犬NK细胞分型及其在肿瘤免疫治疗中的应用进展

Typing NK cells in dogs and progress of its application in immunotherapy of dog tumor

摘要

目的 为老年犬肿瘤治疗提供新方向，推动犬肿瘤免疫治疗的转化落地。 方法 系统综述了犬NK细胞的分型研究进展，包括候选标志物CD5与Nkp46的鉴定及其与细胞成熟度的关联，并通过转录组学分析揭示了犬NK细胞与人类基因的高度同源性。 结果 犬NK细胞的分型与功能特性显著区别于人类及小鼠，其不表达CD56与CD16，目前主要定义为非T、非B的大颗粒淋巴细胞。在体外扩增方面，基于同源细胞因子（如rcIL-15与rcIL-21）联合饲养层共培养的策略可显著提升NK细胞的增殖效率与细胞毒性。临床前研究表明，犬NK细胞过继治疗对骨肉瘤和乳腺肿瘤具有显著疗效：瘤内注射扩增的NK细胞联合放疗可延长患犬生存期（最长17.9个月），而NK细胞来源的外泌体亦可抑制肿瘤生长并降低促炎因子表达。 结论 犬NK细胞作为先天免疫系统的关键组分，因其异体输注安全性高（无移植物抗宿主反应）及与化疗的协同效应在肿瘤免疫治疗中展现出重要潜力。

Abstract

Objectives New directions for the treatment of tumors in elderly dogs were provided to facilitate the translation of immunotherapy of dog tumor into practice. Methods The progress of typing natural killer (NK) cells in dogs including the identification of candidate markers CD5 and Nkp46 and their association with cell maturity was systematically reviewed. Transcriptomic analysis was used to study the degree of homology between NK cells in dogs and human. Results The typing and functional characteristics of NK cells in dogs are distinct from those in humans and mice. NK cells in dogs do not express CD56 and CD16, and are mainly defined as non-T and non-B large granular lymphocytes at present. In terms of in vitro amplification, the strategy of co-culturing NK cells with homologous cytokines including rcIL-15 and rcIL-21 in the feeder layer can significantly improve the proliferation efficiency and cytotoxicity of NK cells. The results of preclinical studies showed that adoptive therapy of NK cells in dogs has significant therapeutic effects on osteosarcoma and breast tumors. Intra-tumoral injection of expanded NK cells combined with radiotherapy can prolong the survival of affected dogs (up to 17.9 months), while NK cell-derived exosomes can also inhibit tumor growth and reduce the expression of pro-inflammatory cytokine. Conclusions NK cells in dogs, as the key component of the innate immune system, have shown significant potential in tumor immunotherapy due to their high safety of allogeneic infusion (no graft-versus-host disease, GVHD) and synergistic effect with chemotherapy.

关键词

自然杀伤细胞 / 犬肿瘤免疫治疗 / 细胞分型 / 体外扩增 / 过继治疗

Key words

natural killer (NK) cells / immunotherapy of dog tumor / cell typing / in vitro amplification / adoptive therapy

近年来，犬肿瘤疾病的患病率逐步上升，已成为临床上导致犬死亡常见的疾病之一，严重威胁犬类健康。手术疗法、放射治疗及化学疗法等传统肿瘤治疗手段虽然能在一定程度上改善犬的生存及预后，但病犬的生活质量依旧难以保证^[1]。肿瘤免疫治疗是1种新兴的肿瘤治疗方式，主要通过激活或调动机体的免疫功能，增强机体对肿瘤的抵抗力，从而控制肿瘤发展和杀死肿瘤细胞^[2]。免疫细胞过继治疗是肿瘤细胞免疫疗法的一大热点，通过过继转移T细胞、树突状细胞、NK细胞等免疫细胞到患者体内以恢复癌症导致的免疫细胞数量减少以及免疫抑制导致的免疫功能抑制^[3]。其中，自然杀伤细胞（NK细胞）作为机体抗感染和抗肿瘤的第一道防线而广泛受到人们的关注，其不需要抗原预先致敏即可杀死肿瘤细胞，且同种异体过继治疗不会引起移植物抗宿主反应（GVHD）^[4]。因此，NK细胞在肿瘤免疫治疗领域有较好的发展前景。

NK细胞在人以及小鼠中有不少的研究，但犬NK细胞的报道较少，尽管犬的主要免疫系统亚群已经被证明与人类和其他哺乳动物具有显著的同源性^[5]，但犬NK细胞与人类以及小鼠的NK细胞存在较大的差异，特别是在分型上，犬NK细胞不表达CD56，与人类截然相反^[6]。此外，犬NK细胞相关的表面标志物特异性抗体的缺乏也阻碍了犬NK细胞的研究进程。鉴于犬NK细胞在临床上应用的巨大潜力，本文对犬NK细胞分型及其在肿瘤免疫治疗中的应用进行综述，以期为犬NK细胞的研究、开发及临床应用提供理论依据。

