PRRS NADC30 GX-R18弱毒株对后备母猪免疫驯化效果的评估

Evaluating the effects of PRRS NADC30 GX-R18 attenuated strain on the immune domestication of replacement gilts

摘要

目的 为评估PRRS NADC30 GX-R18弱毒株对后备母猪的驯化效果。 方法 选取某后备猪场1 930头PRRSV抗体阳性、抗原阴性的后备母猪，使用“两活一灭”的免疫驯化方式进行研究。分别在全场进满苗后的第7天和第28天免疫1针NADC30 GX-R18弱毒株、第58天免疫1针PRSS灭活疫苗。分别在免疫前、一免后21 d、二免后30 d、三免后30、45、60、90 d和转至母猪场后30 d进行前腔静脉采血，检测血液中PRRSV和N蛋白抗体。 结果 抗原单阴的断奶仔猪在免疫NADC30 GX-R18弱毒株后，分别在二免后30 d和三免后30 d检测到PRRSV病毒血症，其他阶段血液及引种前后备母猪扁桃体PRRSV检测呈阴性。一免后21 d和二免后30 d抗体显著上升，到三免后30 d达到100%，并持续到引种后30 d（N-ELISA抗体阳性率97.51%）。与免疫前相比，免疫后不同阶段抗体水平极显著升高（P<0.01），且抗体S/P值呈正态分布。生产性能统计分析该批次猪只生产成绩稳定。 结论 NADC30 GX-R18弱毒株具有高度安全性，对后备母猪免疫驯化效果良好，可以用于PRRS阳性后备母猪的免疫驯化。

Abstract

Objectives The effects of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) NADC30 GX-R18 attenuated strain on the immune domestication of replacement gilts were evaluated. Methods 1 930 PRRS antibody-positive but antigen-negative replacement gilts from a replacement pig farm were selected to study the immunization domestication with 'two-live-one-inactivated' immunization protocol. The replacement gilts were vaccinated with the NADC30 GX-R18 attenuated strain on day 7 and day 28 after the introduction of the vaccine to the farm, followed by a PRRS inactivated vaccine on day 58. Blood samples were collected from the anterior vena cava before immunization, and on day 21 after the first immunization, day 30 after the second immunization, day 30, 45, 60, and 90 after the third immunization, and day 30 after transfer to the pig farm and detected for antibodies against PRRSV pathogens and N-protein. Results PRRS viremia was detected in antigen-negative weaned piglets on day 30 after the second immunization and day 30 after the third immunization following vaccination with the PRRSV NADC30 GX-R18 attenuated strain. PRRSV was negative in blood samples at other stages and in gilt tonsils before introduction. Levels of antibody increased significantly on day 21 after the first immunization and day 30 after the second immunization, reaching 100% seropositivity by day 30 after the third immunization and persisting until 30 days after introduction (97.51% N-ELISA antibody positivity). Levels of antibody significantly increased at different stages after immunization (P<0.01) compared with that before immunization, with S/P values normally distributed. The results of statistically analyzing the production performance showed that the productivity in this batch of pigs was stable. Conclusions PRRS NADC30 GX-R18 attenuated strains have high safety and good effects of immune domestication on replacement gilts, and can be used for the immune domestication of replacement gilts after being PRRS positive.

Graphical abstract

关键词

猪繁殖与呼吸综合征病毒 / NADC30 GX-R18弱毒株 / 免疫驯化 / 后备母猪 / 生产性能

Key words

porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) / NADC30 GX-R18 attenuated strains / immune domestication / replacement gilt / production performance

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）作为重创养猪产业的重大疾病之一，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种高度传染性疾病，且在不同类型、不同阶段的猪群中均有发生^[1-2]。据报道，母猪场PRRS的发病率与引进后备母猪的健康度、频次和数量直接相关^[3]。感染后，具体表现在后备母猪频繁咳喘、发情配种率和成种率低，同时会造成妊娠母猪流产、产活仔数下降、死胎和木乃伊头数增加、断奶头数减少等^[4]。因其感染范围广、发病率和致死率高，导致该病在生产中极难防控^[5]。

封群结合免疫和保健是目前养猪企业防控PRRS的常用方法^[6]。从防控效果来看，封群虽是一种非常有效的手段，但长时间封群会影响猪场的正常生产，如造成栏舍利用率低、生产成本居高不下等，故需要适时补入后备种猪。因此，PRRS防控的关键是应该如何培育健康合格的后备种猪。除双阴场（抗原和抗体阴性）需要引种双阴性后备种猪外，其他类型的猪场必须引入经PRRSV免疫驯化合格的后备母猪，才能有效避免后备母猪入群后导致的PRRS波动。

