磁微粒化学发光法与ELISA检测经典猪瘟病毒抗体的一致性评价

Evaluating the consistency between Magnetic Particle Chemiluminescence immunoassay and ELISA in detecting antibodies against classical swine fever virus

摘要

目的 评估磁微粒化学发光法（CLIA）检测经典猪瘟病毒（CSFV）抗体与现行参考方法酶联免疫吸附试验（ELISA）的等效性，为CLIA技术推广应用于猪瘟（CSF）防控提供科学支撑。 方法 采用CLIA与IDEXX ELISA方法平行检测866份临床猪血清样本，为确保统计严谨性，剔除2套系统判定结果中含有“可疑”的样本，最终纳入848份具有明确判定结果的样本构建“2×2”列联表，计算符合率并进行Kappa一致性检验及检测值的Pearson相关性分析。 结果 CLIA与ELISA的相对总符合率为98.47%，相对阳性符合率98.80%，相对阴性符合率97.99%；Kappa值为0.967 2，一致性极好；相关性分析表明2种方法检测值呈高度正相关，决定系数R² =0.888 5。 结论 CLIA法与参考方法（IDEXX ELISA）具有高度一致性，且兼具高自动化与高通量优势，适用于CSFV大规模免疫水平评估及净化监测。

Abstract

Objectives The equivalence of the magnetic particle chemiluminescence assay (CLIA) and the current reference method enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in detecting antibodies against classical swine fever virus (CSFV) was evaluated to provide scientific support for the promotion and application of CLIA technology in the prevention and control of swine fever virus (CSF). Methods CLIA and IDEXX ELISA methods were used in parallel to detect 866 samples of clinical porcine serum. 2 samples yielding an "equivocal" result in either system were excluded to ensure statistical rigor. Finally, 848 samples with definitive results were used to construct a "2 × 2" contingency table for calculating the overall agreement rate and conducting Cohen's Kappa statistic test and Pearson correlation analysis of the quantitative detection values. Results The relative total agreement rate between CLIA and ELISA was 98.47%, with the relative positive agreement rate of 98.80% and the relative negative agreement rate of 97.99%. The Kappa statistic was 0.967 2, indicating that the consistency is excellent. The detection value of the two methods was highly positively correlated, with a coefficient of determination (R² ) of 0.8885. Conclusions CLIA method has high consistency with the reference method (IDEXX ELISA) and combines the advantages of high automation and high-throughput, making it suitable for evaluation of immunity level and monitoring the eradication of CSFV at large scale.

Graphical abstract

关键词

经典猪瘟 / 经典猪瘟病毒 / 抗体检测 / 磁微粒化学发光法 / 酶联免疫吸附试验 / 方法学比对

Key words

classical swine fever (CSF) / CSF virus / antibody detection / magnetic particle chemiluminescence immunoassay (CLIA) / enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / methodological comparison

经典猪瘟（classical swine fever, CSF）是由黄病毒科瘟病毒属的经典猪瘟病毒（CSFV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。疫苗接种是防控CSF的关键策略。其中，基于猪瘟兔化弱毒（C株）研制的高纯度传代细胞疫苗，凭借其优异的安全性与免疫原性，在我国得到广泛应用，有效遏制了疫情的蔓延。自2010年以来，我国猪瘟流行态势已转为散发^[1]。2021年10月，农业农村部发布《关于推进动物疫病净化工作的意见》，正式将猪瘟列为重点净化病种，标志着我国已具备开展猪瘟净化工作的坚实基础。在此背景下，建立准确、高效的临床血清学抗体检测方法是评估免疫效果、监测免疫覆盖率及掌握群体免疫水平的关键，更是实现CSF净化与根除的核心技术支撑^[2-3]。

目前，酶联免疫吸附试验（ELISA）因操作相对标准化、成本较低，仍是国内外CSFV抗体血清学检测的主流技术。其中，爱德士（IDEXX）公司的CSFV抗体检测试剂盒因性能稳定、特异性良好，常被用作参考方法^[4]。然而，传统ELISA方法存在操作步骤繁琐、检测周期长、结果判定受主观因素影响大、检测通量有限等固有局限性，难以满足大规模养殖场在区域净化计划实施和常态化监测中对高通量、高效率检测的需求^[5-6]。