1 犬NK细胞的定义及分型

犬NK细胞的分型研究是一项长期的课题，由于相关的表面标志物缺少特异性的抗体，加大了犬NK细胞分型鉴定的困难^[7]。人类以及小鼠的NK细胞有明确的定义，人类的NK细胞不表达T细胞受体（TCR）以及CD3，并根据CD56以及CD16的相对表达将NK细胞分为CD56^bright CD16^low/-（免疫调节，产生细胞因子）以及CD56^dim CD16⁺（细胞毒型）两类细胞群^[8]。小鼠的NK细胞因品系与血统不同而有所差异，C57BL/6以及瑞士Jim Lambert(SJL)小鼠的NK细胞表达NK1.1、CD49b以及Nkp46，而BALB/c小鼠只表达CD49b和Nkp46。值得注意的是，不管是人类还是小鼠，必须是CD3阴性表达的细胞才能被归类为NK细胞，因为CD3是T细胞和NK T细胞的表面标志物^[9]。

犬NK细胞的定义与分型虽然不如人类和小鼠的完善，但是关于其研究一直在进行。犬NK细胞不表达人NK细胞的表面标志物CD56以及CD16，Shin等^[10]使用IL-21、IL-2、IL-15联合诱导得到犬NK细胞，通过RT-qPCR检测了CD56以及CD16的表达水平，结果表明犬NK细胞在21 d培养时间内，CD56的mRNA表达水平没有发生明显变化，CD16的mRNA表达水平持续下调。因此，犬NK细胞与人NK细胞不同，不能使用CD56以及CD16进行定义。到目前为止，犬NK细胞被简单定义为非T、非B细胞的大颗粒淋巴细胞。经过不断研究，犬NK细胞的候选分型标志物有2个，分别为CD5和Nkp46^[11]。在犬的外周血单个核细胞（PBMC）中，CD5^bright细胞群被归类为T细胞^[12]，而CD5低表达的细胞群体则被认为是NK细胞^[13]。Huang等^[13]从外周血单个核细胞中分选出CD5^lo细胞，在IL-2的刺激下，CD5^lo细胞对犬甲状腺肿瘤细胞（CTAC）表现出明显的杀伤作用，在形态上，CD5^lo细胞比CD5^bright大，且胞浆含有更多颗粒。经流式细胞术鉴定，CD5^lo细胞的分型为CD3⁺ CD4^+/－ CD8α^+/－ CD8β^+/－ CD21^－ CD14^－ α/βTCR^+/－ γ/δTCR^－ CD11/18⁺ MHC Ⅰ⁺ MHCⅡ⁺，RT-qPCR结果表明，NK细胞相关受体及激活标志物（Nkp30、Nkp44、NKG2D、CD94、穿孔素、颗粒酶）等mRNA表达水平升高。CD5的表达情况与NK细胞的成熟程度有关，Lee等^[14]对犬非B、非T自然杀伤细胞（CD3^－ CD5^－ CD21^－）和大颗粒淋巴细胞（CD3⁺ CD5^dim CD21^－）的分型以及功能特性存在差异，结果表明CD3^－ CD5^－ CD21^－和CD3⁺ CD5^dim CD21^－细胞均含有NK细胞亚群，其差异可能与NK细胞的成熟程度有关，CD3⁺ CD5^dim CD21^－细胞可在细胞因子的刺激下通过分型调节分化为CD3^－ CD5^－ CD21^－细胞。值得注意的是，CD3是犬T淋巴细胞的表面标志物，大颗粒淋巴细胞（CD3⁺ CD5^dim CD21^－）虽然表达CD3，但被认为是NK细胞而不是NKT细胞，因为它不表达TcR αβ、TcR γδ等T细胞受体。

