云南省部分地区牛腹泻病毒核酸检测与分析

Nucleic acid detection and analysis of bovine diarrhea virus in some areas of Yunnan Province

摘要

目的 探究云南省部分地区牛腹泻病毒的流行情况，为该病的防控和检测工作提供参考。 方法 2021－2023年，对云南省内12个区域采集的655份粪便样本进行RT⁃PCR检测，并采用描述性统计分析、分组对比分析和相关性分析对牛腹泻病毒在不同地区、不同年龄、不同样品（腹泻/非腹泻）、不同品种（肉牛/奶牛）中的分布情况及不同病原在云南的流行情况进行统计分析，阐述病毒的分布特点。 结果 共检测出BRV、BCoV、BVDV、BToV、BNoV、BAstV、BNeV和BEV等8种病毒，总阳性率为49.92%，其中BCoV、BToV和BAstV在云南牛群中阳性率最高；各种病毒在腹泻样品中检出率为84.2%，在非腹泻样品中检出率为24.7%，且在腹泻样品中存在二重和三重混合感染；8种病毒在奶牛样品中均被检出，阳性率为60.2%，在肉牛样品中仅有BRV存在，阳性率为1.7%；8种病毒对于不同年龄段牛群易感性不同，主要感染1周龄～6月龄犊牛。 结论 在云南部分地区牛群中共检测到8种腹泻病毒，其中BCoV、BToV和BAstV的阳性率最高，是云南主要流行病毒。8种病毒主要感染1周龄～6月龄犊牛，且存在隐性感染和多重混合感染情况。

Abstract

Objectives The prevalence of bovine diarrhea virus in some areas of Yunnan Province was studied to provide references for the prevention, control and detection of this disease. Methods 655 fecal samples collected from 12 regions in Yunnan Province from 2021 to 2023 were detected with RT-PCR. Descriptive statistical analysis, group comparison analysis, and correlation analysis were used to statistically analyze the distribution of bovine diarrhea virus in different regions, ages, samples (diarrhea/non diarrhea), breeds (beef cattle/dairy cows), and the prevalence of different pathogens in Yunnan. The characteristics of distribution of the virus were elucidated. Results 8 viruses including BRV, BCoV, BVDV, BToV, BNoV, BAstV, BNeV, and BEV were detected, with a total positive rate of 49.92%. Among them, BCoV, BToV, and BAstV had the highest positive rates in herds of cattle from Yunnan. The detection rate of various viruses in diarrhea samples and non-diarrhea samples was 84.2% and 24.7%, with the presence of dual and triple mixed infections in diarrhea samples. 8 viruses were detected in cow samples with a positive rate of 60.2%, while only BRV was present in beef cattle samples with a positive rate of 1.7%. The susceptibility of 8 viruses to different age groups of cattle varied, mainly infecting calves aged 1 week to 6 months. Conclusions 8 types of diarrhea viruses were detected in herds of cattle in some areas of Yunnan, among which BCoV, BToV, and BAstV had the highest positive rates and were the main prevalent viruses in Yunnan. 8 viruses mainly infected calves aged 1 week to 6 months, and there were cases of latent infection and multiple mixed infections.

Graphical abstract

关键词

牛腹泻病毒 / 分布特点 / RT-PCR / 混合感染 / 流行特点

Key words

bovine diarrhea virus / characteristics of distribution / RT-PCR / mixed infection / characteristics of prevalence

随着国内养牛业的迅速发展，牛疫病防控工作的重要性愈发显著。牛腹泻性疾病不仅会降低生产效率，还会对整个养牛场的经济效益造成重大影响^[1]，是养牛生产过程中普遍存在的问题，它通常涉及多种病原的混合感染^[2]。

目前，引起牛腹泻的原因较多，主要包括营养性腹泻、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染等，其中病毒感染引起的牛腹泻发病率一直居高不下，其危害尤为严重^[3-4]。常见的引起牛腹泻的病毒有牛轮状病毒（bovine rotavirus，BRV）、牛冠状病毒（bovine coronavirus，BCoV）、牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛环曲病毒（bovine torovirus，BToV）、牛诺如病毒（bovine norovirus，BNoV）、牛星状病毒（bovine astrovirus，BAstV）、牛纽布病毒（bovine nebovirus，BNeV）以及牛肠道病毒（bovine enterovirus，BEV）等^[5-7]。由于引起牛腹泻的病原复杂，往往多种病原同时感染，且症状相似，使得病原的准确识别和区分变得困难。RT-PCR方法凭借其相对较低的检测成本、高灵敏度及特异性，已成为实验室检测的首选方法。

