克氏原螯虾烂尾病的病原分离鉴定及药敏试验

Isolation, identification, and drug sensitivity testing of the pathogen responsible for the tail rot disease in Procambarus clarkii

摘要

目的 探究引起贵州某养殖场克氏原螯虾烂尾病的致病原和药敏特征，为克氏原螯虾烂尾病的防控提供依据。 方法 2025年4月初，笔者从贵州省铜仁市某养殖场采集2只发病活虾，从2只病虾的肝胰腺和虾尾病变部位均分离获得可疑菌株，对其进行革兰氏染色。通过PCR法扩增16S rRNA基因序列并进行测序分析，通过药敏试验测定分离菌株对常见抗生素的耐药性。 结果 从病虾的肝胰腺和虾尾病变部位分离到的菌株在TSA培养基表面形态一致，均为白色圆形菌落；革兰氏染色均为单个分散或成对排列的短杆状革兰氏阴性菌。16S rRNA基因测序结果发现，2株分离菌与已知弗氏柠檬酸杆菌相似性最高，均超过99.6%。药敏试验结果显示，分离菌对头孢哌酮、头孢他啶、卡那霉素和四环素耐药，对氨苄西林、羧苄西林、头孢曲松、庆大霉素、新霉素和多西环素敏感。 结论 从该场病虾组织中分离获得弗氏柠檬酸杆菌，分离菌对部分抗生素敏感。

Abstract

Objectives The pathogen and characteristics of antibiotic resistance of tail rot disease in Procambarus clarkii in a farm in Guizhou were studied to provide a basis for the prevention and control of tail rot disease in Procambarus clarkii. Methods The suspicious strains of bacteria were isolated from the lesion sites of the hepatopancreas and tails of 2 live shrimp with tail rot disease collected from a farm in Tongren City, Guizhou Province in early April 2025, and subjected to Gram staining. The sequences of 16S rRNA gene were amplified with PCR to be sequenced and analyzed. Drug sensitivity testing was used to determine the resistance of isolated strains to common antibiotics. Results The strains isolated from the lesion sites of the hepatopancreas and tails of shrimp with tail rot disease had consistent colony morphology on the surface of TSA medium, all forming white circular colonies. All were short rod-shaped Gram-negative bacteria, either individually dispersed or arranged in pairs. Two strains isolated had the highest similarity to C.freundii, exceeding 99.6%. The strains isolated were resistant to cefoperazone, ceftazidime, kanamycin, and tetracycline and sensitive to ampicillin, carbenicillin, ceftriaxone, gentamicin, neomycin, and doxycycline. Conclusions C.freundii is isolated from the tissues of the diseased shrimp in this farm, and the isolated strains are sensitive to some antibiotics.

Graphical abstract

关键词

克氏原螯虾 / 烂尾病 / 分离鉴定 / 药敏试验

Key words

Procambarus clarkii / tail rot disease / isolation and identification / drug sensitivity test

克氏原螯虾俗称小龙虾，因其肉质鲜美、生长速度快而广受消费者喜爱，同时也是我国养殖范围最广的淡水虾品种^[1-2]。随着我国克氏原螯虾养殖业的快速发展，高密度养殖环境下多种疾病频发，其中细菌病和病毒性疾病尤为常见^[3]。烂尾病是克氏原螯虾中一种常见的细菌性疾病，养殖或运输过程中，水源中细菌可通过消化道、伤口或破损组织感染虾类。然而，目前引起克氏原螯虾烂尾病的主要病原种类尚未明确。烂尾病可导致虾尾出现水疱、水肿和溃烂等症状，尤其在高温季节可能引发病虾死亡。

相关研究显示，可导致克氏原螯虾烂尾病的细菌性病原种类繁多。刘张淮等^[4]从患烂尾病的克氏原螯虾病灶部位共分离获得2株致病菌，分别为嗜水气单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌。随后，刘张淮及其团队在另1例虾烂尾病案例中仅分离获得弗氏柠檬酸杆菌^[3]。2025年4月初，贵州省铜仁市某养殖场的克氏原螯虾出现疑似烂尾症状，表现为尾部水肿后逐渐溃烂，病虾死亡率较高。为有效防控该病，笔者从养殖场采集发病活虾，对其临床症状和病理变化进行系统观察，并采集病虾组织样品进行细菌分离、革兰氏染色、PCR分子鉴定及药敏试验，旨在明确病原菌种类及其药物敏感性，为克氏原螯虾烂尾病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2只患烂尾病的克氏原螯虾采自铜仁市某养殖场，将其装于含有少量水的采样盒中，低温送至实验室进行后续检测。

1.2 主要试剂

TSA固体培养基和革兰氏染色试剂盒均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；PCR和琼脂糖凝胶电泳相关试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方 法

1）细菌分离和革兰氏染色鉴定。取病虾2只，用灭菌生理盐水清洗病虾表面后，使用无菌接种环分别取虾尾肿胀内部组织和肝胰腺组织样品，接种于TSA固体培养基表面进行平板划线，随后将培养皿置于28 ℃恒温箱培养过夜。挑取形态特征一致的菌落再次纯化，用灭菌接种环取少量纯化后的单一菌落均匀涂抹于载玻片，采用革兰氏染色法进行染色。染色完成后，在光学显微镜下观察并记录分离菌的形态学特征。