Nkp46（NCR1，CD335）作为犬NK细胞另一种候选的表面标记，是一种天然的细胞毒性受体，属于免疫球蛋白超家族，被认为是哺乳动物“泛物种”的NK细胞标志物^[15-16]。CD3^－Nkp46⁺细胞在人类^[9]、猴^[17]、小鼠^[18]、牛^[19]、绵羊^[20]等动物中被定义为NK细胞，但以Nkp46对NK细胞进行定义也存在一定的异议，因为Nkp46等天然细胞毒性受体也在某些T细胞亚群中表达^[21]。Grondahl-Rosado等^[22]第1次对Nkp46在犬身上的表达进行检测，发现犬的血液以及组织内也有CD3^－Nkp46⁺细胞群的存在，并被进一步鉴定为CD56^－GranzymeB⁺CD8^－，73%～98%的细胞表达颗粒酶B，表明这些细胞具有杀伤能力。Foltz等^[23]研制了1种抗犬Nkp46的抗体并用于犬NK细胞的纯化以及进一步鉴定，证明了健康和带骨肉瘤犬的CD3^－Nkp46⁺细胞群与人的CD3^－Nkp46⁺细胞群具有相似的表征，表达Nkp30、Nkp44、Nkp80等NK细胞天然受体以及CD16，并通过钙黄素释放试验证明犬CD3^－Nkp46⁺细胞在没有预先致敏的情况下杀伤犬骨肉瘤细胞。由此可见，Nkp46无疑是1种重要的NK细胞受体^[24]，但是由于缺乏商业化抗体，阻碍了Nkp46在NK细胞鉴定上的运用。

2 犬NK细胞的生物学特性与遗传特性

在形态上，NK细胞属于大颗粒淋巴细胞，直径为12～15 μm，比T细胞和B细胞大，并且含有独特的细胞质颗粒^[25]。犬NK细胞体积比人类的小，Huang等^[13]通过透射电镜观察发现，在IL-2刺激后，CD5^lo细胞的直径为（6.04±0.81） μm，其胞浆内出现大量致密的颗粒。在功能上，NK细胞以细胞毒性以及细胞因子效应而闻名，它能在无抗原预先致敏的情况下杀死靶细胞。在NK细胞杀伤靶细胞的过程中，NK细胞能识别Ⅰ类主要组织相容性复合物（MHCⅠ）下调或缺乏的衰老细胞、肿瘤细胞以及病毒感染细胞^[26]，并通过脱颗粒作用，释放大量的穿孔素和颗粒酶直接杀伤靶细胞^[27]。另外，NK细胞还能介导抗体依赖性细胞毒作用（ADCC），NK细胞表面的FcγRⅢ（CD16）能与肿瘤细胞特异性抗体IgG上的FC片段结合，杀伤与IgG特异性结合的肿瘤细胞^[28]。Park等^[29]研究了犬CD3^- CD5^- CD21^- NK细胞对犬瘟热病毒（CDV）感染的Vero细胞的细胞毒作用，发现犬NK细胞对正常和CDV感染的Vero细胞都有剂量依赖性的细胞毒作用，但犬NK细胞对CDV感染的Vero细胞更敏感，杀伤率为（42.5±7.0）%。Michael等^[30]通过⁵¹Cr释放试验研究了犬NK细胞对犬甲状腺肿瘤细胞（CTAC）的细胞毒作用，通过IL-2和IL-15培养的犬NK细胞对CTAC在靶效比为1∶20时的杀伤率高达70%。另外，活化的NK细胞还能分泌γ-干扰素（IFN-γ）、α-肿瘤坏死因子（TNF-α）等促炎因子间接导致靶细胞死亡。在犬乳腺肿瘤细胞与犬CD5^lo细胞的共培养上清中，IFN-γ的释放量显著增加，提示活化的犬CD5^lo细胞具有NK细胞特征^[31]。

NK细胞的基因组在人类以及鼠类中已经得到广泛研究，并且已被证明在某些基因的表达上存在较大的差异，比如识别MHCⅠ类分子的NK细胞抑制性受体，人类NK细胞表达的是NK细胞杀伤免疫球蛋白样受体（KIR），而啮齿动物（小鼠和大鼠）NK细胞缺乏KIR，表达凝集素样二聚体（Ly49），与KIR具有相同的功能^[32]。可见，不同物种NK细胞相关基因的表达存在一定的差异。犬NK基因复合物（NKC）位于27号染色体的1个区域内，并与Ⅴ组和Ⅱ组蛋白相邻。在犬NKC的C型凝集素基因中，犬的基因组编码Ⅴ组蛋白（识别与结合MHCⅠ类分子的NK细胞受体）和Ⅱ组蛋白（不在NK细胞上表达），犬NKC的基因长度为2.4 Mb，并且具有22个NKC基因^[33]。Gagnier等^[34]对犬的基因组进行了部分研究，通过Southern印迹技术确定了犬的27号染色体的NKC上有Ly49基因，但Ly49基因的功能尚不清楚。Judge等^[35]使用高通量RNA测序技术和生物信息学分析对犬NK细胞转录组进行了分析，经过饲养层（K562细胞）共培养后，激活的犬NK细胞的转录本显示出多个NK基因的诱导表达，包括细胞毒性、细胞因子以及NKC基因的表达，GZMA、GZMB、IFNG和PRF1等经典细胞毒标志物上调，而CD16表达减少。同时，对比了犬CD5^－和CD3^－CD46⁺ 2个细胞群的转录图谱，发现在静息状态下CD3^－Nkp46⁺细胞群表现出NKC基因高表达，包括KLRB1/NK1.1和KLRK1/NKG2D，CD96、CD226、24B、GZMB等经典NK细胞基因也明显上调，而这些基因在CD5^－细胞群中的表达要低得多，但经过14 d的饲养层共培养激活后，CD5^－和CD3^－CD46⁺细胞群NK细胞相关基因的表达基本相似^[35]。另外，Gingrich等^[6]对犬、人类和小鼠的NK细胞的免疫基因组学进行了跨物种分析，结果表明，犬和人类共享156个诱导基因和190个抑制基因，而人类和小鼠共享59个诱导基因和69个抑制基因，表明犬NK细胞与人类的NK细胞相似性更高。这在一定程度上填补了犬NK细胞在基因与遗传方面研究的空缺，为犬NK细胞深入研究提供了理论依据。