目前，使用比较多的PRRSV疫苗主要以减毒活疫苗和灭活疫苗等传统疫苗为主。研究表明，减毒活疫苗更容易诱导猪只产生体液免疫和细胞免疫^[7-8]。灭活疫苗则有助于阳性猪群快速提高体内抗体水平和加快细胞免疫应答^[9]。因此，减毒活疫苗和灭活疫苗的组合使用也越来越多，并取得良好的效果^[10-13]。当下减毒活疫苗主要包括3种经典毒株（CH-1R、R98和VR2332）和4种HP-PRRSV（GDr180、HuN4-F112、JXA1-R和TJM-F92），但关于NADC30减毒活疫苗则鲜有报道。因此，本研究采用一免和二免NADC30 GX-R18弱毒株，三免商品化灭活疫苗的免疫方式对后备母猪进行驯化，并根据生产性能指标评估驯化效果，以期为后备母猪群体的PRRS防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

PRRS抗原阴性、抗体阳性的断奶仔猪1 930头，从25日龄断奶转入后备猪场开始，至培育驯化后转入母猪场结束。

1.2 疫 苗

NADC30 GX-R18弱毒株（传代致弱NADC30毒株，由华中农业大学动物医学院预防兽医实验室提供）；PRRS灭活疫苗（兰净优，CH-1a）购自扬州优邦生物药品有限公司。

1.3 主要试剂

磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒，哈尔滨国生生物科技股份有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒（通用）实时荧光RT-PCR检测试剂盒，湖南冠牧生物科技有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒，北京金诺百泰生物技术有限公司。

1.4 试验设计

免疫驯化实施方案如表1所示，采血检测方案如表2所示。

1.5 病毒核酸提取和病原检测

使用磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织样中核酸，具体操作按照试剂盒说明书进行。使用猪繁殖与呼吸综合征病毒（通用）实时荧光RT-PCR检测试剂盒检测组织样中有无PRRSV。若Ct≤35，且出现典型扩增曲线的样品，判为阳性；若35<Ct值≤40，则判为可疑，需要复检。具体操作参考试剂盒说明书。

1.6 血清中抗体的检测

使用猪繁殖与呼吸综合征病毒ELISA抗体检测试剂盒检测PRRSV抗体。通过计算样品与阳性对照（S/P）的比值判定是否有PRRSV抗体：S/P值≥4.0，判定为阳性；S/P值<4.0，判定为阴性。

1.7 数据统计分析

比较位置相邻、批次相近、规模相似的3个后备猪场免疫水平的差异和生产成绩的不同。其中，A场采用“一活两灭”的免疫方式进行驯化，B场为本研究中的试验场，C场与B场采用的免疫驯化方式均为“两活一灭”，但是A场C、场使用的是市场上商品化的减毒活疫苗。对不同阶段抗体水平和抗体分布，采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析和作图，生产指标分析采用SPSS 26.0软件进行统计分析，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 免疫期间猪群状态

对免疫NADC30 GX-R18弱毒株和PRRS灭活疫苗阶段猪群的应激和死亡数量进行统计。如表3所示，免疫后猪群整体平稳，日均死淘头数在（0.33~0.37）头/d。

2.2 不同阶段PRRSV和PRRSV抗体监测

为了解猪群的PRRSV感染以及抗体产生情况，对采集不同阶段的血液进行PRRSV和PRRSV抗体检测。如表4所示，免疫前断奶仔猪抗原阴性，抗体阳性。在一免后21 d和三免后30 d PRRSV病毒血症阳性率分别为53.33%和32.14%，三免后45 d PRRSV病毒血症消失。抗体阳性率在免疫后呈上升趋势，至三免后30~60 d阳性率达100%，随后呈下降趋势，转至母猪场后30 d检测抗体阳性率为97.51%。

由图1可知，从免疫NADC30 GX-R18弱毒株前至引种后30 d，抗体水平呈现先升高后下降的趋势；且与免疫NADC30 GX-R18弱毒株前相比，免疫后不同阶段抗体水平极显著升高（P<0.01）。

由图2可知，免疫前，抗体阳性率较低，整体S/P值在0~0.4区间；一免后21 d，抗体阳性率整体上升，S/P值在0.4~1.2区间；二免后30 d，整体抗体单峰居中，抗体阳性率继续上升；三免后30 d和45 d，单峰偏右，抗体阳性率100%；三免后60 d，呈现双峰，抗体阳性率保持在100%；三免后90 d，单峰居中，S/P在1.6~2.0区间，离散度低，呈正态分布。引种至母猪场后30 d，单峰居中，抗体衰减，但呈正态分布，离散度低，抗体水平较为整齐。

3个场相比，A场在转群前PRRSV病毒血症阳性率为1.39%。C场具有和B场相同的趋势，且在转群前未检测到PRRSV病毒血症。综合比较，B场和C场驯化效果优于A场。

