2024年银川市狂犬病免疫抗体水平检测与分析

Detecting and analyzing the level of immune antibodies against rabies in dogs in Yinchuan City, Ningxia Hui Autonomous Region in 2024

摘要

目的 为了解宁夏银川市辖区内犬只狂犬病免疫抗体水平，及时掌握狂犬病免疫情况。 方法 采集银川市4个区域（金凤区、西夏区、兴庆区、贺兰县）的动物诊疗机构的犬血清样本237份，唾液拭子234份，采用ELISA抗体检测和实时荧光RT-PCR检测方法分别对狂犬病免疫抗体和病原进行检测。 结果 ELISA抗体检测的237份犬血清样本中，200份呈阳性，37份呈阴性；实时荧光RT-PCR检测的234份犬唾液拭子均呈阴性。 结论 狂犬病免疫抗体检测群体阳性率为85.47%，群体保护率为66.24%，未达到世界动物卫生组织（WOAH）公布的有效防控标准，需进一步提高养犬人的防护意识，注重防疫人员的专业能力培养，确保疫苗免疫保护有效性。

Abstract

Objectives The level of immune antibodies against rabies in dogs within the jurisdiction of Yinchuan City, Ningxia Hui Autonomous Region was investigated to timely grasp the immunization status of rabies. Methods 237 serum samples and 234 saliva swabs of dogs were collected from institutions of animal diagnosis and treatment in four districts of Yinchuan City including Jinfeng District, Xixia District, Xingqing District, Helan County. ELISA antibody detection and real-time fluorescence RT-PCR detection methods were used to detect pathogens and immune antibodies against rabies. Results Out of 237 serum samples of dogs detected with ELISA antibody, 200 were positive and 37 were negative. 234 saliva swabs of dogs detected with real-time fluorescence RT-PCR were all negative. Conclusions The positive rate of detecting immune antibody against rabies in the population was 85.47%, and the protection rate in population was 66.24%, which did not meet the effective standards of prevention and control announced by the World Organization for Animal Health (WOAH). It is necessary to further enhance the awareness of protection among dog owners, pay attention to train the professional ability of personnel in epidemic prevention, and ensure the effectiveness of protection with vaccine immunization.

关键词

狂犬病 / 抗体检测 / 免疫 / 流行病学调查 / RT-PCR

Key words

rabies / antibody detection / immunization / epidemiological investigation / RT-PCR

狂犬病是一种人畜共患传染病，可感染人、犬、蝙蝠、浣熊和狐狸等哺乳动物，并引发大脑和脊髓等部位致命性炎症^[1]。一旦出现临床症状，人类死亡率近乎100%^[2]。在亚洲和非洲，该病造成的公共卫生问题更为严峻^[3]。近10年来，我国狂犬病发病率呈逐年下降趋势，2007年报告的病例最多（3 300例），而后逐年下降，2020年报告病例202例（数据来源于中国疾病预防控制中心https://www.chinacdc.cn/jkkp/）。国家动物狂犬病参考实验室2010－2020年对212例疑似动物狂犬病病例检测显示，农村犬仍然是狂犬病病毒传播的重要宿主^[4]。2013年内蒙古地区有研究表明，随着狐狸和其他野生动物狂犬病发病数增加，狐狸致人感染狂犬病的风险持续上升，对牲畜和公共卫生的威胁加剧^[5]。2016－2020年，中国报告2 074例人类狂犬病病例，虽病例总数呈逐年下降趋势^[6]，但全球仍有100多个国家和地区有狂犬病流行，大部分病例发生在亚洲和非洲国家，年死亡病例数约59 000例，这与没有广泛接种疫苗有密切关系^[7]。

狂犬病目前尚无有效的治疗手段，疫苗免疫是唯一预防途径，犬只疫苗免疫更是有效筑牢狂犬病防控的“第一道防线”，对公共健康意义重大^[8]。当前我国每年用于犬猫狂犬病的免疫疫苗量大约有3 700万剂，其中国产疫苗2 700万剂，进口疫苗1 200万剂。但因犬猫总量达1.1亿只，疫苗覆盖率仅约1/3^[9]，防疫漏洞显著，这导致我国狂犬病发病水平高于其他发达国家。WHO和WOAH认为体内中和抗体水平≥0.51 U/mL时，机体能抵抗该病的感染；动物免疫覆盖率达到70%时，可有效控制狂犬病的传播。