3 犬NK细胞的体外扩增及其在肿瘤免疫治疗中的应用

NK细胞的来源广泛，在人的NK细胞体外扩增中，最佳的来源是脐带血中的单个核细胞^[36-37]。而在鼠的NK细胞常见的来源为从小鼠的脾脏单个核细胞（MNC）中分离获得。目前为止，所报道的用于体外扩增的犬NK细胞来源基本为PBMC，因为外周血取材方便，且培养难度较低。犬NK细胞的体外扩增方法主要以饲养层细胞共培养为主，先从外周血中分离单个核细胞，经过免疫磁珠富集CD5^-细胞，再与Gy-γ射线照射死亡的K562细胞（表达膜结合IL-21、IL-15和淋巴细胞激活受体的配体（4-1BBL））进行共培养，配合IL-2、IL-15、IL-21等细胞因子以激活犬NK细胞，培养时间为14～21 d^[38]。

NK细胞的扩增效果与细胞因子的浓度、刺激时间、物种来源等有很大关系。IL-15是NK细胞生长、发育和激活的关键细胞因子^[39]，Lee等^[40]分别使用重组人IL-15（rhIL-15）和重组犬IL-15（rcIL-15）在IL-2存在的情况下扩增犬NK细胞，使用rcIL-15对NK细胞进行培养除了能获得更高的扩增率外，所扩增得到的犬NK细胞对CTAC的细胞毒性，γ-干扰素的释放水平，穿孔素和颗粒酶的mRNA表达水平均优于rhIL-15处理组。IL-21对NK细胞的增殖、细胞毒活性以及ADCC具有正向调节作用^[41]，但IL-21也会对NK细胞产生负面影响，这取决于IL-21的浓度、刺激时间等^[42]。Shin等^[10]研究了3种不同犬重组IL-21（rcIL-21）添加时间对犬NK细胞扩增效果的影响，结果表明，激活3周后，rcIL-21仅在第1周添加能获得最好的扩增效果，犬NK细胞平均扩增90.6倍，间歇组（每周第1天添加rcIL-21）平均扩增51.9倍，持续组（连续添加rcIL-21 21 d）平均扩增44.4倍。综上所述，使用同物种来源的细胞因子，适当调整细胞因子的浓度以及刺激时间，可以使犬NK细胞获得更好的扩增效果。

