1例中华斑羚疥螨病混合感染致死的病例调查

Investigation on the death caused by the mixed infection of Chinese antelope scabies and mite disease

摘要

目的 2022－2023年冬春季，湖北赛武当国家级自然保护区内发现多具中华斑羚尸体，为确定中华斑羚致死的病因。 方法 对4只中华斑羚尸体进行病理剖检和细菌学检测，并进行流行病学调查。 结果 在病死中华斑羚颈部皮屑镜检发现疥螨虫体，在肺脏、肝脏、脾脏、心脏、淋巴结等组织检出金黄色葡萄球菌、链球菌、李斯特菌和克雷伯菌等细菌，经细菌分离鉴定，分离到金黄色葡萄球菌，nuc基因特异性分析条带大小为279 bp，经耐药检测金黄色葡萄球菌对青霉素G、头孢西丁等抗生素均敏感。 结论 中华斑羚在疥螨寄生前提下，表皮受损，金黄色葡萄球菌经皮肤感染处进入血液系统，并伴有链球菌、李斯特菌和克雷伯菌混合感染，导致中华斑羚全身炎症，最终发展为肺炎和菌血症致死。

Abstract

Objectives The cause of death of multiple corpses of Naemorhedus griseus found in the Saiwudang National Nature Reserve in Hubei Province during the winter and spring of 2022－2023 was determined. Methods Pathological autopsy, bacteriological detection and epidemiological investigation were conducted on 4 corpses of Naemorhedus griseus. Results Sarcoptes scabiei mites were detected in neck dander through microscopic examination. Bacteria including Staphylococcus aureus, Streptococcus, Listeria monocytogenes and Klebsiella were identified in tissues including lung, liver, spleen, heart and lymph nodes. Staphylococcus aureus was isolated and confirmed by bacterial isolation and identification. The specific band of nuc gene was 279 bp in length. Staphylococcus aureus was sensitive to antibiotics including penicillin G and cefoxitin. Conclusions The epidermis of Naemorhedus griseus was damaged under the condition of Sarcoptes scabiei infestation, enabling Staphylococcus aureus to enter the blood system through skin lesions. The accompanied infections of Streptococcus, Listeria monocytogenes and Klebsiella led to the systemic inflammation in Naemorhedus griseus, ultimately developing into pneumonia and bacteremia, resulting in death.

Graphical abstract

关键词

中华斑羚 / 疥螨 / 金黄色葡萄球菌 / 流行病学 / 野生动物保护

Key words

Naemorhedus griseus / sarcoptes scabiei / staphylococcus aureus / epidemiology / wildlife conservation

中华斑羚（Naemorhedus griseus）^[1]是牛科（Bovidae）斑羚属（Naemorhedus）羊类，被毛深褐色、淡黄色或灰色，栖息于高海拔陡峭及多岩石的山区，结小群活动，以草、灌木枝叶、坚果和水果为食，分布于中国东北、华北、西北、华南及西南诸省区。在《国家重点保护野生动物名录》（2021年版）^[2]中，中华斑羚被列为二级保护动物。

2022年11月下旬，位于鄂西北的湖北赛武当国家级自然保护区发现2只中华斑羚患病，送至十堰市野生动物救护中心后第2天死亡，此后该自然保护区又陆续报告发现死亡中华斑羚。2023年2月，为探寻中华斑羚异常死亡的原因，对4只死亡的中华斑羚进行剖检、采样，经实验室检测，结合流行特点和临床表现，分析本批次中华斑羚致死病因，旨在为中华斑羚保护和疫病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

从发现中华斑羚异常死亡现象之日起至调查诊断期间，有皮肤疥癣样表征、在野外死亡或出现在河沟、农家附近，精神状态不佳的中华斑羚视为可疑病例。病料经实验室检测，皮屑中发现疥螨虫体、内脏组织器官中分离到细菌的病例视为确诊病例。

