SADS-CoV诱导自噬并促进病毒复制的机制研究

Mechanism of SADS-CoV inducing autophagy and promoting viral replication

摘要

目的 探究猪急性腹泻综合征冠状病毒（swine acute diarrhoea syndrome coronavirus，SADS-CoV）复制与细胞自噬之间的关系，并指导抗病毒药物的筛选。 方法 通过检测SADS-CoV不同感染时间段（12、24、36、48 h）的非洲绿猴肾细胞（VERO-E6）、猪睾丸细胞（ST）中的自噬标志物LC3-Ⅱ和p62的相对表达量，利用细胞活性测试筛选得到自噬激活剂雷帕霉素（Rapa）和自噬抑制剂氯喹（CQ）的最佳使用浓度，Western blotting检测分析确定自噬调节药物对SADS-CoV复制的影响。 结果 SADS-CoV感染VERO-E6、ST细胞后，LC3-Ⅱ的蛋白表达量均呈现极显著增加（P＜0.000 1）。Rapa在VERO-E6、ST细胞中最佳使用浓度分别为1、0.8 µmol/L，CQ在VERO-E6、ST细胞中最佳使用浓度均为10 µmol/L；感染SADS-CoV后加入对应药物，发现与对照组相比，Rapa试验组中LC3-Ⅱ和SADS-CoV N表达均极显著上调（P＜0.000 1），p62表达极显著降低（P＜0.000 1），而CQ试验组中，LC3-Ⅱ和p62表达均极显著增加（P＜0.000 1），SADS-CoV N蛋白的表达量极显著降低（P＜0.000 1）。 结论 自噬促进SADS-CoV在VERO-E6、ST细胞上复制和增殖，抑制自噬可以作为抗SADS-CoV感染的一种策略。

Abstract

Objectives The relationship between the replication of swine acute diarrhoea syndrome coronavirus (SADS-CoV) and cellular autophagy was studied to guide the screening of antiviral drugs. Methods The relative expression level of autophagy-related genes LC3-Ⅱ and p62 in African green monkey kidney cells (VERO-E6) and pig testicular cells (ST) at different time including 12, 24, 36, 48 h after infection with SADS-CoV was detected. The optimal concentration of autophagy activator rapamycin (Rapa) and autophagy inhibitor chloroquine (CQ) were screened and determined with cell viability assays. The effects of autophagy-modulating drugs on the replication of SADS-CoV were analyzed and determined with Western blotting. Results The expression of LC3-Ⅱ protein was significantly increased (P＜0.000 1) after SADS-CoV infected VERO-E6 and ST cells. The optimal concentration of Rapa for VERO-E6 and ST cells was 1.0 µmol/L and 0.8 µmol/L, while the optimal concentration of CQ for both VERO-E6 and ST cells was 10.0 µmol/L. The Rapa treatment group significantly upregulated the expression of LC3-Ⅱ and SADS-CoV N protein (P＜0.000 1) upon SADS-CoV infection and subsequent treatment with the corresponding drugs along with downregulated the expression of p62 (P＜0.000 1) compared with the control group. In contrast, the CQ treatment group significantly increased the expression of LC3-Ⅱ and p62 (P＜0.000 1), while the expression of SADS-CoV N protein was significantly reduced (P＜0.000 1). Conclusions It is indicated that autophagy promotes the replication and proliferation of SADS-CoV in VERO-E6 and ST cells, and inhibiting autophagy can be served as a potential strategy against SADS-CoV infection.

Graphical abstract

关键词

猪急性腹泻综合征冠状病毒 / 自噬 / 病毒复制 / 感染 / 微管相关蛋白1轻链3

Key words

Swine Acute Diarrhoea Syndrome Coronavirus (SADS-CoV) / autophagy / viral replication / infection / microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3)

猪急性腹泻综合征冠状病毒（swine acute diarrhoea syndrome coronavirus, SADS-CoV）是一种来源于菊头蝠的新型猪冠状病毒^[1]。SADS-CoV自2016年暴发以来，在中国南部和中部5个省份的多个养猪场（包括广东、福建、江西、广西和河南），已检测到该病毒^[2-5]。SADS-CoV主要感染仔猪的小肠，尤其是空肠和回肠，并可能引起感染仔猪出现严重的萎缩性肠炎，临床特征主要为急性呕吐和水样腹泻，最终因体重剧减而导致死亡，5日龄内的仔猪病死率可达90%以上^[3]。