3.1 犬NK细胞在犬类肿瘤治疗中的潜在应用价值

NK细胞过继治疗一直是肿瘤免疫治疗的热点，通过将自体或异体的NK细胞过继转移至患者身上，以治疗肿瘤疾病，防止癌细胞扩散转移^[43]。犬NK细胞在犬类肿瘤疾病治疗中的潜在应用价值主要体现在其天然的抗肿瘤特性，安全性优势、以及与现有的肿瘤疗法的协同效应上。Ljunggren等^[44]首次提出NK细胞无需抗原预敏即可直接杀伤肿瘤细胞，是免疫学的经典理论，NK细胞通过表面受体（如NKp30、NKp44）识别靶细胞表面非MHC依赖性配体的缺失，触发杀伤，这一机制是NK细胞抗肿瘤功能的基础。NK细胞的安全性以及疗效在人类身上已得到证实，移植物抗宿主病（GVHD）主要由供体T细胞通过TCR识别宿主异体抗原引发，而NK细胞无TCR，因此无法通过经典途径引发GVHD。而且NK细胞寿命短，异体NK细胞在宿主体内存活时间通常小于2周，不足以持续攻击宿主组织。一些早期临床试验证明，同种异体的NK细胞输注对患者来说也是安全的^[45-46]。NK细胞配合传统化疗可以清除残留肿瘤细胞，化疗可以缩小肿瘤体积并诱导肿瘤细胞应激，上调NK细胞活化配体（如MICA/B）的表达，从而增强NK细胞识别和杀伤能力^[47]。随着现代宠物医疗技术的进步，犬的平均寿命预期在不断提升，在犬肿瘤疾病的临床病例中，老年犬占病例的比例越来越大。高龄的肿瘤疾病患犬手术预后不良甚至无法承担手术风险的问题愈发突出，NK细胞免疫过继疗法有望控制老年患犬术后肿瘤转移，改善生活质量。因此，犬NK细胞免疫过继疗法对老年肿瘤患犬有着较大的潜在应用价值。犬NK细胞的过继治疗研究进展一直被缺乏特异性、验证性的抗体所阻碍^[48]，多项研究证明犬NK细胞在体外对犬甲状腺肿瘤细胞和犬骨肉瘤细胞具有明显的杀伤作用^[49-50]，但犬NK细胞的临床试验仅在犬骨肉瘤以及乳腺肿瘤上有报道。

3.2 犬NK细胞在骨肉瘤治疗中的应用

骨肉瘤（OSA）是人类与狗最常见的原发骨肉瘤，在犬中的发病率是人类的30～50倍^[51]。在临床上，犬OSA的一般治疗方式是手术切除，再进行4～6周期的卡铂和阿霉素化疗^[52]。尽管通过手术治疗和化疗能提高患犬的存活率，但总存活周期不超过1年，90%的患犬会发生肺、骨和软组织转移^[53]。加州大学戴维斯医学中心首次进行了犬NK细胞过继治疗骨肉瘤，通过姑息性放疗和自体扩增的犬NK细胞瘤内注射相结合，每只患犬每周注射7.5×10⁶个NK细胞，同时注射250 000 IU/kg的rhIL-2。在10只接受治疗的患犬中，5只治疗6个月后肿瘤细胞不发生转移，1只患犬经放射-NK细胞免疫治疗后肺结节消退，经治疗存活时间最长的患犬存活了11.2个月。1只犬在治疗过程中出现了与IL-2毒性相一致的发热、寒战、唾液增多和脱水等反应，3只犬在NK细胞注射部位有局部感染和组织破坏，总而言之，姑息性放疗配合NK细胞瘤内注射的治疗方案的全身性毒性有限^[54]。Judge等^[55]同样使用姑息性放疗以及NK细胞瘤内注射的方案治疗非转移性的OSA，生存分析结果显示，有5只患犬存活了6个月以上，其中1只犬存活了17.9个月。

3.3 犬NK细胞在乳腺肿瘤治疗中的应用

乳腺肿瘤（CTMs）是母犬最常发的肿瘤之一，流行病学调查显示，7～13岁犬只占CMTs病例总数的82.6%，而初情期前（＜1岁）发病率不足0.05%^[56]，并且约50%的是恶性肿瘤^[57]。手术切除是治疗CTMs最有效的手段，如果肿瘤没有发生转移，手术治疗是可以治愈的，但很多发生了转移的CTMs即使进行了手术治疗也难以治愈^[58]。除了手术治疗外，还有放射性治疗、激素治疗（黄体酮拮抗剂、戈舍瑞林）等方式，但这些往往只能延长患犬的生存周期，生活质量并没有得到很好地改善^[59]。Lee等^[31]从犬NK细胞的培养上清中分离得到犬NK细胞来源的外泌体，使用BALC/c裸鼠制造犬乳腺肿瘤模型，并使用犬NK细胞来源的外泌体进行治疗，结果显示，外泌体治疗组的肿瘤生长受到抑制，肿瘤重量减少。与对照组相比，外泌体治疗组基质金属肽酶-3、IL-1β、IL-6、TNF-α等肿瘤发生相关标志物的表达显著降低，可见，犬NK细胞来源的外泌体对犬乳腺肿瘤有良好的治疗效果。