1.2 现场调查

对赛武当自然保护区管辖7个保护站、5个行政村，以及与赛武当自然保护区接壤的乡镇，延伸至十堰市境内有野生中华斑羚活动的区域开展调查。对发现的疑似患病斑羚进行临床观察，对死亡中华斑羚的尸体进行外观体表检查；向保护区日常巡护人员、村组干部调查了解近期中华斑羚活动及异常死亡情况；向驻村兽医、农户调查了解牛羊养殖及健康状况；调取野生动物保护部门设置在十堰境内森林深处的红外相机拍摄的影像资料，查看斑羚日常活动、皮肤外貌、精神状态等情况。

1.3 采样检测

对濒死期中华斑羚采集颈部静脉血，析出血清，用虎红平板凝集试验初筛、竞争ELISA复核检测布鲁氏菌病；刮取颈部体癣处皮屑（在有毛无毛交界处用手术刀刮至皮肤见血时取样），在显微镜下检查疥螨。病理剖检后采集肺脏、肝脏、脾脏、心脏、淋巴结、深层皮屑等样品，进行细菌培养分离、基因测序。

1）Diff-Quik染色。Diff-Quik染色是在瑞氏染色基础上改良来的1种快速染色方法，将得到的肺组织触片、肠系膜淋巴结触片、皮肤触片进行Diff-Quik染色，光学显微镜下观察结果。

2）细菌分离鉴定。用接种环取肺组织、气管拭子、颈部皮屑等样本在自制绵羊血平皿培养基上划线接种，于37 ℃恒温培养箱培养12 h，取优势菌的单菌落再次划线纯化，得到的单菌落接种至5%马血清的TSB培养皿中，培养12 h后观察菌落形态。挑取菌落涂片，进行革兰氏染色，光学显微镜观察细菌形态。

3）细菌基因序列分析。用细菌基因组提取试剂盒提取单菌落核酸，扩增16S RNA后测序，与NCBI数据库进行比对。

4）耐药性检测。采用灭菌棉签蘸取菌悬液涂布于M-H琼脂平板上，涂布接种后15 min内贴完药敏纸片，并将平板放入37 ℃恒温箱中培养16~18 h，检测金黄色葡萄球菌对苯唑西林、头孢西丁的敏感性时，孵育时间为24 h。采用肉眼观察的方式，以平板上细菌无明显生长的区域作为抑菌圈边缘，测量抑菌环至最接近的整毫米数。

2 结果与分析

2.1 流行病学调查

1）地理背景。赛武当国家级自然保护区位于秦岭褶皱系南岭印支褶皱带的武当山隆起中部，属秦岭和大巴山东延余脉武当山系，峰岭平均海拔1 000 m以上，主峰海拔1 722.7 m，总面积21 203 hm²，森林覆盖率95.1%。自然保护区内无规模牛羊养殖场，仅有农户散养牛羊约300头（只），2022年7月至2023年2月期间无调入、发病、死亡等异常情况。

2）三间分布。主要包括：

①时间。通过座谈走访，2022年11月－2023年2月，保护区陆续发现中华斑羚发病死亡约50只，追溯到2021年冬春季节约死亡有20只。可见，该病的季节性较为明显，中华斑羚发病死亡可以从冬季持续到第2年早春。

②空间。此次中华斑羚死亡全部在赛武当保护区境内，发现地点大多位于山沟、河谷、农家，甚至宾馆附近，空间分布上无显著特征。在村居发现的病例有村民报告，在野外主要是巡护人员发现并报告病例，提示中华斑羚因疾病需要饮水或者需要寻求治疗。

③群间。病死中华斑羚均为成年斑羚，公母都有，发现种群明确，提示有自主能力。

2.2 临床症状

病死中华斑羚都有明显的体癣，主要集中在头、颈、胸部，尤以鼻翼两侧、眼眶周围、耳根部、颈部为甚，体癣厚度0.2~0.5 cm，呈石灰样覆盖，不易剥离，有的形成龟裂，剥离后可见红色皮肤。病死中华斑羚体况中等，体重15~25 kg。病死前卧地不起，精神萎顿，体温36.5 ℃（低于正常生理范围38~39 ℃，提示机体循环或代谢功能异常）。中华斑羚濒死时尿失禁，四肢划动、头颈后仰，眼结膜充血，眼眶周围痂皮蹭掉后有血肿。

