6种大熊猫食用竹叶的风味成分分析

The flavor components in leaves from six types of bamboo consumed by giant pandas

摘要

目的 探究大熊猫食用竹叶的风味成分差异，为大熊猫类珍稀动物的食物供给及遴选提供参考。 方法 通过电子鼻和气相色谱-质谱（GC-MS）仪，分析6种（刺黑竹、冷箭竹、箬竹、苦竹、毛竹和孝顺竹）竹叶的挥发性风味物质，并通过风味活性值（OAV）比较各风味成分对不同竹叶总体风味的贡献程度。 结果 雷达图显示：6种竹叶在W1W(硫化物、萜烯类)、W1S(甲基类)、W2W(硫化物、萜烯类)、W2S（醇类、醛类、酮类）4个传感器的响应值存在明显差异；主成分分析（PCA）结果显示刺黑竹、苦竹和毛竹能与其他竹叶完全分开，冷箭竹、箬竹和孝顺竹存在部分重叠。GC-MS分析结果显示，从6种竹叶中共检测出155种挥发性成分。各竹叶检测到的风味物质种类数量为刺黑竹110种、苦竹90种、冷箭竹67种、毛竹71种、箬竹65种、孝顺竹59种。主要类别包括醇类、醛类、酮类、酯类、酸类、杂环类、萜类、酚类、烷烃等。共筛选出31种特征风味物质，各种竹叶的特征风味物质种类与贡献度不同。 结论 不同竹叶的风味特征差异显著，刺黑竹、苦竹和毛竹风味轮廓更为独特，这为大熊猫的食竹筛选与营养调控提供了直接参考。

Abstract

Objectives The differences in flavor components of bamboo leaves consumed by giant pandas were studied to provide references for the food supply and selection of rare animals like giant pandas. Methods An electronic nose and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analyzer were used to analyze the volatile flavor compounds in leaves from six types of bamboo including prickly Black Bamboo, Cold Arrow Bamboo, Nori Bamboo, Bitter Bamboo, Moso Bamboo, and Filial Piety Bamboo. The contribution of various flavor components to the overall flavor in leaves from different bamboo was compared with flavor activity value (OAV). Results Radar charts from electronic nose analysis showed that there were significant differences in the response value of leaves from six types of bamboo across four sensors including W1W (sulphides, terpenoids), W1S (methyl compounds), W2W (sulfides, terpene), and W2S (alcohols, aldehydes, ketones). The results of principal component analysis (PCA) showed that leaves of prickly Black bamboo, Bitter bamboo, and Moso bamboo were completely separated from leaves of other bamboo, while leaves of, Cold Arrow Bamboo, Nori Bamboo, and Filial bamboo showed partial overlap. The results of GC-MS analysis showed that a total of 155 volatile components were detected in the leaves from six types of bamboo. The number of flavor compounds detected in the leaves from each bamboo was as follows: 110 in prickly black bamboo, 90 in bitter bamboo, 67 in cold arrow bamboo, 71 in moso bamboo, 65 in nori bamboo, and 59 in filial bamboo. The main categories included alcohols, aldehydes, ketones, esters, acids, heterocyclic compounds, terpenoids, phenols, and alkanes. A total of 31 characteristic flavor compounds were screened, and the types and contributions of characteristic flavor compounds in leaves from various bamboo were different. Conclusions It is indicated that the characteristics of flavor in leaves from different bamboo vary significantly, with the profiles of flavor in leaves from prickly black bamboo, bitter bamboo, and moso bamboo being particularly unique. It will provide direct reference for screening bamboo consumed by giant pandas and regulating the nutrition of giant pandas.

Graphical abstract

关键词

食用竹叶 / 电子鼻 / 气相色谱-质谱联用 / 香气成分 / 大熊猫 / 挥发性风味物质 / 特征风味物质

Key words

edible bamboo leaf / electronic nose / gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) / aroma components / giant panda / volatile flavor substances / characteristic flavor compounds

竹叶是大熊猫主食之一，目前可供大熊猫食用的竹叶种类繁多，包括苦竹、巴山木竹、拐棍竹、冷箭竹、箬竹、刺竹和八月竹等^[1]。竹叶具有较高的营养价值和药用价值^[2]，除粗蛋白、粗脂肪、粗纤维和粗灰分以外，还含有氨基酸^[3]、微量元素^[4]和维生素^[5]等营养物质以及黄酮类、生物碱、皂苷和多糖等天然活性成分^[6-8]。目前，已有大量有关竹叶营养组成和含量的报道^[9-10]，但关于竹叶中香气成分的研究还相对较少。杨楠等^[11]通过测定5种竹叶中挥发性成分，探究大熊猫择食的气味机理，发现竹叶中突出的清香、轻微的甜香和新鲜气息可能是诱导圈养大熊猫择食这5种竹叶的主要原因。傅金和等^[12]观察发现，大熊猫在取食前会先用鼻子嗅一嗅，然后再取食，可见竹叶的气味是影响大熊猫采食的重要因素。因此，开展对竹叶香气成分的研究有助于探索大熊猫的择食偏好。

