基于磁微粒化学发光免疫分析方法的禽白血病病毒检测

Chemiluminescence immunoassay-based detection of avian leukemia virus

摘要

目的 建立1种检测禽白血病病毒的磁微粒化学发光免疫分析方法，为禽白血病的净化提供更高效的检测工具。 方法 采用双抗体夹心法原理，选用2株针对P27蛋白的单克隆抗体分别作为包被抗体和标记抗体，配套全自动化学发光分析仪，检测禽白血病病毒P27抗原参考阳性和参考阴性样本，系统优化包被抗体和标记抗体的工作浓度、反应时间、吸样量参数，并验证建立方法的特异性、最低检测限、重复性、加速稳定性、符合率。 结果 包被抗体和标记抗体的最佳工作浓度均为0.25 μg/mL，最佳反应时间为20 min，最佳吸样量为10 μL；建立的CLIA检测方法与其他禽类病原无交叉反应；用阴性细胞培养上清稀释样本时，最低检测限为1 pg/mL P27蛋白，用阴性蛋清稀释样本时，最低检测限为10 pg/mL P27蛋白；重复性试验中样本测值变异系数≤5%；试剂组分在2～8 ℃预估可保存12个月以上，与国产商品化ELISA试剂盒的总符合率达99.8%。 结论 本研究建立的禽白血病病毒磁微粒化学发光群特异抗原检测方法特异性高、灵敏度好，重复性、稳定性和准确度达到商品化试剂盒的标准，兼具自动化、操作简便的优势。

Abstract

Objectives A magnetic particle chemiluminescence immunoassay (CLIA) method was established for detecting avian leukemia virus to provide a more efficient detection tool for the purification of avian leukemia. Methods 2 monoclonal antibodies of P27 protein were used as the coating antibody and the labeling antibody with the principle of double antibody sandwich method, respectively. A fully automatic chemiluminescence analyzer was equipped to detect reference positive and reference negative samples of avian leukemia virus P27 antigen. The working concentration, reaction time, and sample volume parameters of coated and labeled antibodies were systematically optimized. The specificity, minimum detection limit, repeatability, accelerated stability and compliance rate of the established method were verified. Results The optimal working concentration for both coated and labeled antibodies was 0.25 μg/mL, with the optimal reaction time of 20 min and the optimal sample suction volume of 10 μL. The established CLIA had no cross-reaction with other avian pathogens. When diluting samples with negative cell culture supernatants, the minimum detection limit was 1 pg/mL of P27 protein. When diluting samples with negative egg whites, the minimum detection limit was 10 pg/mL of P27 protein. The coefficient of variation of the sample measured in the repeatability test was ≤5%. The reagent components can be stored at 2 to 8 ℃ for more than 12 months, and the total coincidence rate with domestic commercial enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kits reached 99.8%. Conclusions The method established for detecting group-specific antigens of avian leukemia virus has high specificity, good sensitivity. Its repeatability, stability and accuracy meet the standards of commercial kits, and has the advantages of automation and simple operation as well.

Graphical abstract

关键词

禽白血病病毒 / P27蛋白 / 磁微粒化学发光免疫分析 / ELISA

Key words

avian leukemia virus / P27 protein / magnetic particle chemiluminescence immunoassay (CLIA) / enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

禽白血病（avian leucosis，AL）是由禽白血病病毒（avian leukosis virus，ALV）感染引起的传染性肿瘤性疾病^[1]，ALV属于逆转录病毒科（Retroviridae），根据其宿主范围以及囊膜蛋白GP85的特异性，目前已鉴定出A～K共11种亚群，其中A、B、C、D、E、J、K亚群能够感染禽类^[2]，E亚群属于内源性病毒^[3]，不具有致病性或者致病力很低，其他6个亚群均具有致病性。ALV是单股正链RNA病毒，基因组的长度约为7.5 kb，从5′端至3′端依次为U3-R-U5-gag-pol-env-U3-R-U5-，Gag、Pol、Env基因分别编码特异性抗原与蛋白酶、RNA依赖性DNA聚合酶和囊膜糖蛋白^[4]。其中，Gag基因高度保守，编码1种多蛋白，翻译后被裂解为基质蛋白P19、附加蛋白P10、P2、衣壳蛋白P27、核衣壳蛋白P12和蛋白酶P15^[5]。包括内源性和外源性ALV亚群在内的所有成员共有的结构多肽（P2、P10、P12、P19和P27）中，群特异抗原P27蛋白不仅含量最为丰富^[6]，且具有高度的保守性。因此，P27蛋白是检测ALV感染的最理想靶标。