SADS-CoV基因组长约27 kb，编码16个非结构蛋白（nsp）、4个结构蛋白和3个辅助蛋白。非结构蛋白存在于2个开放阅读框（ORF1a和ORF1b）中，结构蛋白包括刺突蛋白（spike，S）、包膜蛋白（envelope，E）、膜蛋白（membrane，M）、核衣壳蛋白（neucleocapsid，N），辅助蛋白包括ORF3、NS7a和NS7b^[6-7]，其基因组与蝙蝠冠状病毒HKU2（rhinolophus bat coronavirus HKU2, Bat-CoVHKU2）具有95%以上的序列同源性^[8]。SADS-CoV除了能感染猪以外，还能感染其他物种来源的细胞，包括人源（Huh7、HepG2/C3A、A549、Hela、RD）、猴源（VERO、BSC-40、Cos-7）、蝙蝠源（RlKi、Tb-1）、小鼠（NIH/3T3）、仓鼠源（BHK-21、CHO）、鸡源（DF-1）^[9]，且SADS-CoV对人类原代细胞（包括微血管内皮细胞、成纤维细胞、人鼻上皮细胞和人气道上皮细胞）存在潜在感染性^[10]，这说明SADS-CoV存在跨物种传播的可能，带来潜在的公共卫生安全问题。

冠状病毒能够通过多种途径诱导感染细胞的死亡，包括凋亡、坏死和自噬等^[11]。自噬是一种进化上保守的蛋白质和细胞器降解的分解代谢过程，在细胞生长和发育中起着关键作用。自噬是将衰老或受损的细胞器和蛋白质运输到溶酶体进行降解，由此产生的降解小分子产物随后被用于维持细胞物质循环和细胞内稳态^[12-13]。自噬的基本过程包括自噬的起始、自噬体的形成、自噬体与溶酶体融合以及自噬溶酶体的裂解^[14]。自噬起始阶段细胞接受自噬诱导信号后，会在细胞质中形成一个包裹着需要被降解的物质的碗状结构，即吞噬泡；随后该吞噬泡逐渐延伸并闭合，形成封闭的球状自噬体。自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体，在此过程中自噬体的内膜被溶酶体酶分解，自噬溶酶体包裹的内含物也被逐步降解。最终，降解产物被释放到细胞质中供细胞回收利用，而剩余残渣则被排出细胞或保留在细胞质内。

目前，国内外不少研究都表明冠状病毒能够诱导自噬的产生。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）S蛋白与受体ACE2结合，刺激活性氧物质（ROS）的产生，并抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活，从而促进自噬^[15]。而SARS-CoV-2 E蛋白会激活内质网通路，导致翻译起始因子eIF-2α磷酸化，进而促进LC3脂质化并诱导自噬^[16]。中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）的研究中发现，木瓜样蛋白酶（PLpro）和3C样蛋白酶（3CLpro）具有诱导自噬作用^[17]。猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）感染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）激活PI3K-AKT和mTOR通路^[18]。SADS-CoV通过抑制AKT/mTOR通路的激活来促进VERO-E6细胞的自噬^[19]。此外，SADS-CoV的PLP2-TM蛋白通过与GRP78的相互作用激活IRE1-JNK-Beclin1通路诱导完全自噬^[20]。尽管目前已经开始对SADS-CoV与细胞自噬进行研究，但由于SADS-CoV发现的时间较晚，对其自噬的研究还很少。自噬对病毒的影响仍然存在争议，这种复杂性可能归因于细胞类型、毒株类型和感染时间的变化^[21]。因此，本研究通过SADS-CoV感染和自噬调节剂分析病毒复制与自噬的关系，旨在为更深入地揭示SADS-CoV的致病机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