因此，在狂犬病控制过程中，通过提高犬狂犬疫苗免疫覆盖率并结合抗体监测，可有效防止免疫失败及漏免现象，这对于控制我国狂犬病的流行传播有着十分重要的意义^[10]。基于此，本研究以2024年银川地区犬只狂犬病免疫情况为样本，采集237份犬血清和234份犬唾液拭子，开展狂犬病ELISA抗体检测与病原学检测，旨在掌握银川市宠物犬狂犬疫苗的免疫情况，为区域狂犬病防控提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 样品来源

犬血清、唾液拭子均采自银川市4个区域（金凤区、西夏区、兴庆区、贺兰县，分别编号为区域1、2、3、4）的动物诊疗机构。犬血清样品共采集237份，56 ℃灭活后，-20 ℃保存备用；犬唾液拭子共采集234份，-20 ℃保存备用。

1.2 试验器材

狂犬病ELISA抗体检测试剂盒（北京金诺百泰生物技术有限公司）；狂犬病病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒（北京世纪元亨动物防疫技术有限公司）、核酸提取试剂盒（西安天隆生物科技有限公司）、100 µL/1 000 µL单道移液器、10~100 µL 8道移液器、10~300 µL 12道移液器以及微量振荡器、加样槽、洗板机、酶标仪、生物安全柜、核酸提取仪、高速冷冻离心机、荧光定量PCR仪。

1.3 抗体水平检测（ELISA法）

1）操作流程。具体步骤如下：

①试剂盒组分平衡。将所有组分从试剂盒中取出，置于恒温箱平衡至少60 min。

②加样。按照“微孔板加样位置示例图”向抗原包被板中加入100 μL深孔板中已稀释好的血清样品。向指定孔中加入100 μL稀释后的标准品（1~6）、阳性对照血清（WP）、阴性对照血清(NC)。

③孵育。盖上封板膜，在恒温箱中孵育（60±2） min。

④洗板。用洗板机或微量移液器洗板，弃去孔中液体，每孔加300 μL稀释好的洗涤液，洗涤3次。最后一次洗涤后将酶标板在吸水纸上轻轻拍干。

⑤加标记抗体。每孔加入标记抗体，盖上封板膜，在恒温箱中孵育60 min。

2）结果判定。操作如下：

①试验成立条件。阴性对照OD差值均值＜0.1；阳性对照OD差值均值为0.3~1.2；标准品OD差值均值呈“标准品1＞标准品2＞标准品3＞标准品4＞标准品5＞标准品6”梯度。

②结果判定。样品滴度X≥0.5 EU/mL为阳性（WHO规定血清中和抗体水平≥0.5 EU/mL时即认为达到保护水平）；0.125 EU/mL≤X＜0.5 EU/mL为弱阳性；X＜0.125 EU/mL为阴性。

1.4 病原检测（实时荧光RT-PCR）

1）核酸提取。按照核酸提取试剂盒操作说明，进行自动核酸提取。

2）体系配置。参照表1配制RT-PCR反应体系，分装17 µL至反应管中，加入提取核酸模板，按扩增程序进行扩增。

3）程序扩增。参照表2参数执行。

2 结果与分析

2.1 抗体检测

本次研究共采集237份血清样品，经检测：阴性血清37份，阳性血清200份（其中，强阳性157份，弱阳性43份）。抗体阳性率84.39%，但43份弱阳性样本抗体滴度低于0.5 EU/mL，对狂犬病的保护率仅为66.24%，按WHO标准这43只犬不具备抵抗狂犬病感染的能力。

从区域分布来看（表3），4个区域的抗体阳性率介于75.45%~100.00%，阳性保护率介于50.91%~100.00%，区域1和区域2抗体保护水平较低，存在狂犬病传播的风险，区域3和区域4抗体保护水平较高，可有效预防狂犬病的传播。

