多管发酵法与酶底物法测定水中粪大肠菌群的比较研究

Comparison of determining fecal coliforms in water with multiple tube fermentation method and enzyme substrate method

摘要

目的 比较分析多管发酵法与酶底物法两种方法测定水中粪大肠菌群的优缺点及检测结果的一致性，为水质快速准确低成本检测提供参考。 方法 本研究选取大龙潭水库与车坝河水库的40份地表水水样，通过多管发酵法与酶底物法的对比实验比较2种方法在测定水中粪大肠菌群指标上的优缺点及检测结果的一致性。 结果 多管发酵法与酶底物法检测出水中的粪大肠菌群分别为2 567、2 473 MPN/L，接近真值2 600 MPN/L，二者准确度均高，且在统计学上无显著差异（P>0.05）；但相较于传统多管发酵法，酶底物法的单位检测成本增加。 结论 2种检测方法均适用于水中粪大肠菌群的定量检测，但酶底物法具有准确、快速、操作流程简便的特点，特别在突发性环境污染事件的应急监测中，该方法展现出显著的技术优势。

Abstract

Objectives The advantages and disadvantages of the multiple tube fermentation method and the enzyme substrate method in determining fecal coliforms in water and the consistency of the results were compared and analyzed to provide a reference for the rapid, accurate and low-cost testing of water quality. Methods 40 samples of surface water from Dalongtan Reservoir and Chebahe Reservoir were used to conduct a comparative experiment to compare the advantages and disadvantages of the multiple tube fermentation method and the enzyme substrate method in determining fecal coliforms in water and the consistency of the results. Results The fecal coliforms detected with multi tube fermentation method and enzyme substrate method were 2 567 MPN/L and 2 473 MPN/L, respectively, close to the actual value of 2 600 MPN/L. Both methods had high accuracy, with no significant difference in statistics (P>0.05). However, the unit cost of detection with enzyme substrate method was higher than that with traditional multi tube fermentation method. Conclusions The multiple tube fermentation method and the enzyme substrate method are suitable for quantitatively determining fecal coliforms in water, but the enzyme substrate method has the characteristics of accuracy, rapidity, and simple process of operation. The enzyme substrate method has significant advantages of techniques especially in emergency of monitoring sudden events in environmental pollution.

关键词

粪大肠菌群 / 多管发酵法 / 酶底物法 / 水质检测 / 饮用水安全

Key words

fecal coliforms / multiple tube fermentation method / enzyme substrate method / water quality testing / drinking water safety

饮用水是人类生存的基本需求，也是传播疾病的重要媒介。随着社会的发展，定期展开生活饮用水水质监测，掌握水质变化趋势，是保障人们生活饮用水安全的关键所在^[1]。近年来，随着经济的发展，人口的增加和环境的恶化，我国饮用水安全问题受到威胁。为严格要求保障饮用水卫生安全，对水源提出了更严格的要求。

粪大肠菌群（Fecal coliforms），亦称耐热大肠菌群（Thermotolerant coliforms），在(44.5±0.5) ℃恒温培养（24±2） h条件下，能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。粪大肠菌群来源于人和温血动物的粪便，其检出结果表明水体已受粪便污染，并提示存在肠道致病菌及寄生虫等病原体传播的潜在风险^[2]。因此，在水体检测中，粪大肠菌群可以指示粪便对于水体的污染程度，有助于及时发现和治理相关水体细菌和病毒传播。采用科学实用性高的微生物检测方法，准确、有效地监测水中粪大肠菌群的污染程度，可以及时、可靠地预测并控制流行疾病的传播^[3]。