非洲绿猴肾细胞系（VERO-E6细胞）、猪睾丸细胞（ST细胞）、SADS-CoV病毒均由温州大学病毒学与免疫学重点实验室保存；LC3 Polyclonal antibody（81004-1-AP）、p62/SQSTM1 Polyclonal Antibody（18420-1-AP）以及GAPDH Monoclonal antibody（60004-1-Ig）均购买自美国Proteintech公司；CCK-8试剂盒（CK04）购买自日本Dojindo公司；氯喹（C424619）购自中国阿拉丁公司；雷帕霉素（S1842）和细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）（C0038）购自中国碧云天科技公司；6×Protein Loading Buffer（DL101-02）购自中国北京全式金生物公司；One-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit （12%）（E304-01）购自中国南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 主要试验方法

1）细胞培养以及药物处理。VERO-E6细胞与ST细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，长至80%左右进行传代，放置于恒温培养箱（37 ℃，5% CO₂）中。CQ和Rapa均先用DMSO进行稀释，稀释后浓度分别为33 mmol/L、218.77 µmol/L，分装并冻存于-80 ℃冰箱。在对细胞进行处理时，用无血清的DMEM进行稀释，按照不同要求配置不同的浓度，充分溶解后再加入细胞。

2）CCK-8检测细胞活性。将细胞以每孔1×10⁴的密度铺于96孔板中，放置于恒温培养箱中培养，待细胞密度长到70%~80%时，弃培养基，用PBS润洗后将CQ（浓度梯度为2、5、10 、20 µmol/L）和Rapa（浓度梯度为0.2、0.5、0.8、1、2 µmol/L）加入对应孔中，继续培养8 h后，每孔加入10 µL细胞计数试剂盒溶液，继续培养1~4 h。当观察到培养基颜色变为橙色时即可进行检测。在酶标仪上设置450 nm吸光度检测细胞活性后，按照CCK-8试剂提供的公式进行计算。

3）Western blotting检测LC3、p62以及SADS-CoV N蛋白表达变化。分别利用1 MOI、10 MOI SADS-CoV病毒感染十二孔板中的VERO-E6细胞和ST细胞，并在12、24、36、48 h用PBS清洗3次，加入100 μL细胞裂解液，冰上静置15 min后，收集细胞至1.5 mL离心管中，冷冻离心机12 000 r/min离心10 min后，取上清并加入20 μL 6×Protein Loading Buffer，移液器吹打混匀，100 ℃金属浴加热10 min后取出置于冰上降温3 min，然后冻存于-20 ℃冰箱备用。根据One-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit （12%）试剂说明书配置凝胶，胶凝固后，组装胶板和胶架，倒入电泳液检漏，随后放入电泳槽中，拔出梳子，按照试验设计加入蛋白样品以及蛋白Marker。120 V跑至胶底，结束电泳。采用“三明治结构”半干转膜方法将蛋白转到0.22 μm的PVDF膜上后用TBST配制5%脱脂奶粉，室温封闭1 h。TBST洗膜3次，10 min后分别用LC3、p62以及SADS-CoV N抗体稀释液室温孵育2 h或4 ℃过夜。TBST洗膜后，加入配制好的山羊抗兔二抗稀释液，室温孵育1 h。TBST洗膜后将膜放置于凝胶成像仪上，在膜上滴加曝光液，根据仪器操作进行曝光。

1.3 数据统计与分析

所有结果均代表3个独立试验，灰度值由Image J软件进行检测。使用GraphPad Prism软件作图，采用单因素方差分析进行组间差异分析。

2 结果与分析

2.1 SADS-CoV感染VERO、ST细胞引起细胞自噬

利用SADS-CoV病毒感染VERO-E6细胞和ST细胞后按时间梯度收样，Western blotting试验结果（图1）显示：随着SADS-CoV感染时间的延长，LC3-Ⅱ的蛋白表达量呈现出极显著增加的趋势（P＜0.000 1），而p62的蛋白表达量随感染时间的延长而极显著降低（P＜0.000 1），并在36 h出现了极显著的下降（P＜0.000 1）。ST细胞中也出现了相同的现象。

2.2 CCK-8试验检测药物对细胞活性的影响

CCK-8及Western blotting结果（图2）显示：在VERO-E6细胞中CQ的最适浓度为10 µmol/L，Rapa的最适浓度为1 µmol/L；在ST细胞中CQ的最适浓度为10 µmol/L，Rapa的最适浓度为0.8 µmol/L。

