1株鸡源大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

Isolation, identification and drug resistance of a strain of chicken-origin E.coli

摘要

目的 为确定2024年11月末湖北省随州市某蛋鸡养殖场蛋鸡死亡的病因，并指导临床用药。 方法 采集病死蛋鸡的心脏、肝脏等病变组织样品，通过细菌分离培养、涂片镜检及生化鉴定进行菌落生长特性、形态的观察，通过PCR技术及动物试验检测16S rRNA扩增及攻毒动物生存情况进行测序分析和毒力鉴定，同时对分离菌株进行药敏试验，根据判定标准筛选特效治疗药物，指导临床用药方案。 结果 病死蛋鸡出现明显的包心包肝病理特征，细菌分离培养及鉴定结果均确定该试验分离菌株为致病性大肠杆菌，确诊该病例为大肠杆菌感染，且对氟苯尼考、氯霉素等10种抗生素完全耐药，但对多黏菌素B、氧氟沙星、诺氟沙星、哌拉西林、头孢曲松和头孢噻肟等高度敏感。 结论 分离菌株呈现多重耐药性，药敏试验结果可作为该养殖场的临床治疗用药参考。

Abstract

Objectives The cause for death of laying hens in a chicken farm in Suizhou City, Hubei Province at the end of November 2024 was determined to guide clinical medication. Methods Samples of diseased tissues including the heart and liver of dead laying hens were collected. The growth characteristics and morphology of bacterial colonies were observed through isolation and culture of bacteria, smear microscopy, and biochemical identification. PCR technology and animal experiments were used to detect the amplification of 16S rRNA and the survival of infected animals for sequencing analysis and toxicity identification. Experiments of drug sensitivity on isolated bacterial strains were conducted to screen specific therapeutic drugs based on judgment criteria and guide schemes of clinical medication. Results The dead laying hens had obvious pathological features of pericarditis and hepatitis. The results of isolation, culture and identification of bacteria showed that the strain isolated was pathogenic E.coli. The case was diagnosed as infection of E.coli. The strain was completely resistant to 10 antibiotics including florfenicol and chloramphenicol, but highly sensitive to polymyxin B, ofloxacin, norfloxacin, piperacillin, ceftriaxone and cefotaxime. Conclusions The strain isolated had multi-drug resistance. The results of the drug sensitivity experiment can be used as a reference for clinical medication in this farm.

Graphical abstract

关键词

大肠杆菌 / 耐药性 / 分离 / 鉴定 / 鸡

Key words

E.coli / drug resistance / isolation / identification / chicken

鸡大肠杆菌病（avian colibacillosis）是由致病性大肠杆菌（Escherichia coli）引起的全球性细菌性疾病，临床表现为败血症、肝周炎、心包炎、卵黄性腹膜炎等，严重威胁养禽业的健康发展^[1]。此外，致病性大肠杆菌可通过食物链或环境传播，其携带的耐药基因也可能对人类健康构成潜在威胁，使得该病原的防控兼具兽医临床和公共卫生意义。

随着集约化养殖模式的普及，该病的发病率逐年上升，已成为禽类细菌性疾病中最主要的病原之一，占细菌性疾病的33%以上^[2]。该病一年四季均可发生，但在冬季和春夏交替季节更容易暴发或加重，各日龄和品种的鸡都可感染大肠杆菌，以雏鸡多发，其发病率和死亡率也最高，蛋鸡受大肠杆菌影响也较为严重，临床多表现为输卵管炎及卵黄性腹膜炎，严重影响蛋鸡产蛋性能，甚至造成死亡。

近些年，鸡大肠杆菌病逐渐高发，抗生素也在养殖业中广泛应用，尤其是β-内酰胺类、喹诺酮类等，导致大肠杆菌耐药性问题日益严峻^[3]。因此，系统开展病原分离鉴定、药敏试验及耐药基因检测等，对指导临床精准用药、优化抗生素使用策略具有重要意义。本研究对随州市某蛋鸡养殖场病死鸡进行临床和实验室诊断，确诊为大肠杆菌感染，并测定分离菌株对抗生素的耐药性，旨在为蛋鸡养殖过程中感染大肠杆菌的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

来源于湖北省随州市某蛋鸡养殖场因卵黄性腹膜炎而死亡的产蛋鸡，病鸡在死亡前出现精神沉郁、羽毛松乱、喜卧厌动、冠髯苍白、消瘦、腹部膨胀下垂，产蛋率显著下降，采集病变心脏、肝脏、肠等作为试验病料。