近年来，磁微粒化学发光法（CLIA）在兽医诊断领域迅速发展并展现出显著技术优势。该技术以顺磁性微粒为固相载体，凭借其巨大的比表面积显著提升抗原抗体结合效率，缩短反应时间；同时，化学发光检测系统也具有灵敏度高、线性范围宽、背景干扰小等特点^[7]。结合全自动分析仪器，CLIA可实现“样本入－结果出”的全流程自动化检测，有效减少人为误差，大幅提升检测效率和结果可靠性。已有研究表明，CLIA在非洲猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等动物疫病的抗体检测中，与ELISA方法表现出良好的一致性^[8]。因此，本研究通过对866份临床血清样本进行平行检测，系统评估CSFV CLIA抗体检测方法与IDEXX ELISA的检测一致性，为CLIA在CSF防控与净化中的推广应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

本研究收集866份猪血清样本，来源于19个不同规模化猪场的临床送检样本及健康监测样本，涵盖不同免疫背景，其中14个猪场实施规范的CSFV疫苗免疫程序，共采样591份，用于评价群体免疫水平；5个未实施CSFV疫苗免疫或净化猪场，共采样275份，用于验证方法的特异性。所有样本经离心分离血清后，于-20 ℃冻存备用，检测前室温解冻并充分混匀。

1.2 检测试剂与仪器

经典猪瘟病毒抗体检测试剂盒（ELISA）购自美国IDEXX公司（批号：AG271），在有效期内使用；经典猪瘟病毒抗体检测（磁微粒化学发光法）基于武汉今通生物科技有限公司和唯泰科生物科技（武汉）有限公司成熟的磁微粒化学发光检测技术平台，通过引入重组CSFV E2蛋白作为核心免疫试剂实现^[9-10]。

主要仪器：CMax Plus型酶标仪；VT-2000型全自动化学发光免疫分析仪。

1.3 检测方法

所有检测操作严格遵循试剂盒说明书及实验室标准操作规程执行，均设置阴、阳性对照，确保检测有效性。

IDEXX ELISA法：按说明书标准流程进行操作，依次完成血清稀释、加样、37 ℃孵育、洗涤、加酶标二抗、二次孵育、洗涤、加显色液显色、加终止液终止反应，使用酶标仪读取450 nm波长下的吸光值，根据试剂盒设定的临界值判定样本为阳性、可疑或阴性。

CLIA法：在VT-2000型全自动化学发光免疫分析仪上完成检测，仪器自动完成样本与试剂的加样、37 ℃孵育、磁性分离、洗涤、化学发光底物添加及信号检测，根据预设的临界值自动分析并输出样本阳性、可疑或阴性结果。

1.4 数据统计与分析

采用Excel 2019和SPSS 26.0软件进行分析，以IDEXX ELISA为参考方法，剔除2套检测系统判定结果中含有“可疑”结论的样本，利用余下848份样本构建“2×2”列联表。计算相对阳性符合率、相对阴性符合率及相对总符合率（符合率=2种方法判定一致的样本数/纳入统计的总样本数×100%）。采用Kappa一致性检验评估2种方法判定结果的一致性强度，通过观察实际一致率（P₀ ）与偶然一致率（P_e ）的差异，计算Kappa值（K）。Kappa值（K）判断标准：K≤0.40为一致性较差；0.40＜K≤0.60为中度一致；0.60＜K≤0.80为高度一致；K＞0.80为一致性极好^[11]。

将ELISA的结果（PI值）转换为1－PI值进行分析；CLIA则直接采用S/CO值，以S/CO值为自变量（x），1－PI值为因变量（y），建立线性回归模型y=ax+b。通过计算决定系数R² 以评价回归方程的拟合优度，并采用Pearson相关分析计算相关系数，以评价2种方法检测值之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 临床样本检测总体分布

本研究采用2种方法对866份血清样本进行平行检测。在IDEXX ELISA检测中，判定为阳性、可疑和阴性的样本分别为506、9、351份；其中591份免疫猪场样本的抗体合格率（阳性+可疑）为87.14%（515/591）。在CLIA检测中，判定为阳性、可疑和阴性的样本分别为508、11、347份。