鉴于风味是动物鉴别是否喜欢某种食物的重要感官刺激之一，食物不仅关系到饲养动物的健康和营养平衡，而且会直接影响其发育、繁衍后代等重要生理过程。因此，探究食物挥发性风味，对珍稀动物的饲养及保护至关重要，尤其对濒临灭绝的珍稀动物及国家重点保护动物。因此，本研究以成都大熊猫繁育研究基地日常喂养大熊猫的6种竹叶（刺黑竹、冷箭竹、箬竹、苦竹、毛竹和孝顺竹）为试验对象，采用电子鼻联用GC-MS对竹叶总体香气成分进行定性定量分析，结合特征风味物质探究6种竹叶总体香气成分是否存在差异，并分析香气差异形成的原因，以期为大熊猫类珍稀动物的食物供给及遴选提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

刺黑竹（Chimonobambusa purpurea）、冷箭竹（Arundinaria faberi）、箬竹（Indocalamus tessellatus）、苦竹（Pleioblastus amarus）、毛竹（Phyllostachys edulis）、孝顺竹（Bambusa multiplex）6种竹叶，于2024年2月19日采自四川省成都市大熊猫繁育基地，竹龄4~5年，均为人工饲养条件下大熊猫常食竹种。新鲜样品取回后剪碎成0.5 cm×0.5 cm的小叶片，备用。

1.2 仪器与试剂

1）分析仪器。PEN 3型电子鼻，德国Airsense公司，内置10个不同金属传感器，详见表1；PAL RSI 85型GC-MS联用仪，美国Agilent公司；DB-WAX石英毛细管色谱柱（60 mm×0.25 mm×0.25 μm），美国Agilent公司；20 mL顶空瓶及其相应的密封垫和铝盖，美国Agilent公司。

2）试剂。2，4，6-三甲基吡啶，日本TCI公司。

1.3 试验方法

1）电子鼻分析。准确称取1.0 g竹叶样品置于20 mL顶空进样瓶，密封，室温下平衡45 min。进样针插入顶空进样瓶，取顶空气体进行检测，检测分析时间为95 s，自动清洗时间为100 s^[13]。每个样品平行测定3次。

2）挥发性风味物质测定。主要包括：

①样品制备。参考鲜义坤等^[14]和Shen等^[15]的方法并作出修改，准确称取3.0 g竹叶样品置于20 mL顶空进样瓶密封。

②萃取。将顶空瓶置于60 ℃恒温水浴中，磁力搅拌（500 r/min），平衡20 min（使挥发物充分释放至顶空）。

③气相色谱仪（gas chromatography，GC）条件。进样口温度为250 ℃，载气为高纯氦气，柱流量为0.80 mL/min，进样模式为分流，分流比为5∶1。程序升温：初温60 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升温到200 ℃，停留2 min，再以10 ℃/min升温到250 ℃停留5 min。

④质谱仪（mass spectrometry，MS）条件：电子电离源，离子源温度为250 ℃，电子能量为70 eV，传输线温度为280 ℃，MS四级杆温度为180 ℃；扫描范围：35~500 m/z。每个样品平行测定3次。

⑤质谱条件。EI离子源（70 eV）；离子源温度230 ℃；扫描范围35~450 m/z。

1.4 数据处理

采用电子鼻自带Winmuster软件和Origin 2024进行数据处理及绘图。

2 结果与分析

2.1 6种竹叶电子鼻分析

1）雷达图分析。为了更直观地反映样品之间的整体气味信息，本研究对6种竹叶进行电子鼻分析并绘制气味雷达图，如图1所示，10个传感器对6种竹叶均存在不同程度的响应。在所有竹叶样品中，W2S（醇类、醛类、酮类）和W6S（氢化物）2个传感器均处于较高响应值水平，表明醇类、醛类、酮类和氢化物可能是6种竹叶共同的主要风味贡献物。