4 结语与展望

近十年来，人们一直在对犬NK细胞的表征、功能以及过继NK细胞治疗的可行性、安全性进行研究，犬NK细胞的定义逐渐明确，在评估其体外功能的同时也逐渐应用于临床治疗中。NK细胞的安全性以及出色的抗肿瘤效果决定了它良好的应用前景，鉴于临床上犬肿瘤治疗方案的缺乏以及较差的预后效果，犬NK细胞作为1种新兴的肿瘤免疫治疗方式，会向更高端的方向发展，以增强它的抗肿瘤效果，比如将过继犬NK细胞治疗与治疗性抗体相结合，更好地发挥NK细胞的ADCC作用；或者对犬NK细胞进行基因修饰，以表达嵌合抗原受体（CAR）以增强NK细胞的靶向性和杀伤作用，这都是今后犬NK细胞重要的研究方向。犬NK细胞作为犬肿瘤免疫治疗中最有效的治疗手段之一，在不断地深入研究以及技术的不断优化、改造、成熟中必将成为犬肿瘤治疗的曙光。

参考文献

[1] 严杜建.犬肿瘤的研究概况[J]. 黑龙江畜牧兽医，2016(4): 142-145.

[2] 唐甜，饶巍.自然杀伤细胞抗肿瘤免疫治疗研究进展：从实验室到临床[J].中国肿瘤，2017, 26(1): 44-52.

[3] LASKOWSKI T J, BIEDERSTADT A, REZVANI K. Natural killer cells in antitumour adoptive cell immunotherapy[J]. Nat Rev Cancer, 2022, 22(10): 557-575.

[4] MEHTA R S, REZVANI K. Chimeric antigen receptor expressing natural killer cells for the immunotherapy of cancer[J/OL].Frontiers in immunology, 2018, 9: 283[2025-02-14].

[5] FELSBURG P J. Overview of immune system development in the dog: comparison with humans[J]. Hum Exp Toxicol. 2002, 21(9-10): 487-492.

[6] GINGRICH A A, REITER T E, JUDGE S J, et al. Comparative immunogenomics of canine natural killer cells as immunotherapy target[J/OL]. Frontiers in immunology, 2021, 12: 670309[2025-02-14].

[7] POZNANSKI S M, ASHKAR A A. What defines NK cell functional fate: phenotype or metabolism?[J/OL]. Frontiers in immunology, 2019, 10: 1414[2025-02-14].

[8] 秦子淋，曾健滢，牛立志.自然杀伤细胞在肿瘤免疫治疗中的研究现状[J].医学综述, 2017, 23(11): 2160-2165.

[9] WALZER T, JAEGER S, CHAIX J, et al. Natural killer cells: from CD3-NKp46+ to post-genomics meta-analyses[J]. Curr Opin Immunol, 2007, 19(3): 365-372.

[10] SHIN D, LEE S, PARK J, et al. Interleukin-21 induces proliferation and modulates receptor expression and effector function in canine natural killer cells[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2015, 165(1-2): 22-33.

[11] GINGRICH A A, MODIANO J F, CANTER R J. Characterization and potential applications of dog natural killer cells in cancer immunotherapy[J/OL]. J Clin Med, 2019, 8(11):1802[2025-02-14].

[12] YASUDA N, MASUDA K, TSUKUI T, et al. Identification of canine natural CD3-positive T cells expressing an invariant T-cell receptor alpha chain[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2009, 132(2-3-4): 224-231.

[13] HUANG Y, HUNG S, JAN T, et al. CD5-low expression lymphocytes in canine peripheral blood show characteristics of natural killer cells[J]. J Leukoc Biol, 2008, 84(6): 1501-1510.

[14] LEE S, SHIN D, KIM Y, et al. Comparison of phenotypic and functional characteristics between canine non-B, non-T natural killer lymphocytes and CD3⁺CD5(dim)CD21(-) cytotoxic large granular lymphocytes[J/OL]. Front Immunol, 2018, 9: 841[2025-02-14].

[15] KRUSE P H, MATTA J, UGOLINI S, et al. Natural cytotoxicity receptors and their ligands[J]. Immunol Cell Biol, 2014, 92(3): 221-229.

[16] BARROW A D, MARTIN C J, COLONNA M. The natural cytotoxicity receptors in health and disease[J/OL]. Front Immunol, 2019, 10: 909[2025-02-14].

[17] DE MARIA A, BIASSONI R, FOGLI M, et al. Identification, molecular cloning and functional characterization of NKp46 and NKp30 natural cytotoxicity receptors in Macaca fascicularis NK cells[J]. Eur J Immunol, 2001, 31(12): 3546-3556.

[18] WESTGAARD I H, BERG S F, VAAGE J T, et al. Rat NKp46 activates natural killer cell cytotoxicity and is associated with Fc epsilon RIgamma and CD3zeta[J]. J Leukoc Biol, 2004, 76(6): 1200-1206.

[19] BOYSEN P, STORSET A K. Bovine natural killer cells[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2009, 130(3-4): 163-177.