2.2 CLIA与IDEXX ELISA检测方法的一致性比对

为确保统计分析的严谨性，剔除2套系统中判定为“可疑”的18份样本（含重叠样本），最终纳入848份具有明确判定结果的样本构建“2×2”列联表（表1）。结果显示：CLIA法与IDEXX ELISA法的总相对符合率为98.47%（835/848）；其中相对阳性符合率为98.80%，即ELISA判定的500份阳性样本中，494份被CLIA判定为阳性；相对阴性符合率为97.99%，即ELISA判定的348份阴性样本中，341份被CLIA判定为阴性。

2.3 Kappa一致性检验结果

Kappa一致性检验结果显示，以ELISA为参考方法，CLIA与其判定的Kappa值为0.967 2，95%置信区间为0.948~0.986。根据判定标准，表明2种方法一致性极好。在本研究纳入统计的848份样本中，判定不一致的样本仅13份（IDEXX阳性/CLIA阴性6份，IDEXX阴性/CLIA阳性7份）。此外，对18份含有可疑判定的样本（IDEXX可疑9份，CLIA可疑11份，其中有2份样本被2种方法同时判定为可疑）进行单独分析发现，检测值均集中于判定临界值附近，属于正常技术差异，不影响群体免疫水平整体评价。

2.4 检测值的相关性分析

CSFV CLIA法与IDEXX ELISA法检测值的相关性分析结果如图1所示。散点图拟合的线性回归方程为y=0.813 9x+0.114 4，决定系数（R²）为0.888 5。说明2种方法的检测值存在较强的正相关关系，即一种方法的检测值越高，另一种方法的检测值也随之升高，进一步验证了2种检测方法的关联性和检测结果的可靠性。

3 讨 论

本研究通过2种方法对866份临床血清样本进行平行检测，系统评估CLIA与商品化IDEXX ELISA试剂盒检测CSFV抗体的一致性。结果显示：在剔除模糊判定样本后，2种方法的总符合率达98.47%，Kappa值为0.967 2，达到极好的一致性水平；同时，2种方法的检测值呈现较强的正相关（R² =0.888 5），表明CLIA检测结果与作为参考方法的IDEXX ELISA具有高度吻合性，证实CLIA可作为CSFV抗体检测的可靠方法。本研究中，2种方法的不一致结果主要集中于临界值附近的低抗体浓度样本。经核实，本批次免疫场样本的CSFV抗体阳性率（含可疑）约为87.14%，符合当前我国规模化养殖场经典猪瘟免疫水平的实际情况。产生差异的原因主要与不同方法学的技术原理相关：一方面，CLIA与ELISA的抗原包被表位、反应动力学特征存在细微差异；另一方面，2种方法的信号放大系统和临界值设定不同，可能导致低抗体浓度样本的结果判读出现偏差^[12]。需要强调的是，本研究中CLIA对ELISA判定为可疑的9份样本中有7份判定为阳性，提示CLIA在低滴度样本检测中可能具有更高的敏感性。同时，CSF抗体监测的核心目标是评估猪群整体免疫水平，指导疫苗接种和净化策略制定，个别临界值样本的结果波动属于正常统计学变异，不会影响基于群体数据得出的结论对生产实践的指导意义^[13]。

相较于ELISA方法，CLIA的突出优势体现在自动化程度和检测通量上。本研究使用的VT-2000型全自动化学发光免疫分析仪可实现全流程自动化检测，单位时间内可完成数百份样本检测，大幅缩短检测周期，同时避免了ELISA操作中洗涤、显色等步骤的人为误差，提升了检测的标准化水平和结果可重复性。随着我国DB 51/T 475－2018《猪瘟防治技术规范》的深入实施和CSF净化计划的持续推进，养殖企业和兽医检测机构对监测工作的效率和覆盖面提出了更高要求^[14]。CLIA技术符合兽医实验室智能化、自动化的发展趋势，能够有效提升大型养殖集团或第三方检测机构的综合检测能力，为CSF净化提供高效的技术支撑。

4 结 论

本研究证实磁微粒化学发光法检测CSFV抗体具有良好的准确性和可靠性，与传统ELISA方法具有极好的一致性，且在自动化、高通量检测方面具有显著优势。该方法可作为CSF防控与净化工作中血清学监测的有效工具，尤其适用于大型养殖集团的集中监测、区域净化计划实施中的大规模筛查，以及第三方检测机构的免疫效果评估等场景，具有广阔的推广应用前景。

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基金资助

猪瘟、猪伪狂犬病净化及其维持技术研究和集成应用(2024YFD1800504)