此外，6种竹叶样品在W3S（长链烷烃）、W1C（芳香化合物、苯类）、W5S（氮氧化合物）、W3C（氨类化合物）、W6S（氢化物）和W5C（短链烷烃）6个传感器上的响应强度差异较小。在W1W（硫化物、萜烯类）、W1S（甲基类）和W2W（芳香成分、有机硫化物）3个传感器上，苦竹、毛竹和箬竹的响应强度与其他3组样品差异较大，且响应强度：苦竹>毛竹>箬竹，这表明苦竹、毛竹和箬竹具有更高的萜烯类、甲基类以及芳香化合物含量。在W2S（醇类、醛类、酮类）传感器上，刺黑竹的响应强度显著大于其他组，表明刺黑竹具有更高的醇类、醛类和酮类物质含量。

2）主成分分析。图2为通过PCA分析6种竹叶气味的空间分布和距离。结果显示，6种竹叶样品的区分度明显，且第一主成分的贡献率为81.1%，第二主成分的贡献率为14.6%，贡献率之和为95.7%，累计贡献率表明能代表竹叶样品的主要信息特征。

6种竹叶样品在4个区域中均有分布，各组内散点相互聚集，表明试验稳定性和重复性较好。其中，刺黑竹、苦竹和毛竹能与其他竹叶完全分开，且在PC1上差异较大，表明这3种竹叶与其他竹叶气味存在较大差异。冷箭竹、箬竹和孝顺竹部分重叠，表明3种竹叶气味存在一定相似性。

电子鼻雷达图和PCA主成分分析结果显示，6种竹叶的整体气味信息各不相同，气味存在一定差异，这种差异可能是由萜烯类、甲基类、醇类、醛类、酮类以及芳香化合物等挥发性物质的种类和含量不同造成。

2.2 6种竹叶GC-MS分析

通过GC-MS对6种竹叶中的挥发性风味物质进行定性定量分析。6种竹子的挥发性物质含量结果（表2）显示，除了刺黑竹中含量最高风味物质是醇类（35.91%）外，苦竹、冷箭竹、毛竹、箬竹、孝顺竹中含量最高的风味物质均为萜类，其含量分别为26.97%、34.30%、28.45%、46.26%、31.96%。

6种竹叶各自风味物质种类及数量见图3，刺黑竹中共检测出110种风味物质，苦竹90种，冷箭竹67种，毛竹71种，箬竹65种，孝顺竹59种，其中6种竹叶共有的风味物质有43种（正己醇、植物醇、苯乙醛、正己醛、2-己烯醛等），刺黑竹特有风味物质20种（L-紫苏醇、1-乙酸酯4-己烯-1-醇、α-松油醇、2-戊烯等），苦竹特有风味物质12种（1-庚烯-4-醇、2,3-戊二酮、正己酸等），冷箭竹特有风味物质12种（肉豆蔻油酸、环十四烷等），毛竹特有风味物质2种（香叶醇、橙花醇等），箬竹特有风味物质2种（6-甲基-5-庚烯-2-醇、香橙烯），孝顺竹特有风味物质3种（正己酸乙烯酯等）。结合图3和表3，6种竹叶挥发性风味物质含量大小顺序依次为：苦竹（33 927.29 μg/kg）>刺黑竹（21 171.17 μg/kg）>毛竹（15 632.95 μg/kg）>孝顺竹（14 422.75 μg/kg）>冷箭竹（8 402.18 μg/kg）>箬竹（7 003.26 μg/kg），品种不同

导致各竹叶样品中挥发性物质种类有所不同，各竹叶之间挥发性风味物质含量差异较大，从而导致不同竹叶风味的差异。

从表3中可以看出，醇类和萜类化合物是6种竹叶中最主要的风味化合物，其中正己醇、叶醇和芳樟醇3种风味物质在6种竹叶中均有检出且含量较高，正己醇具有淡青的嫩枝叶气息，微带酒香、果香和脂肪气息，叶醇主要表现为清新浓郁的嫩叶清香，芳樟醇具有浓郁的新鲜水果和花香气，对竹叶气味起到了积极影响。此外，刺黑竹中检测到了高含量的2-戊醇、紫苏醇和α-松油醇，2-戊醇主要表现为葡萄酒香和醚香，紫苏醇表现为草香，稍有木香和花香，α-松油醇表现为清新的花香。苦竹中检测到了高含量的苯甲醇、1-戊烯-3-醇和茴香脑，苯甲醇主要表现为薄荷甜香，1-戊烯-3-醇主要表现为水果香气，茴香脑具有强烈的香气。冷箭竹中检测到了较低含量的3-蒈烯和高含量的己酸叶醇酯，3-蒈烯具有松香和柠檬香气，己酸叶醇酯具有水果清香。毛竹中检测到了高含量的顺-2-己烯-1-醇，带有甘甜的香气。箬竹中检测到了(+)-香橙烯，具有独特的香气。