2.3 病理剖检

剖检4只中华斑羚，共同病理变化如下：

肺部呈现大面积弥漫性炎性病变，也有少量局限性肉变，肺部整体水肿充血，颜色斑驳，呈潮红至深红，有多处淤血灶；肝脏肿大，边缘‬钝圆，呈暗红色，切面多液体；肠系膜淋巴结呈暗红色（图1）。

其他脏器没有明显的病理变化，胃内食物充盈、新鲜无腐败。其中1只在心室内发现1个约0.5 cm大小的包囊，该包囊未开展进一步病理切片或寄生虫检测，暂未明确其性质（推测可能为寄生虫寄生或炎性增生，需后续研究验证）。

2.4 实验室检测

对临床观测的4只中华斑羚按时间先后分别命名为1、2、3、4号。

采集1、2号死亡中华斑羚的肺脏、肝脏、脾脏、心脏、淋巴结等样品，检出金黄色葡萄球菌、链球菌、李斯特菌和克雷伯菌混合感染。1、2号中华斑羚检出的链球菌、李斯特菌虽为条件致病菌，但本次检测未发现其大量繁殖，推测金黄色葡萄球菌为主要致病菌株，其余细菌可能为机会性感染（需进一步通过菌落计数验证致病力）。

采集3号中华斑羚濒死期血样，经虎红平板凝集试验和竞争ELISA检测布鲁氏菌病感染抗体阴性，刮取颈部皮屑在显微镜下镜检发现疥螨虫体。3号中华斑羚检出的疥螨虫体在所有观测到的中华斑羚均为普遍现象，推测疥螨的大量寄生导致中华斑羚的皮肤组织暴露，机体免疫力降低，增加了各种病原菌入侵感染的条件。

采集4号中华斑羚的肺脏、肝脏、脾脏、心脏、淋巴结、深层皮屑等样品，镜检肺组织触片可见嗜中性粒细胞和大量球菌，皮肤触片镜下可见炎性渗出物和大量球菌，淋巴结触片镜下可见嗜中性粒细胞和大量球菌。对肺部和淋巴结进行细菌培养，接种于TSA平皿，37 ℃培养12 h后出现乳白色、表面光滑、扁平、湿润的圆形菌落，单菌落经革兰氏染色镜检呈蓝紫色，球形，单个、成对或呈葡萄串状存在，根据细菌在TSA平板生长情况和镜检图片符合金黄色葡萄球菌特征。经测序得到该细菌的16S序列，上传至NCBI比对分析，金黄色葡萄球菌nuc基因特异性引物鉴定电泳条带大小为279 bp，肺部和淋巴结分离得到的菌株前9位和金黄色葡萄球菌相似率达100%，细菌分离鉴定结果为金黄色葡萄球菌。

细菌耐药性结果显示，分离得到的2株金黄色葡萄球菌对青霉素G、头孢西丁（替代检测苯唑西林）、甲氧苄啶、红霉素、克林霉素、四环素、多西环素、庆大霉素、氧氟沙星和氯霉素均敏感。

4号中华斑羚经过细菌分离培养，基因测序确定为起主要致病作用的是金黄色葡萄球菌，该细菌经耐药性检测对多数抗生素均敏感，提示该细菌毒株未接触抗生素，为在自然环境下的外部致病菌。

3 讨 论

3.1 中华斑羚疥螨病的季节性

查看十堰地区野外相机拍摄的多幅图片，可以看到在冬季野生中华斑羚体表有明显的疥癣，而在其他季节斑羚的体毛健全、顺滑。类似情况在陕西秦岭^[3]、四川川西^[4]、云南香格里拉^[5]都有发生，也与朱奇峰等^[6]对秦岭中段死亡斑羚空间分布规律的研究基本吻合，说明中华斑羚疥螨病在冬季常见、多发、流行范围广。但疥螨病直接导致斑羚大量死亡似乎不太可能。

