牛病毒性腹泻病毒和牛肠道病毒二重PCR检测方法的建立及病原学分析

Establishment of a duplex PCR detection method for bovine viral diarrhea virus and bovine enterovirus and pathogeny analysis

摘要

目的 为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和牛肠道病毒（BEV）的早期诊断及防控提供技术支持。 方法 在靶向BVDV和BEV 5’-UTR保守区，各设计1对特异性引物，建立1种能同时检测BVDV和BEV的二重PCR方法，运用该方法对2024－2025年采自河南、四川以及河北等地牛场患腹泻牛的50份粪便样品进行检测并进行遗传进化分析，评估该方法的特异性和灵敏度。 结果 该方法能同时扩增BVDV的223 bp和BEV的96 bp，而对其他的常见牛病原核酸扩增均为阴性。BVDV和BEV的最低检测值分别为815 copies/μL和783 copies/μL。在50份粪便样品中，BVDV和BEV的检出率分别为68%、42%，二者混合感染率为24%。测序获得12株BVDV和12株BEV的5′-UTR序列。遗传分析显示，获得的12株BVDV均属于BVDV-1m亚型。12株BEV中，有10株属于BEV-F种，余下2株属于BEV-E种。 结论 成功建立1种BVDV和BEV二重PCR检测方法，且我国部分省份牛场中主要流行的是BVDV-1m亚型和BEF-F种。

Abstract

Objectives The technical supports for the early diagnosis and prevention and control of bovine viral diarrhea virus (BVDV) and bovine enterovirus (BEV) were provided. Methods One pair of specific primers targeting the conserved regions at the 5'- UTR sequences of BVDV and BEV was designed, respectively. A dual PCR assay was established to simultaneously detect BVDV and BEV. The assay established was used to detect 50 fecal samples of cows with diarrhea collected from cattle farms in Henan, Sichuan, and Hebei provinces from 2024 to 2025, and phylogenetic analysis was conducted to evaluate the specificity and sensitivity of this method. Results The assay established simultaneously amplified specific fragments of 223 bp of BVDV and 96 bp of BEV, with negative results of amplification for the pathogens of other common bovine diseases. The minimum values of detecting BVDV and BEV were 815 copies/μL and 783 copies/μL, respectively. The detection rate of BVDV and BEV in 50 fecal samples was 68% and 42%, respectively, with the co-infection rate of BVDV and BEV of 24%. The 5-UTR sequences of 12 BVDV strains and 12 BEV strains were obtained by sequencing. The obtained 12 BVDV strains belonged to BVDV-1m subtype. 10 strains of the obtained 12 BEV strains were BEV-F species, and the remaining two were BEV-E. Conclusions A dual PCR assay for detecting BVDV and BEV was successfully established, and the BVDV-1m subtype and BEF-F species were main viruses in cattle farms in some provinces of China.

Graphical abstract

关键词

牛病毒性腹泻病毒 / 牛肠道病毒 / 二重PCR / 遗传进化

Key words

bovine viral diarrhea virus / bovine enteric virus / duplex PCR assay / phylogenetic

牛病毒性腹泻是全球牛群中常见且危害严重的一种病毒病，主要引起牛发热、腹泻、产奶量下降和繁殖能力下降等^[1]。1946年，该病在纽约首次被报道，并呈世界性分布。1980年，李佑民等^[2]首次在吉林省获得1株牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）株，命名为长春184V株。随后，我国新疆、内蒙古和青海等20多个省市相继检出BVDV^[3]。牛肠道病毒病是牛的一种新发传染病^[4]，临床上特征是出现严重消化道和呼吸道症状。牛肠道病毒（bovine enterovirus,BEV）宿主广泛，已从牛、羊、黑斑羚和鼠等多种动物中分离出BEV^[5]，且常与其他病原混合感染，可能导致更严重的临床症状，从而阻碍畜牧业可持续发展。

流行病学调查发现，BEV和BVDV混合感染现象很普遍，在集约化养殖场中二者混合感染率可达3.42%~57.63%^[6]，因牛的品种不同而存在差异，且随着年龄的增长，BVDV与BEV混合感染率逐渐增加，这给相应疫病的防控带来了巨大挑战。本试验建立同时快速检测BVDV和BEV的二重检测方法，运用建立的方法对2024－2025年采自河南、四川以及河北等地牛场患有腹泻牛的50份粪便样品进行检测，并进行遗传进化分析，为BVDV和BEV的鉴别诊断、流行病学调查及其防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 病毒株及样品来源