ALV感染不仅会诱发死亡，还会对产蛋率、受精率和孵化率等重要生产指标产生不良影响^[7]，且ALV可通过种蛋进行垂直传播^[8]。目前，尚无有效的疫苗和药物用于禽白血病的防治，该病给我国禽养殖业造成了较大的经济损失，严重危害了我国养鸡业的健康发展，被列为我国种禽场必须要实现净化的主要禽病之一。自2008年实施AL净化计划以来，该病的大规模流行已得到有效控制^[9]，其中基于群特异抗原P27的检测技术在这一净化过程中发挥了关键作用。

在现有的ALV检测方法中，以P27抗原为靶标的ELISA检测技术应用最为广泛。然而，该方法在灵敏度和检测线性范围方面有一定局限性，且对操作人员的专业技能要求较高。随着我国种禽业向规模化、标准化方向发展，建立1种灵敏度更高、准确度更好，且能实现自动化的检测平台成为当前检测技术发展迭代的重要需求。磁微粒化学发光免疫分析（magnetic particle chemiluminescence immunoassay, CLIA）是将磁微粒包被体系、化学发光体系与免疫反应相结合，用于抗原或抗体检测的1种新型标记免疫测定技术。化学发光是指特定化学发光物质在特定化学反应中接收能量后，形成激发态中间体，而激发态中间体不稳定，会通过光的形式释放多余能量回到基态，从而产生光辐射的现象，这些光信号在全自动化学发光分析仪中通过光电倍增管等组件收集并记录，光信号强度与反应当量成正比。磁微粒化学发光检测的原理与ELISA相似，均为基于抗原抗体的特异性与高亲和力反应，在此基础上引入了磁微粒包被技术以及化学发光系统，从而提升了检测的灵敏度和线性范围，并且实现了“样本进/结果出”的自动化检测流程，减少了人工误差，适合大规模的检测筛查。本试验通过研究并建立1种灵敏度高、特异性好且能实现检测流程自动化的ALV P27抗原检测CLIA方法，旨在为有效防控和净化AL提供更好的检测技术平台。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）主要试剂。禽白血病病毒单克隆抗体8E9和1F8由唯泰科生物科技（武汉）有限公司采用293细胞表达系统进行重组表达并保存；羧基磁珠（MS160）购自JSR；吖啶酯NSP-SA-NHS（货号：DS003）购自德晟生化；禽白血病病毒ELISA群特异抗原检测试剂盒购自国生生物（批号：20241012）；P27重组蛋白由唯泰科生物科技（武汉）有限公司用大肠杆菌表达纯化。

磁珠稀释液为含50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、0.5% BSA、0.5%吐温20、0.1% Proclin-300的水溶液（pH 7.4）；吖啶稀释液为含50 mmol/L PBS、1% BSA、0.5% S9(Tetronic1307)、0.1% Proclin-300的水溶液（pH 6.0）；洗涤缓冲液为含有25 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl和0.1%吐温20的水溶液（pH 7.2）；预激发液为含有0.1% H₂O₂和0.1 mol/L HCl的水溶液；激发液为含有0.2 mol/L NaOH和2% Triton X-100的水溶液。

2）主要仪器。全自动化学发光免疫分析仪（型号：VT4500）由科来思生物科技（重庆）有限公司定制生产。

1.2 样品的处理

1）蛋清样本。取全蛋，去除蛋壳外污物，敲开后将蛋清置于适当容器中，避免蛋黄混入，向其中加入等体积前处理液，混匀静置后即可进行检测。

2）胎粪样本。将刚出壳雏鸡的胎粪挤入加有0.5 mL样本保存液的离心管中，编号后充分振荡混匀，置于液氮中快速冷冻后取出，放于37 ℃水浴锅中回温，反复冻融3次，使禽白血病病毒抗原充分释放，将样本于4 ℃、10 000 r/min离心1 min，取上清进行检测。需在当天完成检测。

3）细胞培养上清。无菌采集鸡只EDTA抗凝血并分离血浆，接种易感细胞（CEF细胞），置于37 ℃、5% CO₂培养箱中吸附2 h，弃上清，加入细胞维持液，继续培养9 d，收集细胞培养上清，4 ℃、12 000 r/min离心1 min，取上清即可用于检测。

无菌采集公鸡精液，稀释后，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清接种易感细胞（CEF细胞），同上述操作。

