牛阿卡斑病的诊断方法

摘要

牛阿卡斑病是1种由阿卡斑病毒引起的虫媒传染病，近年在内蒙古东北部地区时有发生，给当地的畜牧业造成了严重的经济损失。及时、准确的诊断是防控该病的基础，而成年牛患病后无明显的临床症状，诊断难度大。本文介绍了牛阿卡斑病的病原学、血清学和分子生物学诊断技术，并对比了各诊断方法的优缺点，各地区可结合实际情况选择合适的诊断方法定期监测，以降低牛阿卡斑病带来的疫病风险。

关键词

牛 / 阿卡斑病 / 诊断方法 / 病原学

牛阿卡斑病也称赤羽病，是由阿卡斑病毒引起的以母牛流产、早产、产畸形胎，犊牛先天性关节弯曲、积水性脑脊髓炎为主要症状的虫媒传染病。该病被我国列为二类动物疫病，是牛羊入境必检的动物疫病之一，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的疾病之一^[1]。2021年9月，吉林和内蒙古东北部地区出现新生犊牛四肢关节弯曲，脊柱有明显形变，双目失明的现象，经诊断为牛阿卡斑病^[2]，现报告如下，供同行参考。

1 病原学

阿卡斑病毒属布尼亚病毒科、正布尼亚病毒属、辛波血清群^[1]。该病毒颗粒直径80~120 nm，呈球形，病毒粒子表面有囊膜和蛋白纤突。该病毒核酸由3个负链或双叉单股RNA组成，含有3个核衣壳，核衣壳由核衣壳蛋白和少量大蛋白分别包裹大（L）、中（M）、小（S）3种RNA片段而构成^[3]。基于该病毒高度保守的S片段序列，可将只有1个血清型的阿卡斑病毒分为4个基因群（Ⅰ～Ⅳ），Ⅰ型群可分为Ⅰa和Ⅰb。该病毒不耐热，对乙醚、氯仿和酸敏感，20%乙醚可在5 min内使其灭活。在pH为6～10范围内稳定，在pH=3时不稳定，紫外线照射或温度达56 ℃时迅速被灭活^[4]。

2 流行病学

2.1 传染源

自然条件下，牛、羊、马、猪、小鼠、猴、野兔等多种动物和人类均可感染阿卡斑病毒，发病动物、带毒动物以及感染的人类都可以作为该病的传染源。

2.2 传播途径

蚊虫、库蜢、螨类等节肢动物是牛阿卡斑病的重要传播媒介^[5]，通过叮咬牛的黏膜和上皮进行病毒的传播。此外，当妊娠期母牛被该病原侵袭后，可通过胎盘垂直传播给胎儿。

2.3 季节性

由于阿卡斑病是虫媒传染病，该病的发生与媒介昆虫的生长、繁殖有着密切关系，当气候条件满足媒介昆虫活动时，该病的发病率显著提高。因此，夏季和多雨季节，牛阿卡斑病的发生较为频繁。

3 临床症状

大部分非妊娠期的牛在感染该病后无明显的临床症状，犊牛或部分成年牛受到强毒毒株感染时，可表现为共济失调、跛行、眼球震颤等脑炎症状。妊娠母牛感染后临床症状不明显，但对胎儿有极大影响，可能会发生流产、早产、产畸形胎等。妊娠早期（104 d前）感染，纤维组织明显增生，堵塞胎儿的脑脊液循环通道，致使胎儿大脑大小异常或无脑，娩出的犊牛患有积水性脑脊髓炎，神情呆滞，双目失明，失聪，哺乳动作缓慢，甚至无法正常哺乳。妊娠中期（105～174 d）感染，此时胎儿的大脑发育已基本完成，病毒侵害胎儿的脑神经，继发肌肉、软组织的萎缩和纤维化，娩出的犊牛关节变形，肌肉萎缩，颈椎和脊柱异常弯曲等。妊娠后期（175 d以后）感染，病毒侵害胎儿的脊髓、脑和骨骼肌，娩出的犊牛会有明显的脑炎症状，共济失调，无法独立行走或站立，精神高度紧张^[6]。

4 诊 断

4.1 病原学诊断

1）直接镜检。取病牛血液、肺脏、肝脏和脾脏以及胎儿、胎盘和脑组织等材料制成病理切片。通过负染，在电子显微镜下进行观察。若病毒粒子形态符合阿卡斑病毒，则可确诊。

2）病毒分离鉴定。对病毒进行分离鉴定是确诊该病的最好方法。由于感染牛只症状不明显，不易观察出异常，而且无法准确判断病毒血症期，从成年牛体内分离病毒又较为困难，故取胎儿脑组织、脑室液、脊髓等病变组织，混合病料后剪成小块组织，经研磨后加入抗生素进行处理，离心后取上清液，脑内接种乳鼠或Vero、Hmlu-1和BHK-21等细胞中，36 h后，细胞出现圆缩、脱落等现象，4 d后，大部分细胞脱落，有明显的病变现象^[6]。

4.2 血清学诊断

1）微量血清中和试验（SNT）。SNT是检测牛只体内病毒抗体水平的标准方法，也是我国推荐检测阿卡斑病毒的标准方法。操作时，在微量培养板内加入50 μL待检血清、50 μL病毒工作抗原和100 μL Vero细胞悬液（约30万个细胞/mL），同时设阴性血清和标准阳性血清对照，在37 ℃下培养5 d，观察病毒中和反应，能够使50%的Vero细胞不出现细胞病变效应（CPE）者，为阳性反应，反之则为阴性^[7]。