在醛类物质方面，6种竹叶中均检测到了高含量的苯乙醛、正辛醛、β-环柠檬醛、2-己烯醛、异戊醛和正丁醛，而α-环柠檬醛在刺黑竹和苦竹中检出，苯甲醛在刺黑竹和冷箭竹中检出且含量较高，毛竹中检测到了显著高于其他竹叶的正己醛，该物质略带刺激性气味。

在酮类物质方面，3-辛酮、α-紫罗酮和2-戊酮在6种竹叶中均有检出且含量较高，在刺黑竹和苦竹中六氢假紫罗酮、β-紫罗兰酮和β-二氢紫罗兰酮这类带有紫罗兰香气的风味物质含量显著高于其他竹叶。另外，苦竹中检测到了较低含量的苯乙酮，冷箭竹中检测到了较低含量的仲辛酮。

酯类、酸类和酚类物质在6种竹叶中占比较小，含量较低，酯类主要包括水杨酸甲酯、γ-己内酯、二氢猕猴桃内酯和乙酸己酯，这些物质主要表现为果香和花香。酸类主要包括月桂酸和反式-2-己烯酸等，这些物质主要表现为特殊油脂香气。酚类物质主要包括4-乙烯基-2-甲基苯酚（甜辣果木香味）和丁香酚（甘甜的花香和辛香），箬竹中未检测到酚类物质。值得一提的是，苦竹中检测出了高含量的Z,Z-3-己酸-3-己烯酯和正己酸，Z,Z-3-己酸-3-己烯酯呈青草和生番茄香气，有梨和甜瓜香韵，正己酸具有椰子油脂气味。刺黑竹中检测到了香芹酚，主要表现为木香气。

6种竹叶中共检测出2种杂环类化合物，2-乙基呋喃在各竹叶样品杂环类物质中占比最大：刺黑竹中92.86%、苦竹中94.40%、冷箭竹中96.74%、毛竹中97.99%、箬竹中93.88%、孝顺竹中98.74%，2-乙基呋喃呈强烈焦香香气，是6种竹叶杂环类化合物中主要香气贡献物质。

烷烃和其他类化合物在6种竹叶中占比较小，风味贡献度较低。正十二烷（似汽油味）和异香兰素（橄榄香气和浓郁的奶香）在所有样品中均有检出，环十四烷（蜡味）仅在冷箭竹中有检出，亚甲基环己烷（辛辣的气味）仅在刺黑竹中有检出，香兰素（豆香气及浓郁的奶香）仅在冷箭竹中有检出，间二甲苯（强烈芳香气味）仅在刺黑竹中有检出。

2.3 不同竹叶风味活性值(OAV)分析

香气成分含量的高低并不能作为判定竹叶香气的特征依据，通常赋予竹叶香气特征的是具有较高OAV值的成分，为进一步探究不同竹叶香气差异，本研究根据测定的风味物质含量及其在水中的嗅觉阈值计算OAV值。由表4（不显示＜1的组分）可知，6种竹叶共确定31种对竹叶总体香气起到贡献作用的挥发性成分，包括5种醇类、10种醛类、6种酮类、3种酯类、4种萜类、1种酚类、1种杂环类和1种酸类。其中，有11种共有香气物质，分别为辛醇、芳樟醇、正己醇、苯乙醛、正辛醛、异戊醛、己酸、2-己烯醛、2-乙基呋喃、α-紫罗酮和β-环柠檬醛。

刺黑竹中确定21种特征风味物质（OAV值>1），贡献度最大的是己酸己酯（果香）、2-乙基呋喃（咖啡香）、β-二氢紫罗兰酮（花香、果香）和反式-2-壬烯醛（芳香）。此外，刺黑竹中己酸己酯（果香）和β-二氢紫罗兰酮（花香）2种物质香气贡献度显著高于其他组，特有特征风味物质有(E)-3-己烯基乙酸酯（果香）和α-松油醇（花香）。