1.3 P27单克隆抗体8E9包被羧基磁珠

首先，取羧基磁珠到离心管中，于磁力架上进行磁分离，去上清，用100 mmol/L MES缓冲液（pH 5.0）清洗磁珠3次。100 mmol/L MES缓冲液（pH 5.0）重悬磁珠，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基磺基琥珀酰亚胺（sulfo-NHS）至终质量浓度为2.5 mg/mL，室温反应30 min。然后，清洗磁珠3次，用含0.05%吐温20的100 mmol/L MES缓冲液（pH 5.0）重悬磁珠，加入单克隆抗体8E9，混匀后室温反应2 h。最后，清洗磁珠3次，加入磁珠稀释液，置于2～8 ℃保存。

1.4 吖啶酯标记P27单克隆抗体1F8

取50 μL单克隆抗体1F8（质量浓度2 mg/mL）溶液于棕色离心管中，加入35 μL 0.02 mol/L PBS，混匀。再加入用二甲基亚砜（DMSO）溶解的5 mmol/L吖啶酯溶液15 μL，混匀。短暂离心，避光、1 500 r/min室温标记2 h。将吖啶酯标记的抗体短暂离心后装入透析袋中，用0.02 mol/L PBS作为透析缓冲液，期间每4 h更换1次透析液，透析液更换3次后，回收标记物，避光保存备用。

1.5 化学发光检测程序

采用一步法模式进行检测。向反应杯中依次加入10 μL待测样品、50 μL磁珠组分工作液、50 μL吖啶组分工作液，混匀4 s，孵育20 min；洗去未结合的物质，向反应杯中加入100 μL预激发液和100 μL激发液，检测发光值（RLU）。

1.6 反应条件的优化

1）磁珠组分与吖啶组分工作剂量优化。稀释8E9包被的羧基磁珠至1.00、0.50、0.25 μg/mL，稀释吖啶酯标记的单克隆抗体1F8至0.25、0.10、0.05 μg/mL，用“棋盘法”组合配对，检测参考阴性样本和参考阳性样本（细胞培养上清样本），读取RLU值，计算P/N（P为阳性样本RLU值，N为阴性样本RLU值），当P/N值最大时，即为磁珠组分与吖啶组分最佳工作浓度。

2）孵育时间的优化。将孵育时间设置为40、30、20、10 min，同时检测参考阴性样本和参考阳性样本，读取RLU值，计算P/N，P/N值最大时，即为最佳孵育时间。

3）吸样量的优化。将吸样量分别设置为10、20、30 μL，同时检测参考阴性样本和参考阳性样本，读取RLU值，计算P/N，当P/N值最大时，即为最佳吸样量。

1.7 阈值的划定

采用本研究建立的CLIA方法检测79例禽白血病阳性样本和1 147例禽白血病阴性样本（包含蛋清和胎粪样本），以特异性为横坐标、敏感度为纵坐标，建立直角坐标系来绘制ROC（receiver operating characteristic）曲线。通过计算曲线下面积（AUC），选取AUC值最大时对应的检测值作为阈值线（cut-off值），使本方法在检测中达到最佳的灵敏度和特异性平衡。

1.8 特异性试验

用上述磁微粒化学发光方法检测禽流感病毒阳性样本（重组禽流感病毒三价灭活疫苗，广州市华南农大生物药品有限公司）、禽痘病毒阳性样本（鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗，青岛易邦生物工程有限公司）、新城疫病毒阳性样本（鸡新城疫活疫苗，青岛易邦生物工程有限公司）、禽白血病病毒阳性样本（唯泰科生物科技（武汉）有限公司保存）和禽白血病病毒阴性样本（唯泰科生物科技（武汉）有限公司保存）。

1.9 最低检测限

将P27蛋白用阴性细胞培养上清基质和阴性蛋清基质分别稀释至500.0、250.0、100.0、50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5 pg/mL，同时用阴性细胞培养上清基质和阴性蛋清基质作为阴性对照，用上述已建立的CLIA方法与商品化禽白血病病毒ELISA群特异抗原检测试剂盒分别检测，比较其最低检测限。

1.10 重复性试验

取3份加标样本，其中强阳性1份，中阳性1份，阴性1份，用上述磁微粒化学发光方法检测，平行测定10次，计算样本发光值的平均值、标准差（SD）和变异系数（CV），其CV应≤10%。

