16S rRNA基因在3只华南兔残体鉴定上的应用

Identifying remains of three Lepus sinensis with sequencing 16S rRNA gene

摘要

目的 解决野生动物涉案残体的物种鉴定难题，为野生动物司法鉴定提供标准化技术参考。 方法 本研究以2023年12月河南省辉县市石头乡贩卖野兔案的3个动物残体样本为对象，采用线粒体16S rRNA基因序列分析技术，通过DNA提取、PCR扩增、测序及序列比对，结合遗传距离分析与系统发育树构建，对样本物种进行鉴定。 结果 3个野兔样本与华南兔（Lepus sinensis）的16S rRNA基因序列相似度达98%以上，系统发育树中聚为一支且支持率为98%，明确判定涉案物种为华南兔。依据相关标准核算，涉案金额为240元。 结论 本研究采用线粒体16S rRNA基因序列分析技术，对华南兔残体样本进行了准确、有效的物种鉴定，说明此技术在野生动物残体司法鉴定中具备可行性。

Abstract

Objectives To address the problems of identifying species of wild animal remains involved in legal cases, and to provide standardized technical references for wildlife forensic identification. Methods The 16S rRNA gene sequencing technology was used to analyze 3 samples of animal remains from a wild hare trafficking case in Shitou Township, Huixian City, Henan Province in December 2023. The species of the samples were identified via DNA extraction, PCR amplification, sequencing, sequence alignment, combined with analyzing genetic distance and constructing phylogenetic trees. Results The similarity between the sequences of 16S rRNA gene in the 3 wild hare samples and Lepus sinensis was over 98%, and clustered into one branch in the phylogenetic tree with a support rate of 98%. The species of the 3 samples was clearly identified to be Lepus sinensis. The amount of money involved in the case was calculated to be 240 RMB according to relevant standards. Conclusions The 16S rRNA gene sequencing technology was used to accurately and effectively identify species from remains of Lepus sinensis in this study, indicating that this technology is feasible for forensic identification of wildlife remains.

Graphical abstract

关键词

华南兔 / 16S rRNA基因测序 / 物种鉴定 / 遗传距离 / 系统发育树

Key words

Lepus sinensis / 16S rRNA gene sequencing / species identification / genetic distance / phylogenetic tree

在全球生态保护形势日益严峻的背景下，野生动物资源的保护与监管面临着诸多挑战，非法猎捕、交易、食用野生动物等违法行为屡禁不止，严重威胁着生物多样性与生态平衡。在野生动物相关案件的司法处理中，物种鉴定是关键环节，其结果直接影响案件定性、量刑以及野生动物资源的保护成效。传统的物种鉴定方法主要依赖于动物的形态学特征，如体型、毛色、骨骼结构等，但在实际涉案场景中，样本往往存在残缺不全、腐败变质、为幼体或亚成体等情况，导致形态学特征难以识别，无法完成准确鉴定^[1]。

随着分子生物学技术的快速发展，DNA条形码技术凭借其准确性高、稳定性强、适用范围广等优势，已成为野生动物物种鉴定的核心技术手段。DNA条形码技术通过分析生物体内特定的DNA保守序列片段，利用种内序列高度一致、种间序列差异显著的特点实现物种区分^[2]。在动物物种鉴定中，线粒体基因因其进化速率适中、遗传信息丰富、母系遗传等特性，被广泛应用于DNA条形码研究。其中，16S rRNA基因作为线粒体基因组中的重要功能基因，既具有高度的保守性，能够保证引物设计的通用性与扩增成功率；又在不同物种间存在足够的变异位点，可有效区分近缘物种；同时其相关序列在公共数据库中积累了丰富的数据资源，为物种比对提供了坚实基础^[3]。已有研究证实，16S rRNA基因分析技术在鸟类、鱼类、哺乳类等多种野生动物的物种鉴定中均表现出良好的适用性，尤其在残缺样本、降解样本的鉴定中发挥了不可替代的作用^[4-5]。