1.2 主要试剂和仪器

超净工作台购自北京东联哈尔仪器制造有限公司；PCR仪购自德国Analytik公司；琼脂糖凝胶电泳仪购自北京六一仪器厂；凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；微生物生化培养箱购自上海精宏实验设备有限公司；2×Taq Master Mix、购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司；HBI大肠杆菌生化鉴定条购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.3 细菌的分离培养

无菌环境下，在病料中加入适量PBS进行充分研磨，10 000 r/min离心5 min，取其上清。使用无菌接种环蘸取研磨上清，在超净工作台中划线接种于麦康凯琼脂培养基和普通琼脂培养基平板上，倒置放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h。培养结束后，观察平板上菌落的生长情况。

1.4 革兰氏染色镜检及生化试验

挑取单个菌落并均匀涂抹于载玻片上，进行革兰氏染色及镜检，使用HBI大肠杆菌生化鉴定条进行生化鉴定。

1.5 引物设计与合成

根据NCBI GenBank数据库，利用Primer Premier 6.0设计16S rRNA通用引物^[4]（表1），并送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.6 细菌PCR鉴定

挑取6个单菌落接种于LB液体培养基，摇床培养24 h后进行菌液PCR扩增和测序分析。

1.7 动物实验

随机将10只2周龄健康白来航蛋鸡分为2组，试验组腹腔注射1.0×10⁷ CFU/mL培养菌液，攻菌剂量为0.2 mL/只，对照组以相同方式注射同等剂量的生理盐水，1周内观察试验鸡只的临床症状及生存情况。

1.8 药敏试验

采用纸片扩散法（K-B法）对19种常用药物进行药敏试验，药敏纸片之间的距离应≥24 mm，将平板放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h，测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 病料剖检

临床剖检（图1）可见，患病鸡全身呈多发性浆膜炎，以心包炎、气囊炎、肝周炎最为严重，心脏及肝脏表面覆盖膜状淡黄色胶冻样渗出物，呈现典型的“包心包肝”现象，气囊浑浊增厚，并覆盖淡黄色渗出物，肠道出血，腹腔内含有大量卵黄团块或碎块，并散发腥臭的异常气味。

2.2 菌落形态特征

在普通琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基上均观察到菌落生长（图2）。普通琼脂培养基上的菌落呈白色至灰白色，半透明或不透明，菌落形态为圆形，边缘整齐，表面光滑、湿润且有光泽；麦康凯琼脂培养基上的菌落呈粉红色至桃红色，非透明，菌落中心颜色较深，边缘颜色较浅，菌落形态为圆形，边缘整齐。

2.3 革兰氏染色镜检及生化鉴定

革兰氏染色及镜检可见菌株单个或多个排列堆积，菌体两端钝圆，呈红色短杆状（图3）。HBI大肠杆菌生化鉴定试验结果（表2）显示，靛基质试验和甲基红试验（MR）为阳性，V-P试验和枸橼酸盐试验则为阴性。根据试剂盒判定结果，该分离菌株符合大肠杆菌的生化特性。

2.4 PCR扩增鉴定

对分离菌株进行16S rRNA的PCR扩增鉴定，6个挑取的单菌落均可扩增出大小为1 500 bp左右的单一目的片段（图4），与预期大小一致。测序结果在GenBank进行BLAST比对分析显示，发现分离大肠杆菌菌株与OXEC-132株（登录号CP163888.1）、OXEC-517株（登录号CP163645.1）、RHB39-C23（登录号CP057038.1）等多株大肠杆菌同源性为100%，可以判定为大肠杆菌。

2.5 分离菌株毒力鉴定

试验组注射鸡只在48 h后开始出现死亡，注射后72 h全部死亡，剖检可见鸡心脏、肝脏和气囊均出现不同程度浆膜炎，呈现典型的“包心包肝”现象，而对照组鸡只一切正常（图5）。采集病变组织进行实验室检查，与上述细菌分离鉴定结果一致，表明分离的大肠杆菌具有一定的毒力，从而导致感染蛋鸡发病。

2.6 分离菌株的药物敏感性

分离菌株对氟苯尼考、氯霉素、四环素、克林霉素、麦迪霉素、复方新诺明、红霉素、庆大霉素、阿米卡星及链霉素完全耐药，对大观霉素、环丙沙星、青霉素G中等耐药，对多黏菌素B、氧氟沙星、诺氟沙星、哌拉西林、头孢曲松和头孢噻肟等高度敏感（表3）。

3 讨 论

目前，大肠杆菌仍然是最常见的细菌病原体之一，随着养禽业规模化、集约化养殖的不断发展，大肠杆菌病的发生日益频繁，饲养管理不善、卫生状况不良、气候突变、营养失衡以及其他应激因素均是该病发生的诱因^[5]。各日龄蛋鸡均可感染大肠杆菌，尤其以产蛋高峰期的蛋鸡最易发病，严重影响蛋鸡产蛋率，甚至停产或者造成大面积死亡。