1.11 试剂加速稳定性试验

将本研究磁珠组分工作液和吖啶组分工作液置于37 ℃培养箱放置4、7、10、14 d，测定同一组样本，分别计算不同时间点相对于0 d测定值的偏差。

1.12 符合率试验

取1 147份禽白血病阴性样本和79份禽白血病阳性样本（包含蛋清和胎粪样本），用上述已建立的CLIA方法与商品化禽白血病病毒ELISA群特异抗原检测试剂盒分别检测，计算2种方法的符合率。

2 结果与分析

2.1 磁珠组分与吖啶组分最佳工作浓度的确定

磁珠组分与吖啶组分最佳工作浓度是影响免疫反应灵敏度的关键参数。用“棋盘法”将不同浓度的磁珠组分和吖啶组分两两配对检测阴阳性参考样本，将P/N作为评价指标。结果如表1所示，当磁珠组分工作质量浓度为0.25 μg/mL，吖啶组分工作质量浓度为0.25 μg/mL时，P/N值最大，即为最佳工作浓度。

2.2 最佳孵育时间的确定

在已经优化的磁珠和吖啶组分工作浓度条件下，评估最佳孵育时间，结果如表2所示，当孵育时间为20 min时，P/N值最大，因此最佳孵育时间为20 min。

2.3 最佳吸样量的确定

在已经优化的磁珠和吖啶组分工作浓度和最佳孵育时间条件下，评估最佳的样本加样量，结果如表3所示，随着加样量的增大，阴阳性样本的RLU均有上升，P/N值降低，吸样量为10 μL时，P/N值最大，因此确定最佳吸样量为10 μL。

2.4 阈值的测定

用本研究建立的CLIA方法检测79份禽白血病阳性样本和1 147份禽白血病阴性样本（包含蛋清和胎粪样本），ROC曲线如图1所示，曲线下面积（AUC）为0.999，此时，CLIA的阈值即Cut-off值（简写为Co）为15 763，当样品发光值/Co（S/Co）≥1时，样品判定为阳性，当S/Co＜1时，样品判定为阴性。

2.5 特异性试验结果

为评价上述CLIA方法的特异性，用该方法检测禽流感病毒阳性样本、禽痘病毒阳性样本、新城疫病毒阳性样本、禽白血病病毒阳性样本和禽白血病病毒阴性样本。结果如表4所示，除禽白血病病毒阳性样本S/Co≥1外，其余样本S/Co均小于1，可知本研究所建立的CLIA方法特异性良好。

2.6 最低检测限的测定结果

为评价本研究所建立的CLIA方法的最低检测限，将阳性标准品（P27蛋白）分别用ALV阴性细胞培养上清和ALV阴性蛋清进行稀释，用本研究所建立方法和商品化禽白血病病毒ELISA群特异抗原检测试剂盒（S/P值大于0.2判为阳性）分别检测。结果如表5所示，以细胞培养上清为样本基质时，ELISA试剂盒最低检测限为5 pg/mL，本研究所建立方法最低检测限1 pg/mL。以蛋清为样本基质时，ELISA试剂盒最低检测限为25 pg/mL，本研究所建立方法最低检测限10 pg/mL。

2.7 重复性试验结果

为了评价所建立的CLIA方法的重复性，取3份已知背景的样本进行测定，平行测定10次，计算变异系数。结果如表6所示，同一样本重复测试结果的变异系数均在5%以内，表明该方法重复性良好。

2.8 试剂加速稳定性试验结果

试剂组分的稳定性是评价试剂性能的重要指标之一，试剂通常存储于2～8 ℃，本研究采用将磁珠组分工作液和吖啶组分工作液放置于37 ℃的条件下进行加速稳定性试验。结果如表7所示，37 ℃加速到14 d仍然有88.35%及以上的保留率，根据阿伦尼乌斯方程原理推算，试剂组分在2～8 ℃的保存期预估超过12个月。

2.9 符合率试验结果

取1 147份禽白血病阴性样本和79份禽白血病阳性样本（包含蛋清和胎粪样本），用本研究已建立的CLIA方法与商品化禽白血病病毒ELISA群特异抗原检测试剂盒分别检测，结果如表8所示，二者阴性符合率为99.7%，阳性符合率为100%，总符合率为99.8%。

3 讨 论

AL给养殖业带来了巨大的经济损失，ALV群特异抗原P27的检测为AL防控和净化提供了关键的技术支撑，检测方法的准确度和灵敏度对于AL净化的效率至关重要。陈晨等^[10]采用原核表达的P27蛋白制备的单克隆抗体作为包被抗体，兔抗P27为酶标抗体，建立的双抗体夹心ELISA方法检测ALV抗原，对P27抗原的最小检出量为5 ng/mL。贠炳岭等^[11]采用原核表达的P27蛋白制备的单克隆抗体作为包被抗体，P27蛋白制备的多克隆抗体为检测抗体，建立了双抗体夹心ELISA方法，对P27的最小检出量为1.25 ng/mL。