现行国标中检测方法主要有多管发酵法、滤膜法、酶底物法^[3]，这几种方法在实际应用中各有优缺点。多管发酵法操作步骤较为复杂，需要的试剂器皿较多，阳性结果需经复发酵试验验证，对操作人员的技术水平要求高，对实验环境要求较高^[4]，存在检测周期长、人力投入大等不足，优点是检测费用便宜^[5]；滤膜法操作步骤较多管发酵法相对简单，所需时间较短，但也存在对操作人员的无菌操作要求严格、适用范围较低等不足。而酶底物法凭借其操作流程标准化优势，对实验室环境要求不高，人力成本低，检测时间短，在应急监测及高通量检测场景中更具适用性，但面临试剂成本较高的问题。

为探究多管发酵法与酶底物法2种检测方法在实际应用中的结果是否存在显著差异，本研究选取湖北省恩施州两大饮用水源地——大龙潭水库与车坝河水库的40份地表水水样进行试验分析，通过对比实验检测水中粪大肠菌群指标，系统评价2种检测方法的技术特征，旨在为相关检测人员在工作中选择合适的检测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地点和采样

大龙潭水库（位于清江干流城区上游，总库容为5 200万m³）和车坝河水库（位于清江上游支流屯堡乡境内，总库容5 600万m³），是恩施市第二、三水厂的原水来源，日供水能力达40万t，保障着恩施州城约50万居民和牲畜的饮水安全。两库区均地处低山，属中亚热带季风性湿润气候，海拔不高，四季分明，降水充沛，植被覆盖良好。由于远离集镇、上游无工业污染源，受人类活动影响较小。作为城区重要饮用水水源地，其水质由监测部门依据《地表水环境质量标准》（GB 3838—2002）进行月度例行监测。

本研究在大龙潭水库与车坝河水库分别于枯水期和丰水期进行样品采集，每月采样1次，共采集40份样品。清洁水体的采样量不低于400 mL，其余水体采样量不低于100 mL。用灭菌的采样瓶采样，采样时不得用样品洗涤采样瓶，采样量一般为采样瓶容量的80%左右。采集到的样品2 h内检测，不能立即开展检测的，将样品于4 ℃以下冷藏并在2 h内检测。

1.2 主要试剂、材料

多管发酵法：单倍和三倍乳糖蛋白胨培养基、EC培养基。

酶底物法：MMO-MUG培养基（科立得试剂（Colilert™）试剂）、无菌水。

1.3 主要仪器和设备

多管发酵法：无菌操作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、接种环、试管、酒精灯。

酶底物法：高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、100 mL无菌稀释瓶、程控定量封口机、涡旋振荡器、97孔标准阳性比色盘、97孔定量盘。

1.4 检测方法

依据HJ 347.2—2018《水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法》和HJ 1001—2018《水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠艾希氏菌的测定 酶底物法》分别测定水中粪大肠菌群^[6-7]。

1.5 多管发酵法测定

采用定量接种技术将待测样品注入含溴甲酚紫指示剂（pH 6.8～7.2）的乳糖蛋白胨培养基，于（37.0±0.5） ℃进行初发酵富集培养（24±2） h。目标菌群通过β-半乳糖苷酶催化反应分解乳糖，代谢产物导致培养基pH值降至≤6.8（指示剂显色由紫转黄），同时产气量≥0.5mL（杜氏小管蓄积标准）。初发酵阳性样本经无菌操作转接至含3号胆盐选择剂的EC培养基，于(44.5±0.5) ℃进行复发酵培养(24±2) h，通过双相选择压力（温度耐受/化学抑制）特异性筛选粪大肠菌群。最终依据阳性管数分布矩阵，参照标准MPN查询表进行定量分析。操作步骤如下：

1）初发酵试验。15管法^[6]：将样品充分混匀后，在5支装有已灭菌的5 mL三倍乳糖蛋白胨培养基的试管中（内有导管），按无菌操作要求各加入样品10 mL；在5支装有已灭菌的10 mL单倍乳糖蛋白胨培养基的试管中（内有导管），按无菌操作要求各加入样品1 mL；在5支装有已灭菌的10 mL单倍乳糖蛋白胨培养基的试管中各加入样品0.1 mL。将接种后的试管，在(37±0.5) ℃下培养(24±2) h。通过观察产酸和产气的发酵管来判断试验是否阳性。