口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus, FMDV）、牛冠状病毒（bovine coronavirus, BCoV）、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis, IBRV）、牛呼吸道合胞体病毒（bovine respiratory syncytial virus,BRSV）和牛轮状病毒（bovine rotavirus, BRV）均由河南省动物性食品病原体监控重点实验室保存。本实验室保存的BVDV和BEV阳性样品cDNA分别作为阳性对照和重组质粒的构建。

50份临床样品为2024－2025年采自河南、四川以及河北等地牛场患有腹泻牛的粪便，于-80 ℃保存备用。

1.2 试验材料

2×Taq Master Mix、Trizol和反转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司、pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司、柱式DNA/RNA抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司、质粒小量提取试剂盒购自Omega公司。

1.3 试验方法

1）引物的设计与合成。靶向GenBank中公布的BVDV和BEV的5̓-UTR保守区，利用引物设计软件Primer 5.0，各设计1对引物（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。

2）PCR扩增。取适量粪便，采用PBS稀释、离心。取上清液，用Trizol提取RNA，按照反转录试剂说明书合成cDNA，PCR扩增目标片段。PCR扩增体系为10 μL 2×Taq Master Mix，上、下游引物各0.5 μL，1 μL模板，补ddH₂O至20 μL。PCR扩增步骤为95 ℃预变性5 min，随后35个循环（95 ℃ 15 s、58 ℃ 15 s和72 ℃ 15 s，），最后72 ℃ 10 min。反应结束后，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，检测PCR扩增结果。

3）二重PCR方法的建立。根据BVDV和BEV单个PCR扩增结果，选定不同引物浓度、模板量、退火温度和循环次数，摸索二重PCR反应体系和扩增条件。

4）特异性试验。采用已优化的二重PCR扩增条件，对BVDV、BEV、FMDV、BCoV、IBRV、BRSV和BRV核酸进行二重PCR扩增，不加模板量作为阴性对照，以评估所建立的二重PCR检测方法的特异性。

5）敏感性试验。将回收的PCR扩增片段克隆到pMD18-T载体中，生成重组质粒pMD18-BVDV和pMD18-BEV，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获取重组质粒，由Nano-100显微分光光度计测定重组质粒的浓度，并根据质粒长度换算为copies数。

将质粒pMD18-BVDV和pMD18-BEV按照1:1混合后，10倍梯度稀释（10^-3~10^-10），取每个稀释度质粒DNA 1 μL，进行二重PCR检测，测定二重PCR方法的最低检测限。

6）临床样本检测及病毒序列分析。对2024－2025年采自河南省、四川省及河北省等地牛场的50份牛粪便样品，利用Trizol提取RNA，反转录为cDNA，采用已建立的二重PCR方法进行BVDV和BEV的检测。

选取PCR扩增为BVDV或BEV阳性的扩增片段，克隆到pMD18-T载体中测序。采用MEGA 7.0软件，将获得的序列与从NCBI网站下载BVDV和BEV参考株序列进行遗传进化分析。

2 结果与分析

2.1 单个病毒的PCR扩增结果

以BVDV和BEV阳性样品cDNA为模板，利用引物BVDV-F/R和BEV-F/R进行PCR扩增、电泳，分别出现大小约为223、100 bp的特异性条带（图1），与预期片段大小相吻合。

2.2 二重PCR反应条件优化

二重PCR优化后，反应体系为25 μL，包括：2×Taq MasterMix 12.5 μL，BVDV-F/R引物（25 pmol/μL）各0.5 μL、BEV-F/R引物（25 pmol/μL）各0.5 μL，BVDV cDNA 1 μL与BEV cDNA各1 μL和ddH₂O 8.5 μL。扩增参数为95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s、58 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，35个循环；72 ℃ 10 min。

2.3 特异性试验结果

采用优化的双重PCR反应条件，分别对BVDV、BEV、FMDV、BCoV、IBRV、BRSV和BRV核酸进行扩增。BVDV和BEV分别扩增出1条约200、100 bp的目的片段，而FMDV、BCoV、IBRV、BRSV和BRV及阴性对照均无目的片段（图2），表明本研究建立的双重PCR具有良好的特异性。

2.4 敏感性试验结果

经紫外分光光度计测定，重组质粒pMD18-BVDV为260 ng/μL（约8.15×10¹⁰ copies/μL），pMD18-BEV为250 ng/μL（约7.83×10¹⁰ copies/μL）。将质粒10倍梯度稀释，分别取10^-3~10^-10 copies/μL，进行PCR扩增，结果显示，BVDV和BEV的最低检测限分别为815、783 copies/μL（图3），表明该方法具有良好的敏感性。

2.5 临床样品检测

利用本研究建立的二重PCR，对来自河南、四川及河北等地牛场的50份临床样本进行检测，BVDV和BEV检出率分别是68%（34/50）和42%（21/50），同时感染BVDV和BEV的检出率是24%（12/50）。