2.3 生产性能

本研究通过比较后备猪场提供猪群的生产成绩来评估免疫驯化效果。由表5可知，在批次成活率、选种率和发情配种率方面，A场极显著低于B场和C场（P<0.01）；成种率方面，A场分别显著低于B场和C场3.02、2.96百分点；分娩率方面，B场显著高于A场3.29百分点。

对3个后备猪场提供猪只的产仔性能进行统计分析（表6），产活仔数方面，C场分别极显著低于A场和B场0.49、0.47头（P<0.01）；弱仔数方面，B场低于A场0.34头、B场高于C场0.20头、A场高于C场0.54头，且三个场之间差异极显著（P<0.01）；在死胎和木乃伊胎方面，C场极显著高于A场和B场（P<0.01）；断奶数方面，B场高于A场0.41头，差异极显著（P<0.01）。

3 讨 论

补充健康优质的后备种猪是母猪场能够高效稳定生产的必要条件之一。但后备种猪在混群后往往会造成PRRS波动，从而给养猪生产带来巨大的影响。因此，后备种猪在入群前进行PRRSV驯化至关重要。

考虑到保育仔猪免疫PRRS减毒活疫苗后，会表现出典型的病毒血症，且排毒时间可能长达1个月以上^[14]。为避免不同批次仔猪之间相互影响，本试验免疫开始时间选定为全场进满猪后再进行同步免疫。根据生产需求，后备猪场严格执行全进全出策略，驯化完成且检测达标后才能转群至对应的母猪场。驯化期间，持续对后备猪（含病弱猪）和猪场内、外环境进行排毒检测。在母猪场阶段，采用分胎次饲养的模式，先在其后备隔离舍隔离45 d，隔离期间同样对PRRSV进行持续检测，合格后转至一胎线参配。

目前，疫苗免疫仍是后备种猪驯化中的重要手段之一。减毒活疫苗可以刺激机体快速产生反应，但可能存在扩散传播、变异重组、毒力返强和交叉保护力不足等不可控因素^[15-17]。灭活疫苗虽具有安全、稳定等优点，但免疫次数多、单次免疫剂量大^[18]。因此，生产中往往将二者组合使用。当下以类NADC30 PRRSV为代表的毒株逐渐成为了我国的流行毒株之一，但关于NADC30减毒活疫苗的报道不多。张洪亮^[19]通过致弱类NADC30强毒株，获得相应的疫苗候选毒株SD-R，并证明其对感染同源和异源类NADC30 PRRSV、类NADC34 PRRSV和HP-PRRSV的仔猪均有良好的交叉保护作用。本研究在后备母猪驯化过程中通过2次免疫NADC30 GX-R18弱毒株后再免疫1次灭活苗的免疫方式，持续检测不同阶段抗原、抗体情况，评估对后备母猪的驯化效果。

从PRRSV抗原监测结果来看，一免后21 d病毒血症阳性率为53.33%，说明GX-R18弱毒株一免后猪只开始排毒。二免后30 d病毒血症阳性率为0，这与其他报道的结果相似^[11]。随后在三免后30 d（距离减毒活疫苗一免86 d，距离二免62 d）可以检测到病毒血症阳性率为32.14%。二免后血液检测不到病原，说明PRRSV病毒血症消失，但组织内的病原仍然存在。三免后再次检测到病原，推测可能与猪只受到应激后组织内的病原再次活跃有关。王江平等^[10]采用减毒活疫苗和灭活疫苗混合免疫商品断奶仔猪，在免疫后69 d的血液样品中同样检测出病毒血症，这与本研究结果一致。

在本研究中，B场和C场采用相同的免疫驯化方式，病毒血症出现的趋势相同。通过PRRSV抗体检测发现，连续免疫2次GX-R18弱毒株后抗体水平上升，在二免后30 d达到99.31%，这与丁尊俄^[12]的研究结果相似。引种后30 d（三免后120 d）检测结果显示，抗体阳性率有所下降、峰值左移，提示免疫PRRS灭活苗4个月后，N蛋白抗体出现衰减，S/P峰值由1.6~2.0下降到1.2~1.6。

为保障后备母猪入群时有较高的N蛋白抗体水平，建议在母猪场隔离期间补免1针PRRS灭活疫苗来提高抗体水平。通过生产成绩评估，一胎场的生产成绩处于该公司的基线水平，虽然对比双阴后备母猪仍有一定的差距，但整体比较平稳。

4 结 论

本研究结果表明，对于PRRS阳性稳定猪场而言，NADC30 GX-R18弱毒株具有高度安全性，对后备母猪免疫驯化效果良好，可以用于PRRS阳性后备母猪的免疫驯化。

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基金资助

国家现代农业产业技术体系广西创新团队建设专项(nycytxgxcxtd-2023-15-05)