种1列共8孔，每孔100 μL病毒液，同时设置未感染细胞对照组，放置在37 ℃ 5% CO₂培养箱继续培养3~5 d，记录细胞病变孔数，直至病变孔数不再增加，应用Reed-Muench法计算DEV-GZ株病毒滴度（TCID₅₀），公式如下：

距离比例=（高于50%病变率的百分比－50%）/（高于50%病变率的百分比－低于50%病变率的百分比）

lg TCID₅₀=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数。

3）茜草素TC₀测定。参照GLPBIO的CCK8试剂盒说明书测定茜草素的TC₀。操作如下：

①取96孔板，每孔加入10³~10⁴个DEF，于37 ℃ 5% CO₂培养箱培养24 h；

②将茜草素药粉溶解到含10% FBS的DMEM中配制成不同质量浓度（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 mg/mL），将10 μL不同浓度的茜草素加入孔中，每个浓度做3个重复，同时设置细胞对照组；

③将培养板在培养箱中孵育24 h；

④加入CCK8溶液，每孔10 μL，并将培养板放在培养箱中孵育2 h；

⑤使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。

4）茜草素对DEV增殖的影响。具体如下：

①茜草素对DEV感染所鸭胚成纤维细胞病变影响。将DEF制备成1×10⁵个/mL的细胞悬液，加至6孔细胞培养板中，每孔1 mL，于37 ℃ 5% CO₂培养箱培养至细胞汇聚度达到80%，茜草素对照组（B组）和茜草素干预组（E组）分别加入1 mL茜草素溶液，37 ℃孵育2 h后弃去，Hanks液洗3次，B组加入细胞维持液，E组接种100 TCID₅₀ DEV-GZ株病毒液，吸附1.5 h后弃去病毒液，Hanks液洗3次，加入细胞维持液；DEV感染组（D组）接种100 TCID₅₀ DEV-GZ株病毒液，吸附1.5 h后弃去病毒液，Hanks液洗3次，加入细胞维持液；同时，设置未感染细胞为空白对照组（A组），置于37 ℃ 5% CO₂培养箱继续培养，观察4个组24、36、48 h DEF细胞病变情况（CPE），并收集各组细胞样本于-80 ℃备用。

②茜草素对DEV感染DEF中病毒含量的影响。一是引物合成。参照文献[16-17]分别设计β-actin和DEV-NP基因引物，由生工生物工程上海股份有限公司合成，引物具体信息见表1。

二是总RNA的提取。使用Trizol法提取细胞总RNA，具体步骤如下：

a.取1.2中第4）节①中收集的各组细胞样本，每个样本中加入1 mL Trizol，室温静置10 min，每隔5 min轻轻晃动1次。

b.加入200 μL（1/5）氯仿，剧烈震荡15 s，呈乳白色后室温静置5 min，4 ℃，10 000 r/min离心15 min。

c.将上清（水相）吸取到新的1.5 mL离心管，切勿吸动中间相，按1∶1加入预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10 min，4 ℃，10 000 r/min离心10 min。

d.弃上清，沿管壁缓缓加入1 mL预冷的75%乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，4 ℃，8 000 r/min离心5 min。

e.弃去上清，干燥5 min，每管加入10 μL Rnase-free水。

f.将提取的总RNA溶液分装2 μL，检测RNA浓度和纯度，剩余RNA放冰盒暂存。

三是cDNA合成。采用反转录试剂盒合成cDNA，加样全程在冰盒上进行，具体的反应体系及程序如下：

a.按下列组分配制：RT反应液：5× Prime Script RT Master Mix（Perfect Real Time） 2.0 μL，Total RNA 1.0 μg，Rnase-free水补足10 μL。

b.轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下：37 ℃ 15 min（反转录反应）；85 ℃ 5 s（反转录酶的失活反应）；合成的cDNA保存于-20 ℃冰箱。

c.RT-PCR检测。根据试剂盒使用说明书进行扩增，反应体系为：TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNase H Plus)（2×） 12.5 μL，上游引物、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，灭菌双蒸水补足25 μL体系。反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环，扩增结果用2^-△△ct法计算，并使用软件GraphPad prism 8作图。