对不同性别犬只抗体水平进行统计（表4）显示，雄性免疫保护率为76.68%，雌性免疫保护率为65.94%，雄性略高于雌性，但均未达到保护阈值，整体分析差异不明显。

对不同年龄段犬只免疫保护情况分析（表5）发现，4年<犬只年龄≤8年组保护率最高（80.00%），犬只年龄≤2年组保护率最低（56.88%），可能只有首次免疫，没有进行加强针的免疫，提示幼犬免疫效果需重点关注，应优化免疫程序或加强补免管理。

2.2 病原检测

本次共采集犬只唾液拭子234份，经实时荧光RT-PCR检测，结果均为阴性，表明银川地区本次监测的犬群中无狂犬病毒感染活跃情况，但因狂犬病潜伏期等因素，仍需持续关注，降低带毒犬伤人致感染的潜在风险。

3 讨 论

本研究通过对银川地区237份犬血清和234份唾液拭子的检测，明确了该区域犬狂犬病免疫抗体水平与病原携带现状，为区域防控提供了关键数据支撑。从免疫抗体检测结果来看，银川地区犬狂犬病抗体阳性率分布在75.45%~100.00%，但符合WHO保护标准（≥0.5 EU/mL）的群体保护率仅66.24%，未达到WOAH推荐的有效防控阈值，提示免疫效果存在明显提升空间。这一结果与我国犬只疫苗覆盖率整体偏低（约1/3）的现状一致，反映出基层免疫工作仍存在薄弱环节。进一步分析区域差异可见，4个区域的保护率介于50.91%~100.00%，区域3和区域4达到有效保护水平，推测差异可能与疫苗保存条件、免疫程序规范性及操作人员专业能力相关^[11]。已有研究证实，疫苗冷链断裂、接种次数不足、注射部位偏差等均可能导致免疫失败^[12]，因此需针对低保护率区域强化技术培训与流程监管，确保免疫操作标准化。从性别差异分析，雄性免疫保护率为76.68%，略高于雌性（65.94%），但都没有达到免疫保护效果，整体分析差异不明显，这也可能与样本量有关，或者说性别与免疫效果关联性不大，这有待进一步研究。而年龄分层显示，4年＜犬年龄≤8年犬保护率最高（80.00%），犬年龄≤2年的保护率最低（56.88%），这可能存在较小月龄（3月龄可进行首免）免疫狂犬病疫苗与母源抗体中作用导致抗体竞争抑制、未完全全程接种，导致体内尚未形成稳定的抗体保护或免疫程序执行不规范有关。建议针对2岁以下的犬优化免疫程序，如强化补免监测，以提高抗体达标率。病原检测方面，234份唾液拭子实时荧光RT-PCR结果均为阴性，表明银川地区本次监测的犬群中无狂犬病毒活跃感染，带毒犬传播风险较低。这一结果与2016－2020年全国狂犬病病例逐年下降的趋势相符，反映出当前免疫工作对抑制病毒传播起到了一定作用，但需注意狂犬病潜伏期的特性，仍应持续加强病原监测，避免漏检风险。本次样本量较少，且区域受限，检测结果具有一定局限性。

综合来看，尽管本研究未检测出阳性病例，但银川地区狂犬病疫苗免疫抗体水平显著偏低，尚未形成有效的免疫屏障，对公共卫生安全构成较大威胁。此外，城市流浪犬管理问题突出也是潜在风险的重要诱因。因此，地方动物疾病预防控制中心必须强化监管措施。银川地区狂犬病防控的核心在于提升有效免疫覆盖率，为有效控制国内狂犬病发病态势，我国狂犬病疫苗接种覆盖率需达到70%以上。结合WHO建议，需从3个方面推进工作：一是强化养犬人责任意识，通过宣传教育引导其主动参与免疫；二是规范免疫操作流程，加强从业人员培训，减少因技术问题导致的免疫失败；三是建立常态化抗体监测机制，对低保护率群体及时补免，形成“免疫－监测－补免”闭环。只有将群体保护率提升至70%以上，才能构建有效的群体免疫屏障，从源头上阻断狂犬病传播链。

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