[20] CONNELLEY T, STORSET A K, PEMBERTON A, et al. NKp46 defines ovine cells that have characteristics corresponding to NK cells[J/OL]. Vet Res, 2011, 42(1): 37[2025-02-14].

[21] HUDSPETH K, SILVA-SANTOS B, MAVILIO D. Natural cytotoxicity receptors: broader expression patterns and functions in innate and adaptive immune cells[J/OL]. Front Immunol, 2013, 4: 69[2025-02-14].

[22] GRONDAHL-ROSADO C, BONSDORFF T B, BRUN-HANSEN H C, et al. NCR1+ cells in dogs show phenotypic characteristics of natural killer cells[J]. Vet Res Commun, 2015, 39(1): 19-30.

[23] FOLTZ J A, SOMANCHI S S, YANG Y, et al. NCR1 expression identifies canine natural killer cell subsets with phenotypic similarity to human natural killer cells[J/OL]. Front Immunol, 2016, 7: 521[2025-02-14].

[24] GRONDAHL-ROSADO C, BOYSEN P, JOHANSEN G M, et al. NCR1 is an activating receptor expressed on a subset of canine NK cells[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2016, 177: 7-15.

[25] HERBERMAN R B, NUNN M E, HOLDEN H T, et al. Natural cytotoxic reactivity of mouse lymphoid cells against syngeneic and allogeneic tumors. Ⅱ. Characterization of effector cells[J]. Int J Cancer, 1975, 16(2): 230-239.

[26] 田志刚.基于NK细胞的肿瘤免疫治疗研究进展[J].中国肿瘤生物治疗杂志, 2009, 16(1): 2-5.

[27] ABEL A M, YANG C, THAKAR M S, et al. Natural killer cells: development, maturation, and clinical utilization[J/OL]. Front Immunol, 2018, 9: 1869[2025-02-14].

[28] FARAG S S, VANDEUSEN J B, FEHNIGER T A, et al. Biology and clinical impact of human natural killer cells[J]. Int J Hematol, 2003, 78(1): 7-17.

[29] PARK J, SHIN D, LEE S, et al. The anti-canine distemper virus activities of ex vivo-expanded canine natural killer cells[J]. Vet Microbiol, 2015, 176(3-4): 239-249.

[30] MICHAEL H T, ITO D, MCCULLAR V, et al. Isolation and characterization of canine natural killer cells[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2013, 155(3): 211-217.

[31] LEE J, LEE S, GU N, et al. Canine natural killer cell-derived exosomes exhibit antitumor activity in a mouse model of canine mammary tumor[J/OL]. Biomed Res Int, 2021, 2021: 6690704[2025-02-14].

[32] INNGJERDINGEN M, KVEBERG L, NAPER C, et al. Natural killer cell subsets in man and rodents[J]. Tissue antigens, 2011, 78(2): 81-88.

[33] HAO L, KLEIN J, NEI M. Heterogeneous but conserved natural killer receptor gene complexes in four major orders of mammals[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(9): 3192-3197.

[34] GAGNIER L, WILHELM B T, MAGER D L. Ly49 genes in non-rodent mammals[J]. Immunogenetics, 2003, 55(2): 109-115.

[35] JUDGE S J, YANAGISAWA M, STURGILL I R, et al. Blood and tissue biomarker analysis in dogs with osteosarcoma treated with palliative radiation and intra-tumoral autologous natural killer cell transfer[J/OL]. PLoS One, 2020, 15(2): e224775[2025-02-14].

[36] 韩强，张志刚，刘坤，等.脐血来源NK细胞的体外扩增及其抗肿瘤细胞活性的研究[J].中国医药生物技术, 2022, 17(5): 412-417.

[37] 王媞尔，孙运艳，韩忠朝，等.体外高效活化扩增人脐带血来源自然杀伤细胞的两种体系的比较研究[J].中国实验血液学杂志, 2023, 31(2): 553-561.

[38] SHIN D, PARK J, JANG Y, et al. Ex vivo expansion of canine cytotoxic large granular lymphocytes exhibiting characteristics of natural killer cells[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2013, 153(3-4): 249-259.

[39] MILLER J S, ROONEY C M, CURTSINGER J, et al. Expansion and homing of adoptively transferred human natural killer cells in immunodeficient mice varies with product preparation and in vivo cytokine administration: implications for clinical therapy[J]. Biol Blood Marrow Transplant, 2014, 20(8): 1252-1257.

[40] LEE S, SHIN D, KIM S. Generation of recombinant canine interleukin-15 and evaluation of its effects on the proliferation and function of canine NK cells[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2015, 165(1-2): 1-13.