2）酶联免疫吸附试验（ELISA）。ELISA是利用抗原抗体特异性结合的原理对特定的抗原或抗体进行检测，广泛应用于临床实践。该方法快速、待测样品无需灭活、特异性强、敏感度高。世界动物卫生组织将ELISA和SNT共同列为跨国贸易中该病检疫的指定试验。近年来，许多学者不断优化检测技术，研发出多种能够检测阿卡斑病毒的ELISA方法。刘晓波^[8]利用G1基因编码蛋白片段，构建了pET-32a(+)-G1原核表达载体，并对其进行诱导表达和抗原性检测，通过镍柱对其纯化后获得G1蛋白作为包被抗原建立了ELISA检测方法。陈冬杰等^[9]用纯化的阿卡斑病毒N重组蛋白作为包被抗原，HRP标记的单抗1C5作为阻断抗体，建立了N蛋白阻断ELISA抗体检测方法，该方法与商品化的抗体检测盒相比，符合率达91.1%。

3）斑点免疫金渗滤法（DAGFA）。张吉红等^[10]将纯化的病毒抗原包被在硝酸纤维膜上，并利用胶体金标记显色，该方法与其他疾病无明显交叉反应，能够应用于临床大规模的流行病学调查中。

4）胶体金抗体检测（GICA）。孔玉方等^[11]通过标记阿卡斑病毒N蛋白，利用兔抗牛IgG和兔抗N蛋白多抗喷涂为检测线和质控线，制成了牛阿卡斑病毒胶体金抗体检测试纸条，该方法与商品化的ELISA试剂盒相比，符合率达92.6%，阳性抗体血清最高稀释倍数为1∶512。该方法无需特殊设备，操作简单，结果清晰易于判断，可应用于进出口检疫及基层防疫。

4.3 分子生物学技术

1）聚合酶链式反应（PCR）。PCR是1种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，是目前实验室检测病毒最为常用的方法之一。由于临床上经常出现多种边缘混合感染的情况，为了更好地对牛阿卡斑病进行诊断，鲍显伟等^[12]建立了能够同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒以及阿卡斑病毒的多重PCR检测方法，该方法对阿卡斑病毒的最低检出限为1×10⁴ copies/μL，同时检测结果与出入境检疫行业标准相比，符合率达92%。

2）逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。RT-PCR是1种将RNA逆转录为cDNA，再通过PCR扩增cDNA的技术，用于检测RNA分子的方法。尚佳富等^[13]针对阿卡斑病毒S序列的保守区设计特异性扩增引物，构建的pMD-AKAV重组质粒模板，建立了RT-PCR方法，这一方法的最低检出限为2.5×10³ copies/μL，为该病的诊断提供了新的方法。

3）环介导等温扩增技术（LAMP）。LAMP是利用1种链置换DNA聚合酶在等温条件保温30～60 min，完成核酸扩增的方法。该方法操作简单，灵敏度高，在基层的兽医临床检测中广为应用。张吉红等^[14]建立了RT-LAMP检测方法，该方法的灵敏度高、特异性好，能够鉴别赤羽病毒与牛病毒性腹泻黏膜病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等，最低检出限为11.5 copies/μL。各方法的优缺点如表1所示。

5 结 语

牛感染阿卡斑病毒后，大部分牛无明显临床症状，这给早期诊断带来了较大的困难。因此，除了继续研发特异性强、便于操作的诊断方法外，还应定期监测牛群感染状态，以减少因阿卡斑病导致的母牛流产、早产、产畸形胎带来的经济损失。

参考文献

[1] 王世荣,昝晓慧,巩彩风,赤羽病全球流行动态与防控策略[J].中国兽医学报,2023,43(5):1120-1126.

[2] 陈亮,张蕾,兰世捷,赤羽病研究进展[J].现代畜牧科技,2024(3):31-34.

[3] 乔军,陈创夫,任艳.赤羽病研究进展[J].塔里木大学学报,2008(3):103-106.

[4] 徐树兰.赤羽病病毒囊膜糖蛋白G1基因片段的克隆表达及间接ELISA诊断方法的建立[D].北京:中国农业科学院,2008.

[5] 孟锦昕.牛羊阿卡斑病毒血清学监测及病毒分离鉴定[D].昆明:云南农业大学,2017.

[6] 王世荣.赤羽病病毒的分离鉴定及间接ELISA抗体检测方法的建立[D].呼和浩特:内蒙古大学,2023.

[7] 黄生,林志雄,童昆周,赤羽病微量血清中和试验方法的建立与应用[J].中国畜禽传染病,1991(6):36-37.

[8] 刘晓波.牛赤羽病流行病学调查及抗体间接ELISA检测方法的建立[D].银川:宁夏大学,2023.

[9] 陈冬杰,魏方,李昊轩,赤羽病病毒N蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立及应用[J].中国动物传染病学报,2024,32(6):57-62.

[10] 张吉红,闻伟刚,唐泰山.斑点免疫金渗滤法检测赤羽病抗体的研究[J].经济动物学报,2010,14(3):139-142.

[11] 孔玉方,陈冬杰,王慧煜,牛赤羽病胶体金抗体检测试纸条的研制[J].饲料研究,2023,46(4):123-125.

[12] 鲍显伟,李昊,李小龙,BVDV、IBRV和AKAV多重PCR检测方法的建立与应用[J].中国兽医学报,2024,44(1):39-43.

[13] 尚佳富,李明科,徐婷婷,牛阿卡斑病RT-PCR检测方法的建立[J].贵州农业科学,2025,53(1):55-61.

[14] 张吉红,潘登,黄素文,赤羽病病毒RT-LAMP检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2013,35(10):829-832.