根据国内流行病学调查，BRV、BCoV、BVDV、BAstV、BNeV及BEV是目前引起牛腹泻的常见病毒，它们在我国的流行较为普遍。相比之下，BToV和BNoV的流行病学数据较少，表明这些病毒在我国牛群中的流行程度较低^[8-9]。随着我国养牛业的发展，腹泻病对牛只健康造成巨大威胁。为了深入了解云南地区牛群的感染状况，本研究采用RT-PCR技术对上述8种病原进行检测，旨在掌握云南省牛腹泻病毒的流行情况，为云南地区牛腹泻性疾病的防控和检测工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源与处理

2021－2023年，采集云南省大理市、陆良县、石林县、寻甸县、鹤庆县、武定县、洱源县、玉溪市、梁河县、丽江市、保山市、香格里拉市等12个地区的腹泻和非腹泻奶牛、肉牛粪便样品共655份，详见表1。使用RNA提取试剂盒对样品进行病毒总RNA提取，利用5×All-In-One RT MasterMix试剂盒进行cDNA合成，将产物于-20 ℃冷冻保存备用。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒、DL 2 000 DNA Marker、Gold View核酸染料、5×All-In-One RT MasterMix、1×TAE速溶颗粒、2×Taq Plus Master Mix ll（Dye Plus）、EasyPure^® Gel Extraction Mini Kit，均购自北京擎科生物有限公司。

1.3 引物设计与合成

参考GenBank中BRV（MN047454.1）、BCoV（AF391542）、BVDV（KF501393、KX577637.1、KX987157）、BToV（MG957145.1、MW114531.1、AF076621.1）、BNoV（NC029645）、BAstV（KJ620980）、BNeV（MG599036.1）、BEV（NC_001859、AF123432）相应目的基因设计特异性检测引物，委托昆明擎科生物有限公司进行引物合成，RT-PCR检测引物信息见表2。

1.4 RT-PCR检测

以处理后冷藏的cDNA为模板，配制反转录体系进行RT-PCR检测。反应体系25 µL：2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）12.5 µL、Nuclease-free Water 9.5 µL、Forward Primer（10 μmol/L）1.0 µL、Reverse Primer（10 μmol/L）1.0 µL、cDNA 1.0 µL；反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性15 s，在不同退火温度和延伸时间下（表2），扩增35个循环，72 ℃终延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行110 V恒压电泳30 min，结束后用凝胶成像系统观察结果，并拍照记录。

1.5 数据分析

用Excel软件对各病毒检测结果按照不同地区、不同样品来源（肉牛/奶牛）、腹泻和非腹泻、不同年龄进行分类统计，计算阳性检出率，分析不同病毒的流行特征。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR检测

对采集的655份样品进行BRV、BCoV、BVDV、BToV、BNoV、BAstV、BNeV及BEV的RT-PCR检测，结果发现：分别在145、450、208、698、543、376、396、732 bp处可见清晰的特异性条带，均与预期的条带大小一致，表明建立的RT-PCR方法准确有效。RT-PCR电泳结果如图1所示。

2.2 不同病毒的流行特征

1）地区分布。大理市、陆良县、石林县、寻甸县、鹤庆县、武定县、洱源县、梁河县、保山市等9个地区样品中均有不同种类腹泻病毒被检出，其中鹤庆县7种，陆良县6种，大理市、保山市、石林县均为4种，寻甸县3种，洱源县2种，武定县、梁河县均为1种；玉溪市、丽江市、香格里拉市等3个地区样品中未检出腹泻病毒；BCoV、BToV及BAstV均在6个地区被检出（表3）。

2）样品分布。由表4可知，共检测腹泻粪便样品278份、非腹泻粪便样品377份。除BRV外，其他7种病原在腹泻及非腹泻样品中均有检出，腹泻样品阳性检出率为84.2%，非腹泻样品阳性检出率为24.7%。总体而言，牛腹泻病毒在腹泻样品中的检出率较为集中，但非腹泻样品中也有所发现。

