一类动物疫病实验室诊断技术的临床应用现状与发展趋势

摘要

为提升一类动物疫病的诊断效率、优化防控策略，以保障养殖业健康发展及公共卫生安全。本文围绕当前一类动物疫病的检测方法展开论述，涵盖病原学检测（如病毒分离鉴定、红细胞吸附试验）、血清学检测（如凝集试验、ELISA、免疫荧光技术）和分子生物学检测（如PCR、qPCR）等传统与现有技术，分析了其在临床应用中的优势与局限，探讨了自动化与智能化、高通量检测、多技术联合应用、现场快速检测等新技术的发展方向，阐述了诊断技术面临的病原体变异、技术局限性、检测成本与基层应用等挑战。现有诊断技术各有优劣，病原学检测准确性高但操作复杂、周期长，血清学检测易受干扰，分子生物学检测对条件要求高；同时面临病原体变异导致检测难度增加、技术存在局限、成本与基层应用不匹配等问题，而新技术的发展为解决这些问题提供了方向。通过梳理诊断技术的应用现状与发展趋势，可为一类动物疫病的高效诊断和有效防控提供依据，助力应对养殖业面临的疫病威胁及公共卫生安全挑战。

关键词

一类动物疫病 / 实验室诊断技术 / 临床应用现状 / 新技术

在全球畜牧业规模化、集约化进程不断加速的当下，一类动物疫病作为对动物与人类危害最为严重的疫病范畴，已然成为制约畜牧业稳健发展、威胁公共卫生安全的关键因素^[1]。

传统的实验室诊断技术，如病原分离培养、血清学检测等，在过去的疫病防控中发挥了重要作用，然而，面对当前一类动物疫病日益复杂的流行态势，如病毒的频繁变异、混合感染的增多等，这些传统技术在检测速度、灵敏度、特异性以及高通量检测能力等方面的局限性逐渐凸显，如传统的病原分离培养方法耗时较长，难以满足疫情紧急处置时快速诊断的需求；血清学检测方法易受疫苗免疫干扰，在疫病鉴别诊断中存在一定的困难。近年来，随着生命科学、材料科学、信息技术等多学科的交叉融合，一系列新兴的实验室诊断技术应运而生，并在一类动物疫病的诊断中展现出巨大的应用潜力。为此，本文围绕当前一类动物疫病的检测方法展开探讨，以期提升一类动物疫病的诊断效率、优化防控策略，从而保障养殖业健康发展及公共卫生安全。

1 一类动物疫病实验室诊断技术的特点及应用

1.1 病原学检测技术

1）病毒分离鉴定。病毒分离鉴定是一类动物疫病诊断的经典方法之一，该方法将临床采集的怀疑感染样品接种于易感的细胞或动物体内，使病毒在其中增殖，然后对分离得到的毒株进行鉴定^[2]。如在非洲猪瘟诊断中，将样品接种于猪原代骨髓细胞、原代白细胞或肺泡巨噬细胞等进行培养，通过观察细胞病变效应等特征来判断病毒是否增殖，该方法在病原检测、流行病学溯源、生物学特性及致病性研究等方面发挥着关键作用，是确定病原体的“金标准”之一 。然而，该方法操作复杂，需要专业的技术人员和特定的实验条件，检测周期长，一般需要数天甚至数周时间，且对样品的要求较高，容易受到污染等因素影响，限制了其在临床快速诊断中的应用^[3]。

2）红细胞吸附试验。红细胞吸附试验的核心原理是利用特定病原体感染宿主细胞后，病毒颗粒会吸附于细胞表面，进而与红细胞发生特异性结合，形成肉眼或显微镜下可见的 “玫瑰花环”现象^[4]。以非洲猪瘟病毒检测为例，红细胞吸附性是其重要特征之一，发病猪的血液或组织悬液接种到相关细胞培养后，若存在非洲猪瘟病毒，病毒会黏附于猪的单核细胞或巨噬细胞表面，产生特征性的“玫瑰花环”现象，可在6 d左右确定结果，通常样本呈强烈阳性时，24~48 h就会出现血液吸附现象，并分离出少量“非血吸附”的毒株^[5]。该方法需要进行原代细胞培养，时间周期长，目前已不再是检测的首选方法，多作为其他检测方法阳性结果确认的参考试验。

1.2 血清学检测技术

1）凝集试验。凝集试验是一类动物疫病血清学检测中的传统技术，包含虎红平板凝集试验、试管凝集试验、微量板凝集试验等。琥红平板凝集试验操作简便、成本低，适用于大面积检疫，但易受多种因素影响出现非特异性反应，阳性结果需进一步确诊；试管凝集试验敏感性较强，是布病诊断法定试验，但存在特异性差等问题；微量板凝集试验基于试管凝集试验发展而来，满足简捷、快速、高通量要求，灵敏度和特异性较高，适用于基层推广。如虎红平板凝集试验灵敏度高、价格便宜、操作方便，但受试验温度和凝集时间等影响，不易准确判定结果，且受操作人员主观判断影响较大，常作为筛选试验用于高危动物筛查及流行病学研究。它们在疫病初步筛查等场景有一定应用，但各自存在局限^[6]。