从本次观察情况来看，斑羚皮肤患处并没有明显的磨蹭痕迹，说明痒感不强烈，疥螨形成的痂皮会自然脱落，如果没有继发细菌感染，应该可以自愈。因为没有对皮屑进行真菌检测，尚无法确定斑羚的体癣是否有真菌感染的因素。

3.2 中华斑羚携带病原菌的复杂性

本病例分离出金黄葡萄球菌、链球菌、李斯特菌和克雷伯菌等几种条件性致病菌。斑羚作为野生动物无疑会携带多种病原菌，吴桥兴等^[3]从秦岭山区2017、2018年冬春季死亡斑羚的肺脏组织中扩增到大肠埃希菌，胡露等^[8]从四川某保护区2019年冬季死亡的斑羚内脏中分离到多杀性巴氏杆菌，陈永林等^[9]从北京动物园死亡的2只斑羚和1只岩羊的肺脏中分离到棒状化脓杆菌。这些菌都是常在菌，说明斑羚在抵抗力下降的情况下可能会有不同的致病菌引发感染性疾病。

3.3 主要致病菌

本案例中3只死亡中华斑羚的内脏组织中均检测出金黄色葡萄球菌，其中2只还检出了链球菌、李斯特菌和克雷伯菌。金黄色葡萄球菌、链球菌、李斯特菌和克雷伯菌都是条件性致病菌，金黄色葡萄球菌一般会引起畜禽的皮炎，而侵入内脏器官引发全身性炎症的情况还比较少见。本案例中死亡中华斑羚可能是在疥螨寄生的前提下，皮肤黏膜或角质层受损导致机体免疫力下降，以金黄色葡萄球菌为主要致病菌的菌群经皮肤黏膜感染最终进入血液循环系统，引起全身性炎症，最终形成肺炎和菌毒血症致死。

3.4 中华斑羚病毒感染的病因排查研究

本病例未做病毒分离，根据临床诊断和流调，排除了小反刍兽疫、口蹄疫和山羊痘。对于中华斑羚会遭受哪些病毒攻击鲜有报道，仅尹建华^[5]的研究中发现并鉴定了云南白马雪山斑羚感染羊肺腺瘤病毒和羊鼻腺瘤病毒。中华斑羚陆续死亡是否存在病毒因素，或中华斑羚会有哪些病毒性疾病，有待进一步研究。

3.5 中华斑羚保护的重要性

中华斑羚是国家二级保护动物，在冬季大量死亡的现象由来已久，我国某些保护区内时有发生，关于死亡原因的研究还不是很透彻，结论也有差异，但在季节性、皮肤基础病、继发细菌感染等病因上基本一致。

由于所涉都是条件致病菌，加上中华斑羚的野性和生活地域，给防治工作带来一定难度，鉴于此类情况可能会经常发生，建议保持持续关注^[10]，加强对保护区周边农户、巡护人员及公众的宣教工作（如普及中华斑羚异常死亡识别特征、报告流程），一旦发现病例及时报告相关部门并采取措施，共同做好野生动物保护工作。

4 结 论

本文通过对赛武当管理区2022－2023年中华斑羚死亡病例的流行病学调查、病理解剖、实验室检测等分析，认定导致本次中华斑羚死亡的原因为在疥螨原发病的基础上，皮肤黏膜和角质层受损，机体免疫力和抗感染能力下降，以金黄色葡萄球菌为主要致病菌的多种细菌混合感染侵入机体，逐步发展为菌血症和肺炎，引发全身性炎症。由于在自然保护区缺乏人为的干预治疗，部分中华斑羚由于个体差异出现呼吸衰竭、感染性休克以及器官功能衰竭而导致的急性或者慢性疾病死亡，最终被村民和巡护人员在河边、居民区发现。

参考文献

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