2 ）复发酵试验。将初发酵试验中显示为阳性或疑似阳性（只产酸未产气）的试管，用灼烧灭菌幷冷却后的接种环将培养物分别转接到装有EC培养基的试管中。在（44.5±0.5） ℃下培养（24±2） h，培养后立即观察，倒管中产气证实为粪大肠菌群阳性。

在培养基分装灭菌时，要将培养基尽快放于高压蒸汽灭菌器中，在115 ℃灭菌20 min，注意温度要控制好，既要达到灭菌的作用，又要防止营养物质分解流失；灭菌后冷却也要控制到适宜温度，避免影响微生物的活性。

1.6 酶底物法测定

粪大肠菌群在(44.5±0.5) ℃恒温培养(24±2) h，能产生β-半乳糖苷酶，分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黄色的邻硝基苯酚（ONP），产生特征性显色反应（ΔE≥15为阳性阈值）。基于97孔定量盘建立的阳性孔位分布矩阵，结合标准MPN查询表，通过邻硝基苯酚显色效应与菌群代谢活性的剂量反应关系，定量计算菌群浓度值。操作步骤如下：

1）水样稀释。检测所需水样为100 mL^[7]。受污染的水可对水样进行稀释，取10 mL水样加入到90 mL无菌生理盐水中，必要时可加大稀释度。

2）接种。用100 mL的无菌稀释瓶量取100 mL水样，加入一个科立得试剂（Colilert™），在涡旋振荡器上充分混匀，待完全溶解后，将前述100 mL水样全部倒入97孔定量盘内，以手抚平97孔定量盘背面以赶除孔穴内气泡，然后用程控定量封口机封口。

3）培养。将封口后的97孔定量盘放入（44.5±0.5） ℃恒温培养箱中培养24 h。

若待测水样本身浑浊度较高，颜色较黄，要对待测水样用无菌生理盐水进行稀释，稀释后的颜色与阳性比色盘的颜色进行对比，颜色要淡即可。

1.7 结果判读与计数

多管发酵法经过初发酵、复发酵等试验步骤结束后根据阳性管数量，查MPN表得出每100 mL水样中粪大肠菌群的MPN值，再计算出每升水样中粪大肠菌群数量，若有稀释，结果乘以稀释倍数。

酶底物法将水样培养24 h后进行结果判读，若结果可疑，可延长培养时间至28 h进行结果判读，超过28 h后出现的颜色反应不作为阳性结果。对照阳性比色盘观察，分别计算有黄色反应大孔和小孔的阳性孔空穴数量，查97孔定量盘法MPN表得出每100 mL样品中粪大肠菌群的MPN值，再根据稀释倍数得出每升水样的粪大肠菌群数量。

2 结果与分析

2.1 检测结果的准确度对比

选用粪大肠菌群质控样品[编号：HJQC-003，20212076]，分别用多管发酵法和酶底物法对质控样品进行培养分析，质控样品测定结果见表1。结果显示，2种方法的测定结果均在质控范围内。

2.2 检测结果的比对分析

本研究共采集40个水样，分别用多管发酵法和酶底物法测定水中粪大肠菌群。为了使2组数据呈正态分布，先将数据进行对数处理（表2），然后用SPSSAU统计软件，对2种方法的处理结果进行配对t检验，结果见表3。

由表3可见，t=0.716,P=0.478>0.05，即2种方法检测结果在统计学上均没有呈现出差异性。因此，可认为酶底物法与多管发酵法测定水中粪大肠菌群都是可行的，能达到同样的效果。