2）酶联免疫吸附试验（ELISA）。ELISA是目前应用最广泛的血清学检测方法之一，其基本原理是利用抗原与抗体的特异性结合，将抗原或抗体固定在固相载体表面，加入待检样品和酶标记的抗体或抗原，经过一系列洗涤和反应步骤后，通过酶催化底物显色来检测样品中是否存在相应的抗体或抗原^[7]。在一类动物疫病检测中，如口蹄疫、禽流感等的抗体检测，ELISA具有操作简便、可同时检测大量样品、结果相对快速、易于标准化等优点，适合实验室常规检测^[8]。在犬猫抗体检测中，ELISA可用于疫苗接种后抗体水平检测、疾病诊断、母源抗体检测和免疫监测等，但该方法也存在一些局限性，如容易出现非特异性反应导致假阳性结果，对于低水平抗体的检测灵敏度有限，且只能提供病原感染的间接证据，在疫苗普遍使用的情况下，难以准确区分感染动物和免疫动物。

3）免疫荧光技术。免疫荧光技术用荧光素标记抗体，与待检样品中的抗原结合，在荧光显微镜下观察，若存在特异性荧光，则表明样品中存在相应抗原。该技术具有高灵敏度和特异性，检测结果直观，可直接观察到抗原在组织或细胞中的分布情况，常用于病毒、细菌等病原体的检测，如对感染口蹄疫病毒的动物组织进行检测^[9]。不过，免疫荧光技术需要荧光显微镜等特殊设备，操作相对复杂，对技术人员要求较高，检测成本相对较高，在一定程度上限制了其广泛应用。

1.3 分子生物学检测技术

1）聚合酶链式反应（PCR）。PCR技术是一类动物疫病分子诊断的核心技术之一，其原理是在体外模拟DNA复制过程，通过设计特异性引物，以样品中的核酸为模板，在DNA聚合酶的作用下，经过高温变性、低温退火和适温延伸等循环步骤，使目的核酸片段得到指数级扩增，扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测，若出现特异性条带，则表明样品中存在相应病原体的核酸^[10]。PCR技术具有灵敏度高、特异性强、快速等优点，能够检测出极微量的病原体核酸，可用于多种一类动物疫病的早期诊断，如非洲猪瘟、高致病性禽流感等；但PCR技术也存在一些缺点，如对实验环境和仪器设备要求较高，操作过程中容易出现交叉污染导致假阳性结果，且对样品的质量要求严格，若样品中存在抑制剂可能导致假阴性结果^[11]。在猪流行性腹泻病毒检测中，可通过RT-PCR检测粪便样品，经提取核酸、扩增等步骤判断是否存在病毒。

2）实时荧光定量PCR（qPCR）。qPCR是在PCR技术基础上发展起来的一种核酸定量检测技术。该技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增过程，通过标准曲线对样品中的核酸进行定量分析^[12]。在一类动物疫病检测中，qPCR不仅能够快速准确地检测病原体核酸的存在，还能对病原体的载量进行定量，有助于评估疫情的严重程度和治疗效果，如在禽流感病毒检测中，可通过qPCR定量检测病毒核酸含量，判断病毒在动物体内的复制情况；qPCR具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高、检测速度快等优点，可有效避免PCR扩增后开盖检测带来的交叉污染问题，但仪器设备价格昂贵，检测成本相对较高。

2 一类动物疫病实验室诊断技术面临的挑战

2.1 病原体变异

一类动物疫病病原体如病毒、细菌等容易发生变异，导致其抗原性、致病性等发生改变，这使得传统的诊断技术难以准确检测和鉴定变异后的病原体，增加了诊断的难度，以禽流感病毒为例，它是RNA病毒，缺乏RNA聚合酶的校对功能，再加上免疫原性选择和基因片段的频繁重排，使得其进化速度极快，这些变异导致病毒的抗原性、致病性发生改变，让传统诊断技术难以招架。针对流感病毒不同检测方法的灵敏度进行分析，结果显示HA-TC的灵敏度显著下降（P=0.02），RIA的灵敏度也降低了（从72%降至44%，P=0.2）。这充分说明，病毒变异对诊断试剂的灵敏度和特异性影响巨大，很容易造成漏检或误诊的情况^[13]。