2）分离菌16S rRNA基因序列PCR扩增、测序与相似性分析。将单一菌落接种于液体培养基中，于37 ℃恒温振荡培养箱中以180 r/min转速培养12 h。随后，采用煮沸法提取细菌DNA基因组。以通用引物^[5]16S rRNA-F和16S rRNA-R对细菌基因组进行PCR扩增，PCR体系（25.0 μL）包括2×PCR预混液12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA基因组模板2.0 μL及无RNA酶水9.5 μL；PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共设置30个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR反应完成后，取少量产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余阳性PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

将返回的16S rRNA序列使用在线工具NCBI-BLAST进行序列相似性比对，对菌株进行分子鉴定。

3）药敏试验。采用纸片扩散法测定分离菌对10种抗菌药的敏感性。每个抗菌药物的药敏纸片设置3个重复，将接种菌的平板置于28 ℃恒温箱培养18~24 h后，测定各药敏纸片对应的抑菌圈直径。根据抑菌圈直径大小，参考ELSI指南标准判断依据，分析分离菌对各抗菌药物的敏感性。

2 结果与分析

2.1 细菌分离及革兰氏染色鉴定

观察病虾的临床症状可见，虾尾部位有明显水肿，而其他部位未见显著异常（图1A和图1B）。同时，肝胰腺未表现出明显的病理变化（图1C）。从虾尾水肿处组织和肝胰腺组织中进行平板划线分离，均成功分离获得疑似菌落（图1D和1E），且菌落形态特征一致，均为白色圆形菌落。对分离菌株进行革兰氏染色后，在显微镜下观察到大量呈单个分散或成对排列的短杆状革兰氏阴性菌（图1F）。

2.2 16S rRNA扩增、测序与相似性分析

利用细菌16S rRNA通用引物对分离菌进行PCR扩增，并将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。结果如图2所示，2株分离菌（虾尾和肝胰腺来源各1株）均扩增获得约1 600 bp的特异性条带，且阳性对照和阴性对照均成立，表明试验结果可靠。

将PCR产物送样测序后，通过BLAST在线比对分析发现，2株分离菌的16S rRNA基因序列与已知的弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii）具有最高的相似性，均超过99.6%。以上结果提示2株分离菌均为弗氏柠檬酸杆菌。

2.3 2株分离菌对抗菌药物的敏感性

利用纸片扩散法测定2株弗氏柠檬酸杆菌对10种临床常见抗菌药物的敏感性（表1）。

结果显示，2株弗氏柠檬酸杆菌对抗菌药物敏感性方面表现一致，即对头孢哌酮、头孢他啶、卡那霉素和四环素耐药，对氨苄西林、羧苄西林、头孢曲松、庆大霉素、新霉素和多西环素敏感。

3 讨 论

弗氏柠檬酸杆菌属于肠杆菌科，具有较强的环境适应能力和生存能力，广泛分布于自然界环境中，可感染多种宿主，涵盖人类、哺乳动物和水生动物（如鱼类和虾类）^[6]。作为1种条件致病菌，弗氏柠檬酸杆菌是1种典型且常见的人－畜－鱼共患病原体^[7-9]。当宿主体内免疫功能下降或受到其他应激因素影响时，该菌感染可导致人类出现腹泻、肺炎和尿路感染等多种临床症状。在水产养殖业中，该菌感染可引起罗氏虾的肝胰腺组织出现糜烂和活力下降等病变^[6]，同时也是克氏原螯虾发生烂尾病的主要病原之一^[3]。

本研究从发生烂尾病克氏原鳌虾的肝胰腺和尾部组织中成功分离获得优势菌株。通过革兰氏染色观察分离株形态特征，发现其为单个分散或成对排列的短杆状革兰氏阴性菌，其形态学特征初步符合气单胞菌属、弧菌属和假单胞菌属的典型特征。随后，采用PCR扩增该菌株的16S rRNA基因序列，并与数据库中已知菌株进行比对分析。结果表明，该菌株与已知弗氏柠檬酸杆菌的序列相似性最高。因此，可鉴定该分离菌为弗氏柠檬酸杆菌。

抗菌药物在水产养殖业中作为防控传染病的有效手段被广泛应用，然而其不合理使用或长期滥用现象日益突出，这可能导致多重耐药菌株的产生与传播。这不仅会显著降低抗菌药物的临床治疗效果，还可能引发水产品药物残留超标以及耐药基因的水平转移，进而对生态系统平衡和公共卫生安全构成严重威胁^[10-11]。因此，评估分离菌的耐药谱对于科学指导临床用药和保障食品安全具有重要意义。本研究通过药敏试验对分离获得的2株弗氏柠檬酸杆菌进行耐药性分析发现，2株菌对测试抗菌药的敏感性表现出一致性，这为临床防治该病提供了重要的用药参考，可优先使用敏感抗菌药进行治疗。此外，朱能斌等^[12]发现多种复方中草药制剂对弗氏柠檬酸杆菌具有较高的抑菌作用，未来可考虑将其用于防治由该菌引起的疾病。这种综合策略有利于延缓细菌耐药性的发展，符合绿色养殖的发展策略。

参考文献

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