2.3 自噬抑制剂与激活剂对SADS-CoV复制的影响

由图3可知，在VERO-E6细胞中加入Rapa的试验组，感染24 h后LC3-Ⅱ表达上调，p62表达下调，SADS-CoV N蛋白的表达量极显著增加（P＜0.001）。在加入CQ的试验组中，感染24 h后LC3-Ⅱ表达增加，p62表达增加，SADS-CoV N蛋白的表达量极显著减少（P＜0.000 1）。在ST细胞中出现同样现象。这些试验结果说明，激活细胞自噬能够促进病毒复制，同时病毒复制能够诱导细胞发生完全自噬。

3 讨 论

自噬作为真核细胞早期的保护防御机制，可以通过相应机制清除胞内病原体来抑制病毒的复制^[22-23]。猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）诱导自噬以促进细胞存活，而TGEV诱导的自噬又会限制病毒的复制，Atg5、Atg7或LC3基因沉默后病毒复制增强证明了这一点^[24]；BST2通过选择性自噬结合并降解猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）N蛋白来抑制病毒复制，并且PEDV感染可以上调IRF1的表达^[25]；通过抑制血管紧张素转换酶2（ACE2）的SUMO化修饰，可以增强TOLLIP介导的选择性自噬降低SARS-CoV-2的感染^[26]；抑制S期激酶相关蛋白2（SKP2）会增加BECN1水平，增强溶酶体SNARE蛋白的组装和自噬，并有效减少MERS-CoV的复制^[27]；FBXW8通过NPD52依赖性自噬降解病毒N蛋白，抑制PDCoV增殖^[28]；RBM14通过激活自噬和干扰素途径募集p62降解N蛋白，抑制PEDV复制^[29]。

冠状病毒感染引起的自噬不仅可以抑制冠状病毒的复制，还有可能促进复制。Hsp70不仅可以促进SARS-CoV-2感染，还能操纵自噬以帮助病毒在细胞内复制^[30]。PEDV通过上调TRIM28的表达来诱导线粒体自噬，从而抑制JAK-STAT1通路，帮助病毒逃避免疫反应并促进自身的复制^[31]。PDCoV感染猪肾细胞（LLC-PK1）后激活p38信号通路，最终导致完全自噬，从而促进病毒复制^[32]。NBR1能特异性识别并靶向PDCoV E蛋白至自噬体进行降解，具有抗病毒作用，而PDCoV的nsp5蛋白酶可特异性切割NBR1，破坏其自噬功能，使其丧失对病毒蛋白的识别和降解能力，从而增强病毒生存和复制能力^[33]。冠状病毒nsp14促进了ATG4A与GABARAP之间的相互作用，增强了线粒体自噬，同时通过降解选择性自噬受体p62来抑制LC3B介导的病毒自噬^[34]，这一机制代表了一种自噬重编程形式，即病毒主动操纵自噬网络的多层次环节，将自噬结果从抗病毒防御转向促病毒适应。以上研究结果都说明了病毒复制与自噬之间存在复杂的联系。

研究表明，在VERO-E6细胞中的自噬与SADS-CoV复制之间是一种相互促进的关系^[35]，但在ST细胞中的关系尚未研究。本研究发现在SADS-CoV感染VERO-E6和ST细胞后，LC3-Ⅱ表达显著上升，同时p62表达量明显下降，表明病毒可诱导细胞发生自噬。进一步通过CQ和Rapa调控自噬水平发现，在VERO-E6和ST细胞中激活自噬能显著促进SADS-CoV N蛋白的复制，而抑制自噬则显著降低了N蛋白的表达量。以上结果说明，激活自噬可以促进病毒复制。冠状病毒是否可以触发其他形式的自噬，如伴侣介导的自噬（CMA）和微自噬，仍需要进一步研究。后续将会对SADS-CoV和自噬之间的作用进行更加深入的研究，针对自噬对抗SADS-CoV感染的新治疗策略提供更加深入的理论依据，为这一领域的未来研究开发出更有效的治疗方法。

4 结 论

本试验条件下，SADS-CoV不仅可以激活VERO-E6细胞的自噬，还能够激活ST细胞的自噬，同时激活自噬能够促进病毒复制。

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基金资助

温州市公益性农业科技项目(X2025080)