2.2 检测技术的局限性

不同的诊断技术都存在一定的局限性，如病原学检测技术虽然准确性高，但操作复杂、周期长，在病原学检测技术中，传统的病毒分离鉴定方法耗时久，病毒在畜禽中的传播速度较快，而传统实验室检测至少需要24 h才能得出结果。若检测不及时，畜禽死亡率可能从正常情况下的10%急剧上升至50%以上 ，给养殖业带来巨大损失；血清学检测技术易受疫苗免疫等因素干扰，且只能提供间接证据；分子生物学检测技术对实验条件和操作人员要求较高，容易出现假阳性或假阴性结果，此外，现有的检测技术在检测通量、自动化程度等方面还不能完全满足大规模疫病监测和快速诊断的需求。

2.3 检测成本与基层应用

一些先进的诊断技术如高通量测序、数字PCR等虽然具有高灵敏度和高准确性，但仪器设备昂贵，检测试剂成本高，难以在基层实验室推广应用，以数字PCR技术检测为例，单次检测成本约为300~500元。对于一个年出栏5万只畜禽的养殖场来说，若按照定期检测的标准，每年仅检测成本就将达到数万元。一旦遭遇疫情暴发，检测支出可能占养殖总成本的15%以上，这对于利润微薄的养殖户而言难以承受。此外，基层技术人员专业素质参差不齐，基层实验室在动物疫病防控中承担着重要的疫情监测和初筛任务，检测技术和设备的不足限制了其防控能力的发挥，同时，基层技术人员的专业素质和技术水平相对较低，也影响了先进诊断技术的应用效果^[14]。

2.4 生物安全风险

一类动物疫病实验室在处理高致病性病原样本时，生物安全风险贯穿于样本接收、操作、储存及废弃物处理等全流程。在样本接收与转运环节过程中，容器密封不严，导致含病原体的液体泄漏，污染转运工具、运输车辆甚至周边环境。此外，部分基层单位对样本包装不规范，或运输过程中温度失控，可能导致病原体活性异常，增加泄漏后扩散风险。还有样本储存台账混乱，可能造成样本误拿、错用，或因长期无人管理导致过期样本泄漏后未被及时发现，形成潜在扩散隐患。还有操作人员在进行样本处理时，违规操作引发病原体气溶胶扩散或液体飞溅。同时，部分实验室设备老化，或未按规定定期校准维护，会导致防护功能下降，使操作人员直接暴露于病原体环境中。此外，操作人员个人防护不到位，也会增加接触感染风险。还有废弃物处理不当，实验后的废弃物未按生物安全规范进行高压灭菌或化学消毒，直接作为普通垃圾处理，可能导致病原体通过垃圾清运环节扩散到实验室外。此外，部分实验室对锐器处理不规范，可能造成清运人员刺伤，引发感染。这些风险不仅威胁实验室操作人员的健康安全，还可能导致病原体突破实验室屏障，进入外界环境引发动物疫情反弹或跨物种传播，对公共卫生安全构成严重挑战。

3 一类动物疫病实验室诊断技术的发展趋势

3.1 自动化与智能化

随着科技的不断进步，自动化和智能化的诊断设备将逐渐成为主流，如自动化的核酸提取仪、全自动生化分析仪、智能诊断系统等的应用，可大大减少人为操作误差，提高检测效率和准确性；智能诊断系统结合人工智能和大数据技术，能够对检测数据进行快速分析和处理，自动识别病原体特征，实现智能化诊断，如通过深度学习算法对大量病原体的核酸序列数据和临床症状数据进行分析，建立诊断模型，可快速准确地诊断动物疫病，为疫情防控提供及时的决策支持。

3.2 高通量检测技术

高通量检测技术能够同时对多个样品或多种病原体进行检测，大大提高检测效率，满足大规模疫病监测和筛查的需求，如基因芯片技术，可将大量的核酸探针固定在芯片上，一次检测可同时分析多种病原体的基因信息^[15]；高通量测序技术能够对病原体进行全基因组测序，不仅可用于病原体的鉴定，还能深入了解病原体的遗传变异、进化规律等信息，为疫病防控提供更全面的依据，未来，高通量检测技术将不断发展和完善，检测通量将进一步提高，成本将逐渐降低。

4 结 语

一类动物疫病实验室诊断技术在动物疫病防控中起着至关重要的作用。目前，传统检测技术仍在广泛应用，新兴分子生物学技术已成为主流，同时生物传感器、人工智能等前沿技术也展现出了巨大的应用潜力。未来，一类动物疫病实验室诊断技术将朝着技术集成与融合、即时检测、大数据与物联网应用、标准化与质量控制等方向发展，不断研发和应用新的诊断技术，提高诊断的准确性和效率，对于有效防控一类动物疫病，保障畜牧业的健康发展和公共卫生安全具有重要意义。

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