2 结果与分析

2.1 DEV TCID₅₀的检测结果

通过Reed-Muench法对DEV-GZ株病毒液进行TCID₅₀检测，结果见表2，经计算，DEV-GZ株的TCID₅₀为：3.98×10^-5/0.1 mL。

2.2 茜草素TC₀测定结果

将不同浓度茜草素药液接种至DEF细胞于37 ℃培养箱孵育24 h，同时设置空白细胞对照组，加入CCK-8检测细胞毒性，结果见图1。由图1可知：0.05 mg/mL茜草素组细胞毒性为12.00%，与对照组（9.30%）差异不显著（P>0.05），而0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 mg/mL茜草素组细胞毒性分别为23.90%、25.60%、40.70%、71.20%、72.80%，均与对照组差异极显著（P<0.01），说明茜草素对细胞的毒性与其浓度呈正比，故茜草素的最大安全浓度（TC₀）为0.05 mg/mL。

2.3 茜草素对DEV增殖的影响

1）茜草素对DEV感染DEF细胞CPE抑制效果检测分析。为了解茜草素对DEV感染DEF的影响，通过显微镜观察各组感染细胞的病变情况，结果如图2所示：与空白对照组相比，茜草素对照组细胞无明显CPE现象，DEV感染组细胞病变明显，细胞圆缩、折光性增强、细胞间隙增大、部分细胞开始脱落，出现明显CPE现象；茜草素干预组细胞部分出现变圆皱缩、折光性增强，病变较DEV感染组轻。说明使用茜草素干预能减轻DEV引起的CPE。

2）茜草素处理组与对照组DEF细胞内DEV病毒含量对比检测结果。为了解茜草素对DEV在DEF中病毒增殖的影响，将q-PCR检测结果用2^-△△Ct法计算后，使用软件GraphPad prism 8作图（图3）。由图3可知，在感染后24、36、48 h，茜草素干预组（E组）的DEV相对表达量均显著低于DEV感染组（D组）（P＜0.05），表明茜草素可有效抑制DEV在DEF细胞中的增殖，使细胞样本中的病毒含量显著降低。

3 讨 论

鸭病毒性肠炎又称为鸭瘟，其病原是疱疹病毒科、α病毒亚科、马立克病毒属的成员，能够引起鸭、鹅和其他水禽类发生急性、热性和高度传染性疾病^[18-19]。鸭病毒性肠炎的特征性病理变化是肠道血管损伤出血、淋巴器官病变和实质器官发生退行性变化等，传播速度快、覆盖范围广、发病率和死亡率较高，是当前危害养鸭业的主要疫病之一，给全球养鸭业造成了巨大的经济损失^[1,19-20]。目前，由于市场上缺乏有效的抗DEV药物，该病的防控还主要依赖于疫苗接种，但DVE的发病率和死亡率仍居高不下，再加上抗生素滥用导致的耐药性增强等问题亟待解决，因此研发新的“无抗、减抗”抗DEV药物对DEV的防治极其重要^[1]。茜草最早是被当作染料来使用，又名红根草或染蛋草，故在其防治疾病方面的研究鲜少，但近年来，逐渐有学者发现茜草还具有止血抗炎、抗病毒、广谱抗菌等药用价值，其中蒽醌类化合物已被证实是发挥抗炎症功能的主要化合物^[11,21-23]。茜草素是茜草的有效活性成分，目前已经有多篇文献报道茜草素具有抗肿瘤作用，但茜草素抗DEV的研究极少，因此本研究通过体外试验探究茜草素对鸭肠炎病毒（DEV）增殖的影响，以明确其抗病毒活性。

通过CPE观察，根据Reed-Muench法计算出DEV的TCID₅₀为3.98×10^-5/0.1 mL，同时利用CCK8检测到茜草素的最大安全质量浓度为0.05 mg/mL，在此基础上，通过q-PCR试验技术发现茜草素干预组DEV mRNA相对表达量显著低于DEV感染组，证明茜草素能影响DEV在DEF细胞上增殖。不过，48 h时E组DEV含量显著下调的原因可能并非单一因素，虽然病毒释放引起的细胞病变可能导致细胞量减少，但更可能是茜草素对病毒复制过程的直接抑制，如干扰病毒吸附、侵入、核酸复制、蛋白质合成等环节，或是对细胞免疫反应的调节，例如诱导干扰素产生等多种因素共同作用的结果。为进一步明确茜草素对DEV感染的影响及作用机制，后续还需进一步的试验研究和补充验证。

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基金资助

贵州省科技创新人才团队建设项目(黔科合平台人才〔2019〕5203号)