共检测了肉牛粪便样品115份、奶牛粪便样品540份，结果显示，肉牛样品中仅1种病原（BEV）被检出，其感染阳性率为1.7%；而奶牛样品中则检出了8种腹泻病毒，总阳性率高达60.2%，其中BAstV、BToV和BCoV检出率较高，而BRV、BEV较低。综上所述，牛腹泻病毒感染主要集中于奶牛群体中。

3）年龄分布。由表5可知，检测1周龄牛粪便样品20份、1周龄～1月龄牛粪便样品113份、1～6月龄牛粪便样品321份、≥1岁牛粪便样品201份。结果显示，在1周龄牛粪便样品中检出6种病毒，其中BToV与BRV阳性率较高，阳性率为15.0%；1周龄～1月龄牛粪便样品中病原最为复杂，8种病毒全被检出，且BAstV阳性率最高，阳性率为18.6%，其次是BToV；1～6月龄牛粪便样品中检出5种病毒，其中BAstV阳性率最高，阳性率为15.9%，其次是BToV；≥1岁牛粪便样品中检出5种病毒，其中BAstV阳性率最高，阳性率为5.0%，其次是BCoV，说明在不同年龄段牛群中特定病毒的流行趋势和公共卫生的重要性。综合来看，6月龄以下犊牛的腹泻病原感染最严重，而BCoV、BToV和BAstV在不同年龄段牛群中均有感染，这可能是云南省流行的主要腹泻病毒。

4）病原分布。经检测发现，BRV、BCoV、BVDV、BToV、BNoV、BAstV、BNeV、BEV阳性率分别为0.8%、9.3%、6.7%、10.8%、3.8%、12.8%、7.0%、2.7%（表3），其中，以BAstV、BToV、BCoV阳性率最高。同时，腹泻样品检出多种病毒混合感染，总混合感染阳性检出率为4.1%，主要表现为BVDV+BCoV、BCoV+BRV、BRV+BNoV、BEV+BNoV、BAstV+BToV、BNeV+BToV二重和BAstV+BToV+BNeV、BCoV+BRV+BNoV三重混合感染，阳性检出率分别为2.2%、1.1%、1.1%、0.7%、1.8%、1.8%、0.7%、0.4%。综合来看，主要表现为以BCoV、BNoV、BToV与其他病原的混合感染（表6）。

3 讨 论

3.1 RT-PCR检测方法建立及有效性分析

本研究针对8种病原分别建立RT-PCR检测方法，利用primer-blast进行引物设计，并进行BLAST分析，确认引物的特异性，RT-PCR产物经电泳分离，呈现为单一的带状条纹，将RT-PCR产物进行测序，测序结果用BIAST与预期序列进行比对分析，核酸同源性为96.0%～99.8%，表明扩增产物是特异的。

将阳性重组质粒以10倍梯度进行稀释（即依次取上一稀释梯度的溶液，按1∶9（质粒∶缓冲液）进行连续稀释，获得10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5……至10^-n 的系列稀释液），按照已确定的扩增体系、条件，取每个稀释度进行扩增，最终确定稀释倍数为10^-4的样品为该RT-PCR检测下限；在RT-PCR反应中设置阴、阳对照，阳性对照扩增出目的条带，阴性对照没有扩增出目的条带，并进行多次重复试验，试验结果一致且稳定，表明本研究建立的RT-PCR检测方法具有高效性、稳定性和可靠性。

3.2 云南部分地区牛腹泻病毒流行情况

本研究共检测出8种牛腹泻病毒，其中BToV、BAstV和BCoV在云南地区阳性率最高，与国内其他省份相比，BCoV仍是主要流行的腹泻病毒，但与之不同的是BAstV、BToV也在云南广泛流行，成为云南的主要流行病毒。

从奶牛和肉牛样品分析发现，奶牛样品中8种病毒均被检出，各病毒总阳性率为60.2%，肉牛样品中仅检出BEV，阳性率较低，为1.7%；从不同年龄阶段分析，8种腹泻病毒在1周龄～1月龄阶段均存在，但是主要感染1周龄～6月龄的犊牛；从样品类型分析，腹泻样品中阳性率为84.2%，非腹泻样品中阳性率为24.7%，同时在腹泻样品中有27份存在二重或三重感染，给牛腹泻病的防治带来巨大挑战。云南部分地区BToV、BAstV和BCoV 3种病毒检出率最高，且主要感染奶牛和1周龄～6月龄犊牛，分析原因主要有以下几个方面：