我国自2008年启动的AL净化工程，基于传统的ELISA方法，已取得显著成效。但传统ELISA与新兴的磁微粒CLIA检测方法相比，检测灵敏度有提升的空间，且ELISA有操作步骤多、检测时间较长、人为操作存在误差等问题。随着人力成本增加以及高通量检测需求增加，自动化程度高、灵敏度更好的磁微粒CLIA检测方法成为替代ELISA的必然趋势。

本研究基于双抗体夹心法原理，以ALV群特异抗原P27作为检测靶标，P27特异性单克隆抗体8E9和1F8作为包被抗体和标记抗体，成功建立了一步法CLIA检测方法。该方法用阴性细胞培养上清稀释样本时，最低检测限为1 pg/mL靶标蛋白，用阴性蛋清稀释样本时，最低检测限为10 pg/mL靶标蛋白，相较于商品化ELISA试剂盒，其灵敏度更高，所建立的CLIA配套全自动化学发光免疫分析仪，实现了ALV P27检测流程的全自动化，有效缩短了检测时间，并显著降低了人工操作误差。重复性试验表明该方法具有良好的重复性和结果再现性。此外，加速稳定性试验结果表明，试剂组分在2～8 ℃的保存期预估可以达到12个月以上。

为了保证所建立方法的特异性，本研究选用单克隆抗体作为包被抗体和标记抗体，与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更高的特异性、均一性，并支持大规模、多批次稳定的生产。采用磁珠而非96孔板作为抗体原料的载体，其显著优势在于磁微粒具有更大的比表面积，磁微粒悬液形式提供了独特的三维表面结构，能提供更多的抗原结合位点。同时，磁分离技术能有效去除反应体系中的杂质干扰，从而进一步提高检测的灵敏度和特异性。

综上所述，本研究建立了1种特异性高、灵敏度好、重复性好且稳定性高的禽白血病病毒磁微粒化学发光方法。该方法相较于传统的ELISA具有更高的灵敏度，检测流程自动化使其优势更加突出，具有较好的市场应用前景，可更高效的服务于种禽场AL的净化和监测。

参考文献

[1] FADLY A M.Isolation and identification of avian leukosis viruses: a review[J]. Avian pathology，2000，29(6)：529-535.

[2] PAYNE L N， NAIR V.The long view：40 years of avian leukosis research[J]. Avian pathology，2012，41(1)：11-19.

[3] ADKINS H B， BLACKLOW S C， YOUNG J A.Two functionally distinct forms of a retroviral receptor explain the nonreciprocal receptor interference among subgroups B, D, and E avian leukosis viruses[J]. Journal of virology，2001，75(8)：3520-3526.

[4] CHANG S W， HSU M F， WANG C H. Gene detection, virus isolation, and sequence analysis of avian leukosis viruses in Taiwan country chickens[J].Avian diseases，2013， 57(2)：172-177.

[5] ZHU F，JIE H， LIAN L，et al ．Avian sarcoma and leukosis virus gag gene in the Anser anser domesticus genome[J]．Genetics and molecular research，2015，14(4)：14379-14386.

[6] YANG K M， YANG J H， ZHOU D F，et al. Interaction of p10/p27 with macrophage migration inhibitory factor promotes avian leukosis virus subgroup J infection[J/OL]. Veterinary microbiology，2022，267：109389[2025-05-08].

[7] 赵方钰.不同检测方法在禽白血病净化检测中的应用与比较[D].泰安：山东农业大学，2024.

[8] MAYS J K， BLACK-PYRKOSZ A， MANSOUR T，et al ．Endogenous avian leukosis virus in combination with serotype 2 Marek’s disease virus significantly boosted the incidence of lymphoid leukosis-like bursal lymphomas in susceptible chickens[J/OL]．Journal of virology，2019，93(23)：e00861-19[2025-05-08].

[9] 董明奇.禽白血病的诊断技术研究进展[J].畜牧兽医科技信息，2023(5)：36-39.

[10] 陈晨，曹红，金英杰，等.禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立和标化[J].中国预防兽医学报，2005(6)：97-101.

[11] 贠炳岭，刘文，李德龙，等.禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J].中国兽医科学，2012，42(9)：916-920.