苦竹中确定24种特征风味物质，贡献度最大的是芳樟醇（花香）、苯乙醛（果香）、异戊醛（果香）、己酸（油香）、2-乙基呋喃（咖啡香）、β-环柠檬醛（果香）和反式-2-壬烯醛（芳香），此外苦竹中苯乙醛（果香）、正辛醛（果香）、异戊醛（果香）、己酸（水果油脂香气）、水杨酸甲酯（药草香）、2-乙基呋喃（咖啡香）、(Z)-4-庚烯醛（奶油香）、β-环柠檬醛（果香）和反式-3-己烯-1-醇（蘑菇香味）9种物质香气贡献度高于其他组，特有特征风味物质有叶醇（嫩叶清香）、1-戊烯-3-醇（油脂香气）、1-戊烯-3-酮（油脂香气）和6-甲基-2-庚酮（樟脑味）。

冷箭竹中确定18种特征风味物质，贡献度最大的是2-乙基呋喃（咖啡香），与其余组分相比其风味物质香气贡献度较低，不含有特有特征风味物质。

毛竹中确定23种特征风味物质，贡献度最大的是芳樟醇（花香）、异戊醛（果香）、β-紫罗兰酮（花香）、2-己烯醛（果香）、2-乙基呋喃（咖啡香）和反式-2-壬烯醛（芳香），此外毛竹中正丁醛（清香）、2-己烯醛（果香）、顺式-2-己烯-1-醇（甜香）、反式-2-壬烯醛（芳香）、反式-2-己烯醛（果香）和反式-2-癸烯醛（花香）6种物质香气贡献度高于其他组，特有特征风味物质有香叶醇（花香）和正己醛（青草及果香）。

箬竹中确定16种特征风味物质，贡献度最大的是β-紫罗兰酮（花香）和2-乙基呋喃（咖啡香），且箬竹中β-紫罗兰酮（花香）香气贡献度高于其他组，不含有特有特征风味物质。

孝顺竹中确定18种特征风味物质，贡献度最大的是芳樟醇（花香）和2-乙基呋喃（咖啡香），此外孝顺竹中芳樟醇（花香）、丁香酚（花香）和反式-2,4-已二烯-1-醇（坚果味）香气贡献度高于其他组，不含有特有特征风味物质。

3 讨 论

杨楠等^[11]的研究聚焦于圈养大熊猫的采食选择，发现不同竹叶的气味差异主要归因于氮氧化物与萜烯类化合物的分布不同，而甲基类、醇类、醛类和酮类等物质的贡献相对有限。与之相比，本研究的电子鼻雷达图与PCA分析结果揭示了更为复杂的风味构成：萜烯类与甲基类物质（W1W、W1S传感器）是区分苦竹、毛竹等品种的关键变量；同时，醇类、醛类及酮类（W2S传感器）在刺黑竹中展现了显著的高响应值，构成了其独特的风味轮。这表明，本研究中所观察到的竹叶整体气味差异，是由萜烯类、甲基类、醇类、醛类、酮类及芳香化合物等多种挥发性物质共同作用的结果，其主导风味因子与前人研究存在异同。

通过对6种竹叶挥发性成分的系统分析发现，醇类与萜类化合物是构成其风味特征的主要组分。其中，正己醇、叶醇与芳樟醇在全部样品中均被检出且含量较高，可视为竹叶共有的关键香气物质，这与鲜义坤等^[14]关于圈养大熊猫与小熊猫所食竹叶气味成分的研究结论一致，后者所识别出的典型香气成分也以醛类和醇类为主。值得注意的是，刺黑竹叶的挥发性组分表现出明显的独特性。

通过对6种竹叶的电子鼻与GC-MS联合分析，本研究阐明了其整体香气差异的形成原因。电子鼻与PCA分析表明，刺黑竹、苦竹和毛竹的香气轮廓独特且能完全区分，而冷箭竹、箬竹和孝顺竹则因香气相似而部分重叠。GC-MS从化合物层面揭示了上述差异的机理：共鉴定出155种挥发性成分，苦竹的总含量最高，箬竹最低，与电子鼻响应趋势一致。OAV值用于评价挥发性物质对香气的贡献，通常认为OAV值>1的物质对香气有贡献，其值越大表明贡献越大^[16]，进一步筛选出31种OAV≥1的特征风味物质，发现其种类与贡献度是决定香气差异的关键。冷箭竹因特征物质种类少、贡献度低，导致其传感器响应值普遍较低；苦竹则因特征物质丰富且贡献度高，响应强烈。此外，冷箭竹、箬竹与孝顺竹均以2-乙基呋喃为主要风味物质，且缺乏特有成分，导致其PCA分布重叠；而刺黑竹、苦竹与毛竹因风味物质多样且各含特有成分，得以在气味上显著区分。

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基金资助

成都市科技局重点研发支撑计划项目(2023-YF09-00017-SN)