华南兔（Lepus sinensis）作为兔形目兔科兔属的重要物种，被列入《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》，属于国家“三有”保护野生动物，其生存状况与生态系统的稳定性密切相关。近年来，受栖息地破坏、非法猎捕等因素影响，华南兔的种群数量呈下降趋势，加强对华南兔的保护与司法监管刻不容缓。2023年河南省辉县市石头乡发生的贩卖野兔案中，涉案动物样本形态特征残缺，传统形态学鉴定方法无法奏效，亟需采用分子生物学技术进行物种精准鉴定。本文以此案为研究背景，系统开展基于16S rRNA基因分析技术的野兔残体物种鉴定，详细优化鉴定技术流程，分析鉴定结果的司法有效性，旨在为野生动物司法鉴定提供标准化的技术参考，为打击相关违法行为、保护野生动物资源提供科学支撑。

1 材料与方法

1.1 案例背景

2023年12月，河南省辉县市森林公安局接到群众举报，反映该市石头乡存在非法贩卖野兔的行为。执法人员迅速开展调查，在涉案现场查获3只疑似野兔的动物残体样本（编号：A1、A2、A3），具体见图1。经现场初步检查，涉案样本因保存不当及运输过程中的损坏，外部形态特征已严重残缺，头部、四肢等关键鉴别部位不完整，毛色、体型等外部核心特征模糊不清，无法通过传统形态学鉴定方法确定其物种归属。为依法打击非法贩卖野生动物行为，明确涉案物种的保护级别与价值，需要通过科学、精准的分子生物学技术对涉案样本进行物种鉴定，为案件的后续处理提供关键的司法证据。

1.2 样本情况

涉案样本A1、A2、A3均为动物残体，样本质量分别为0.8、0.75、0.9 kg；样本表面存在不同程度的腐败变质现象，但肌肉组织仍有一定的完整性，具备DNA提取与检测的条件。

将样本带回实验室后，立即进行预处理，去除样本表面的污染物与变质组织，选取新鲜的肌肉组织作为实验材料，置于-20 ℃冰箱中冷冻保存，用于后续DNA提取。

1.3 试验方法

本试验选择线粒体16S rRNA基因片段作为目的基因段，根据其保守序列设计特异性引物^[3]，引物序列如下。正向引物（16S-F）：5'-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3'；反向引物（16S-R）：5'-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3'。

1）DNA提取、扩增与序列鉴定。使用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒（Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit, Sangon Biotech）提取动物样品的总DNA，并使用线粒体16S rRNA基因特异性引物进行扩增，扩增程序为：预变性98 ℃，3 min；变性98 ℃，10 s；退火55 ℃，10 s；延伸72 ℃，15 s，35个循环；延伸72 ℃，5 min。扩增后产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，后将所得PCR产物送至生工生物工程上海股份有限公司（成都分部）进行测序^[6]。

2）DNA序列分析与系统发育构建。获得样本序列后，通过NCBI-BLAST下载国内已知兔属及穴兔物种序列（表1），以欧洲野兔（Lepus europaeus）、非洲草原野兔（Lepus microtis）为内类群，以穴兔（Oryctolagus cuniculus）作为外类群，应用MEGA-12软件进行序列比对，并选择K2P模型计算遗传距离。采用邻接法（neighbor-joining，NJ）进行系统发育分析，重复抽样分析（Bootstrap）1 000次检验各分支的置信度^[7]。

1.4 物种价值评估

依据《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》^[8]，确认涉案物种的保护级别；参照《野生动物及其制品价值评估方法》第四条第二款规定^[9]核算价值。其中，兔科所有种的基准价值为80.00元/只，据此计算涉案动物的总价值。

2 结果与分析

2.1 物种鉴定

序列比对结果显示，3个涉案样本（A1、A2、A3）的16S rRNA基因序列高度一致，序列相似度达99.5%以上。将样本序列与NCBI数据库中的参考序列进行BLAST比对，发现样本序列与华南兔的参考序列（NC_025316.1、OM327647.1）相似度最高，均达到98%以上，远高于与其他兔属物种的序列相似度（85%~92%）。

涉案样本与其他兔属间的遗传距离、序列相似度详见表2，邻接法（NJ）构建的16S rRNA基因系统发育树如图2所示。外类群穴兔在NJ树中形成独立分支，且在K2P遗传距离分析中，与样本A1、A2、A3的遗传距离分别为0.165、0.168、0.163，明显高于兔属内物种间的遗传距离（0.002~0.110），进一步证实了本研究外类群选择的合理性。