1）品种因素。主要表现在：

一是奶牛产后需分泌大量乳汁，乳汁富含免疫球蛋白等活性物质，这一过程消耗了母牛自身的免疫力，从而使得其免疫力有所下降。乳汁的合成消耗大量能量，引发能量负平衡，导致血液中非酯化脂肪酸和β-羟丁酸浓度上升，进而影响白细胞的趋化和吞噬能力，削弱了奶牛的免疫力。

二是奶牛在产奶期容易感染一些代谢疾病，如乳房炎、子宫炎等，这些疾病的发生会削弱其免疫力，在这些因素共同作用下，使得奶牛的发病率相较于肉牛更高。

三是犊牛出生后，为提高免疫力多会通过初乳获得母源抗体，提高犊牛对病毒和细菌抵御能力，随着犊牛日龄不断增长，母源抗体保护力呈下降趋势^[10]，特别是由于1周龄～6月龄的犊牛从母乳中获取的抗体逐渐降低，而自身免疫系统还未发育成熟，对病毒免疫耐受有限，容易受到腹泻病毒感染。格桑卓嘎^[11]在犊牛腹泻常见病原和科学防治措施中提到，母源抗体可以对犊牛起到保护作用，随着日龄增长，母源抗体保护力逐渐降低，造成腹泻疾病高发。这与本研究主要感染1周龄～6月龄犊牛的结果相同。

2）气候因素。云南气候类型丰富多样，以亚热带高原季风气候为主，具有显著的立体气候特征，干湿季节分明，年温差小但日温差较大，气候随地势高低垂直变化异常明显，复杂多变的气候条件使牛容易产生应激反应，病毒为适应独特的气候环境会发生基因突变，病毒适应性增强，从而增加了感染腹泻病毒的风险。

3）环境因素。云南多山地高原，牛舍环境容易因地势、降雨等因素难以保持干燥卫生，潮湿的环境利于病毒滋生和传播，增加了牛接触病原体的机会。此外，一些养殖场养殖密度过高、牛舍通风不良、粪便清理不及时等，也会造成牛舍内病原体大量积聚，容易感染腹泻病毒。

4）饲养管理因素。一些养殖场在饲养管理上存在问题，如饲料营养不均衡、饲料变质等，这些问题会直接影响牛的消化功能和免疫力，使其更易受到腹泻病毒的侵袭。

5）防疫意识和措施不足。一些养殖场防疫意识淡薄，对牛腹泻病毒的危害认识不足，未及时给牛接种疫苗，或未建立科学的免疫程序。同时，牛舍消毒措施不到位，不能有效杀灭病原体，也容易导致腹泻病毒的传播和流行。

6）非法贸易因素。云南省位于祖国西南边陲，与缅甸、老挝、越南三国接壤，边境线漫长。近年来，在高利润的诱惑下，尽管我国严令禁止，从其他国家走私未经检疫的活体牛至云南销售的现象时有发生，这些走私动物潜藏着巨大风险，它们可能携带包括腹泻病毒在内的多种病原体，从而加剧腹泻病毒在云南的传播与流行。

3.3 云南部分地区牛腹泻病毒隐性感染情况

通过对655份样品进行检测，发现隐性感染阳性率为24.7%，分析原因：一是在样品采集、运输、处理或检测过程中，可能发生交叉污染；二是个体差异、免疫状态感染阶段或病毒毒力等因素导致病毒处于潜伏或亚临床感染，尚未表现明显症状，但样品中仍可能检测出腹泻病毒；三是可能由于病毒的遗传变异，导致病毒在感染个体中的表现不同，只能引起轻微症状或无症状，但仍然可以在样品中检测出病毒核酸。

4 结 论

云南省牛场存在BRV、BCoV、BVDV、BToV、BNoV、BAstV、BNeV、BEV等8种腹泻病毒的流行，其分布较广泛，其中BAstV、BToV、BCoV流行情况相对较为严重，8种病毒主要感染1周龄～6月龄犊牛，且存在隐性感染和多重混合感染情况。建议根据本地的病毒流行特点，采取有针对性的防控措施。

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基金资助

云南省科协基层专家科研工作站项目

云南省国际科技特派员项目

梁河县农民院士科技服务站项目

梁河县芒陇乡村振兴科技创新村项目(202404BU090032)