[41] VARCHETTA S, OLIVIERO B, MAVILIO D, et al. Different combinations of cytokines and activating receptor stimuli are required for human natural killer cell functional diversity[J]. Cytokine, 2013, 62(1): 58-63.

[42] MEAZZA R, AZZARONE B, ORENGO A M, et al. Role of common-gamma chain cytokines in NK cell development and function: perspectives for immunotherapy[J/OL]. J Biomed Biotechnol, 2011, 2011: 861920[2025-02-14].

[43] 曹腾宇，孙莉萍，于洋.NK细胞免疫治疗恶性肿瘤的研究进展[J].临床输血与检验, 2024, 26(2): 267-274.

[44] LJUNGGREN H G, KARRE K. In search of the 'missing self' : MHC molecules and NK cell recognition[J]. Immunol today, 1990, 11(7): 237-244.

[45] ILIOPOULOU E G, KOUNTOURAKIS P, KARAMOUZIS M V, et al. A phase I trial of adoptive transfer of allogeneic natural killer cells in patients with advanced non-small cell lung cancer[J]. Cancer Immunol Immunother, 2010, 59(12): 1781-1789.

[46] SAKAMOTO N, ISHIKAWA T, KOKURA S, et al. Phase I clinical trial of autologous NK cell therapy using novel expansion method in patients with advanced digestive cancer[J/OL]. J Transl Med, 2015, 13: 277[2025-02-14].

[47] HARTLOVA A, ERTTMANN S F, RAFFI F A, et al. DNA damage primes the type I interferon system via the cytosolic DNA sensor STING to promote anti-microbial innate immunity[J]. Immunity, 2015, 42(2): 332-343.

[48] 李巴仑，华进联.犬肿瘤免疫疗法的研究进展[J].中国细胞生物学学报, 2020, 42(7): 1288-1296.

[49] LIN C S, CHANG C P, CHIANG H C, et al. Activating natural killer (NK) cytotoxicity of canine CD5(-)CD21(-) cells requires low surface CD5 density NK cells[J]. Iran J Vet Res, 2018, 19(2): 87-95.

[50] ADDISSIE S, KLINGEMANN H. Cellular immunotherapy of canine cancer[J/OL]. Vet Sci, 2018, 5(4):100[2025-02-14].

[51] ANFINSEN K P, GROTMOL T, BRULAND O S, et al. Breed-specific incidence rates of canine primary bone tumors: a population based survey of dogs in Norway[J]. Can J Vet Res, 2011, 75(3): 209-215.

[52] PHILLIPS B, POWERS B E, DERNELL W S, et al. Use of single-agent carboplatin as adjuvant or neoadjuvant therapy in conjunction with amputation for appendicular osteosarcoma in dogs[J]. J Am Anim Hosp Assoc, 2009, 45(1): 33-38.

[53] MASON N J. Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma[J]. Adv Exp Med Biol, 2020, 1258: 199-221.

[54] CANTER R J, GROSSENBACHER S K, FOLTZ J A, et al. Radiotherapy enhances natural killer cell cytotoxicity and localization in pre-clinical canine sarcomas and first-in-dog clinical trial[J/OL]. J Immunother Cancer, 2017, 5(1): 98[2025-02-14].

[55] JUDGE S J, YANAGISAWA M, STURGILL I R, et al. Blood and tissue biomarker analysis in dogs with osteosarcoma treated with palliative radiation and intra-tumoral autologous natural killer cell transfer[J/OL]. PLoS One, 2020, 15(2): e224775[2025-02-14].

[56] 常宏建.犬271例肿瘤流行病学分析及乳腺肿瘤血清/组织标记物的筛查[D].哈尔滨:东北农业大学, 2018.

[57] 杨楚飞,袁欣,丁越,等.犬乳腺肿瘤病例分析[C]//中国畜牧兽医学会犬学分会,公安部南昌警犬基地,江西省警犬良种繁育与行为科学重点实验室.中国畜牧兽医学会犬学分会第22次犬业科技学术研讨会论文集.长春:吉林大学动物医学学院;吉林大学教学动物医院, 2024.

[58] 夏新萌,刘承军,李海,等.犬乳腺肿瘤病理学观察与分析[J].广西畜牧兽医, 2015, 31(5): 264-266.

[59] SLEECKX N, DE ROOSTER H, KROEZE E V, et al. Canine mammary tumours, an overview[J]. Reprod Domest Anim, 2011, 46(6): 1112-1131.

基金资助

2017省科技基础脐带间充质干细胞外泌体促进(BGK42402)