2.6 序列分析

选择12份BVDV阳性的PCR产物和12份BEV的PCR产物，分别进行克隆并测序，获得12株BVDV和12株BEV的5′-UTR核苷酸序列。

将获得的12株BVDV 5′-UTR序列与GenBank中已发布的30株BVDV参考毒株序列构建遗传进化树，将BVDV毒株分为3个分支（BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3）。获得的12株BVDV毒株与BVDV-1型参考毒株处于1个大分支中，并与属于BVDV-1m亚型的吉林省2015年分离的SD-15株、四川省2017年分离的XC株和辽宁省2023年分离的LN-1株处于同一小分支中，而与BVDV-2、BVDV-3型参考毒株处于不同的分支（图4）。表明克隆的12株BVDV毒株均为BVDV-1m型。

将测序获得的12株BEV 5′-UTR序列与GenBank中已发布的11株BEV参考毒株序列构建遗传进化树，将BEV毒株分为2个分支（图5），即BEV-E和BEV-F。克隆的12株BEV中有10株与3A、PS87和BJ50等8株BEV参考毒株处于1个分支，属于BEV-F种，而余下的2株与3株BEV参考毒株K2577、XJ-FHT和SL305处于另一分支，属于BEV-E种。来自河北省的毒株HB002和河南省的毒株HN004-8与BEV-F种参考毒株串在一起，形成1个大的分支，而与BEV-E种参考毒株处于明显不同的分支中。

3 讨 论

牛病毒性腹泻和牛肠道病毒病是当今危害全球养牛业的2种重要疫病。随着牲畜运输和贸易的增加，加快了BVDV的传播和变异。研究发现，我国存在多个BVDV亚型^[7]，这也给牛病毒性腹泻的防控带来挑战。牛肠道病毒病是我国1种新发动物传染病^[4]，是引起牛消化道、呼吸道和生殖道疾病的重要病原体之一，制约养牛业的健康发展。临床上从无症状的健康牛中也能检测到BEV，受感染的无症状牛可以将病毒排泄到体外，造成疫病传播。因此，加强对牛场BVDV和BEV流行病学调查，并尽快从BVDV和BEV流行毒株中筛选出疫苗候选株，为相应疫病的防控奠定基础。

目前，BVDV和BEV的主要检测方法有病毒分离和血清学方法、常规PCR和荧光定量PCR（qPCR）等^[8-9]。病毒分离和血清学方法耗时长，且敏感性较低，难以满足快速筛查的需求。qPCR引物设计要求高，成本较高，需要荧光染料或探针等。单重PCR需分步操作，增加检测成本；而二重PCR在同一反应体系中同步检测2种病原，具有操作步骤少、试验时间短和检测成本低等优点，从而提高检测效率；当前牛场中常见BVDV和BEV混合感染。因此，本研究基于BVDV和BEV 5̓-UTR序列的保守区域，各设计1对引物，建立同时快速检测BVDV和BEV的二重检测方法，仅需1次反应即可检测BVDV和BEV的单独感染或混合感染，为临床上BVDV和BEV防控提供强有力的技术支撑。

利用建立的二重PCR方法，对2024－2025年采自河南、四川以及河北等地牛场患腹泻牛的50份粪便样品进行检测。结果显示，有34份检测为BVDV阳性，检出率为68%，高于新疆部分地区和2019－2021年山东地区BVDV阳性率（分别为40.0%和42.1%），这可能与地区不同、养牛业规模化程度不同以及持续性感染(PI)牛根除不净等有关。此外，BEV的检出率为42%（21/50），BVDV和BEV混合感染检出率为24%（12/50）。表明河南、四川以及河北等地牛场仍存在BVDV和BEV感染，而且存在二者混合感染。

本研究测序获得12株BVDV和12株BEV的5′-UTR核苷酸序列。遗传进化分析显示，获得的12株BVDV均属于BVDV-1m，这与湖北省、河南省、山东省和四川省等多个地区BVDV调查结果均为BVDV-1m亚型,与邓宇报道结果相一致^[10]，表明BVDV-1m亚型在中国已广泛流行，同时也为当前国内养牛业BVDV疫苗的选择提供了参考。12株BEV中有10株BEV-F种，余下2株属于BEV-E种。Chang等^[11]报道2012－2018年从河南、吉林和宁夏分离的27株BEV中24株是BEV-E种（88.89%），3株是BEV-F种（11.11%），而在2021－2022年广西地区的125株BEV毒株中BEV-E种和BEV-F种分别为54.4%和45.6%^[12]，表明BEV-F种已经在我国普遍流行，应引起高度重视。

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基金资助

国家重点研发项目(2022YFD1601606)

河南农业大学拔尖人才项目(30501277)