2.3 成本对比分析

多管发酵法作为粪大肠菌群检测的传统方法，被普遍应用于水质检测行业。不需要昂贵的药品、器皿、设备，只需要购买普通市售的半成品乳糖蛋白胨培养基、EC培养基试剂、培养皿及试管等玻璃器皿，单位检测成本低。酶底物法需购买成品化的MMO-MUG培养基及试剂，定量盘等耗材，另需配备程控定量封口机等设备，检测成本较高，并且进口美国爱德士公司（IDEXX）科立得试剂的价格昂贵，单位检测成本更高。

3 讨 论

多管发酵法作为传统检测方法^[8]，适用范围广，无论微生物含量较低或较高都能达到检测要求，检测成本费用较低。但其操作流程涉及培养基配制、多梯度接种培养及复杂的结果判读等步骤，整个实验周期需48～72 h。该方法对实验环境洁净度、水样保存时限（通常≤6 h）及操作人员技术要求较高，在应对突发性环境事件时存在时效性不足的局限。本研究通过对比实验分析发现，酶底物法与多管发酵法对水中粪大肠菌群检测结果的准确度均高，且在统计学上无显著差异（P>0.05），二者均能满足水质检测的基本要求。但酶底物法在操作流程、检测效率方面存在显著优势。

酶底物法采用预制培养基体系，通过特异性酶促反应实现目标菌群检测，其优势主要体现在^[9]：①操作流程标准化，将实验步骤缩减50%以上，有效降低了操作污染风险；②检测周期缩短至20～24 h，显著提升应急检测响应速度；③便携式检测设备支持现场即时检测，满足突发环境事件中“黄金24小时”的处置时效要求。但该方法在成本控制方面存在不足，目前主要依赖进口试剂（成本约高于传统方法3～5倍），虽然国产试剂价格可降低40%～60%，但检测稳定性仍需进一步验证。

范秀英等^[10]对攀枝花金沙江和雅砻江断面地表水、地下水样品进行比对，结果显示，2种方法对样品的检测结果无显著性差异。但酶底物法采用成品培养基及试剂，操作流程简便，尤其适用于应急监测，与本文研究结论基本一致。

目前饮用水的主要风险还是微生物污染，无论是我国还是欧美等发达国家，与饮用水有关的安全问题大多来自微生物，均将微生物问题列为首位。若饮用水水源地的水检出粪大肠菌群超标，说明水体已受到严重污染，必须采取相应措施。由于酶底物法试剂成本较高，大面积推广还有一定问题。部分发达国家饮用水安全制度比较成熟，而我国由于地域辽阔，城乡发展还有一定差距，农村由于条件限制，净水条件达不到相关要求，农村面临饮用水微生物污染的形势更为严峻。在一定条件下，多管发酵法由于检测成本低，在资源有限的地区，仍具有实用性和重要的应用价值。下一步随着国家城乡一体化建设，推进区域融合，城乡差距缩小，酶底物法由于方法的灵敏度高，时效短，能在短时间内迅速判断出粪大肠菌群的结果，推广应用还是有一定的前景。

酶底物法进口试剂盒具有较好的稳定性，可在全程质量控制下，依据国际标准进行配置，还可以检测出具有病原学意义的大肠艾希氏菌，且无二次污染，24 h内便可得到检测的结果，已经在欧美等发达国家使用，且通过美国EPA方法认证。随着我国饮用水标准与世界接轨，近年来，在生产实践中，我国已经将酶底物法列入国家环境保护行业标准，并通过《生活饮用水标准检验方法 第12部分：微生物指标》（GB/T 5750.12—2023）认证。目前国产酶底物试剂的质量已优化，与进口试剂相比，准确度基本一致。后续研究应着重开发低成本国产化试剂并建立统一的质量标准体系，便于酶底物法进一步在生产实践中得到大面积的推广与应用。

综上所述，建议根据检测场景进行方法选择。常规实验室检测可优先考虑成本较低的多管发酵法；而应急监测、现场快速检测及大批量样品处理等场景，推荐采用酶底物法以保障检测时效性。未来，单分子检测技术、CRISPR生物传感技术、区块链技术等^[11]也将推动饮用水质检测的快速发展。

参考文献

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