近些年，蛋鸡大肠杆菌病与禽腺病毒病、新城疫、球虫病等疫病的混合感染频发^[6-9]，且抗生素的不合理使用导致耐药菌株在环境中传播，增加了细菌耐药问题的严重性，由于养殖场的抗生素用药情况不同，其耐药现象也具有较大差异。因此，当养殖场发生大肠杆菌病时，临床治疗应根据药敏试验结果科学用药，才可有效控制病情蔓延。

本研究从湖北省随州市某蛋鸡养殖场临床病料中分离出1株致病性大肠杆菌，并于2024年12月使用多种类别的抗生素进行药敏试验，结果发现分离菌株对不同类别或同一类别不同抗生素均表现出不同程度的耐药性，对氟苯尼考、氯霉素、四环素、克林霉素、麦迪霉素、复方新诺明、红霉素、阿米卡星及链霉素呈现完全耐药，对大观霉素、庆大霉素、环丙沙星、青霉素呈现中等耐药，而对多黏菌素B、氧氟沙星、诺氟沙星、哌拉西林、头孢曲松和头孢噻肟等高度敏感，这与实际养殖过程中抗生素的使用情况密切相关。

鸡源大肠杆菌由于来源不同其耐药性也存在较大差异^[10-11]，不同养殖场大肠杆菌流行情况不同，若养殖地区大肠杆菌病较为流行，且临床用药情况复杂，应进一步系统展开对大肠杆菌的分离，并鉴定其毒力强弱以及血清型分型，同时对分离菌株进行bla_TEM、qnrC、aaC2、oqxA、tetA、sul1、mcr-1等多种耐药基因的检测，从而为家禽养殖业规范和临床合理使用抗生素治疗大肠杆菌病提供更加详细的数据支持。此外，临床用药应注意蛋鸡须考虑药物残留问题和食品安全问题，严格遵守药物休药期，避免残留影响食品安全。

4 结 论

本研究通过对湖北省随州市某规模化蛋鸡养殖场的病鸡进行病原菌的分离鉴定及致病性试验，确定该养殖场蛋鸡因感染致病性大肠杆菌而发病，并对临床用药治疗作出指导，进而快速有效控制病情发展。

参考文献

[1] 王凤杰.蛋鸡大肠杆菌病的诊断技术与综合防治措施[J].当代畜牧,2024(12):82-83.

[2] KHAIRULLAH A R, AFNANI D A, RIWU K H P, et al. Avian pathogenic Escherichia coli: epidemiology, virulence and pathogenesis, diagnosis, pathophysiology, transmission, vaccination, and control[J]. Veterinary world,2024,17(12):2747-2762.

[3] TAN J, ZHANG F F, LI H Q, et al. Serotyping and identification of antimicrobial resistance genes in avian pathogenic Escherichia coli isolated from poultry flocks in Jiangxi Province, China[J/OL]. Foodborne pathogens and disease,published online December 4,2024.

[4] 刘硕琦,刘莹,孟子薇,猪源致病性大肠杆菌分离鉴定及毒力基因检测和耐药性分析[J].中国兽医学报,2025,45(5):940-947.

[5] WALIAULA P K, KIARIE E G, DIARRA M S. Predisposition factors and control strategies of avian pathogenic Escherichia coli in laying hens[J/OL]. Front Vet Sci,2024,11:1474549[2025-05-08].

[6] 赵伟伟.蛋鸡禽腺病毒与大肠杆菌混合感染的诊治[J].养殖与饲料,2024,23(2):77-80.

[7] 康志刚.蛋鸡新城疫与大肠杆菌混合感染的诊治[J].家禽科学,2024(10):105-107.

[8] 陈晓宽.产蛋鸡非典型新城疫继发大肠杆菌病的诊治[J].中国畜牧业,2023(22):107-108.

[9] 王晓琳.一例蛋鸡大肠杆菌和球虫混合感染的诊治与体会[J].家禽科学,2024(7):79-83.

[10] 刘挺,吕茜,赵文斌,江苏地区鸡源大肠杆菌的流行特征及耐药性调查[J].畜牧与兽医,2023,55(8):44-50.

[11] DE SOUSA D L C, LIMEIRA C H, CASELLA T, et al. Pooled prevalence of Escherichia coli phenotypic and genotypic antimicrobial resistance profiles in poultry: systematic review and meta-analysis. [J]. Braz J Microbiol, 2025,56(1):693-707.

[12] 崔云昊.禽源多黏菌素耐药大肠杆菌的筛选及高水平耐药机制研究[D].天津：天津农学院,2024.

基金资助

湖北省重大科技专项(2024BBA004)