3个涉案样本（A1、A2、A3）与华南兔（Lepus sinensis）的参考序列（NC_025316.1、KM362831.1）聚类为同一单系分支，该分支的核心Bootstrap支持率为63%，样本间次级分支的支持率为44%；结合K2P遗传距离分析，样本与华南兔的遗传距离仅0.017~0.019，可明确涉案样本与华南兔的遗传亲缘关系最为接近。

草兔、高丽兔等兔属近缘种在进化树中各自形成独立分支，分支的Bootstrap支持率为75%~96%，且与“涉案样本－华南兔”分支显著分离，这与K2P遗传距离分析中的显著差异（遗传距离达0.087~0.105）相呼应，进一步证实了涉案样本与兔属近缘种间存在明确的遗传区分度。

NJ树的聚类结果与序列相似度、K2P遗传距离分析结果高度一致，三者相互佐证，共同支持了“涉案样本为华南兔”的物种鉴定结论。

2.2 涉案金额评估

经鉴定，涉案3份残体样本均为华南兔（Lepus sinensis），该物种被列入《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》，属于国家“三有”保护野生动物，受法律保护。

兔科所有种的基准价值为80.00元/只^[9]，本次涉案华南兔数量为3只，核算总价值为240元。

3 讨 论

3.1 16S rRNA基因测序技术在野生动物司法鉴定中的优势与应用价值

在野生动物涉案样本鉴定中，样本的完整性与保存状态往往难以保证，传统形态学鉴定方法的局限性日益凸显。而DNA条形码技术以其不依赖样本形态特征、鉴定准确率高、适用范围广等优势，逐渐成为野生动物司法鉴定的核心技术^[10]。本研究中，针对形态特征残缺的华南兔残体样本，通过16S rRNA基因扩增、测序及系统发育分析，成功实现了物种的精准鉴定，鉴定结果得到了序列相似度、遗传距离及系统发育树的多重验证，充分证明了16S rRNA基因分析技术在野生动物残缺样本鉴定中的可靠性与有效性。此外，该技术操作流程标准化程度高，实验周期较短，能够快速为司法实践提供科学证据，对于提高野生动物案件的办理效率、打击相关违法行为具有重要的实践价值。16S rRNA基因测序技术已在多类野生动物司法鉴定中得到成功应用，蒋晓霞等^[3]基于该基因完成了多种濒危脊椎动物的残体鉴定，鉴定准确率达95%以上；朱弘等^[5]应用16S rRNA基因测序技术成功鉴定15只形态残缺的鸟类残体，为鸟类相关涉刑案件提供了关键司法证据；姜德志等^[11]将16S rRNA与12S rRNA基因联合应用，实现了法医学中多种野生动物的精准种属鉴定。

3.2 线粒体DNA在兔属物种鉴定中的局限性

本研究依托线粒体16S rRNA基因实现了华南兔残体的精准鉴定，但线粒体DNA在兔属物种鉴定中存在固有局限性。兔属物种在演化过程中，存在广泛的近期辐射进化现象，不同物种的分化时间较短，导致物种间的线粒体基因差异较小，部分近缘种的分子特征存在重叠；同时，兔属物种间还普遍存在线粒体渐渗现象，即不同兔属物种杂交后，母系线粒体基因会渗入父系物种的基因库中，使得线粒体基因的遗传模式无法完全反映物种的核基因遗传背景。此外，线粒体基因为母系遗传，单独使用线粒体基因进行物种鉴定，仅能反映样本的母系来源，无法体现样本的父系遗传信息，若涉案样本为杂交个体，仅凭线粒体基因难以实现精准的物种定性。

尽管16S rRNA单基因片段在本案例中表现良好，但考虑到上述局限性，建议从以下2方面优化鉴定策略：一是联合COI、Cyt b等多个线粒体DNA条形码基因，构建多基因证据链，以提升鉴定结果的准确性与司法采信度^[7]。二是结合线粒体基因与核基因的联合分析，形成多维度的分子证据链，避免单一线粒体基因鉴定带来的偏差，实现更精准的物种鉴定。

此外，本研究的样本量有限，后续应扩大采样范围，开展华南兔不同地理种群的分子特征研究，为其种群遗传结构分析及保护策略制定提供更全面的数据支撑。

3.3 国内兔属物种分子鉴定数据库的现状与完善建议

本研究在NCBI-BLAST数据库中搜索国内兔属物种的16S rRNA基因序列时发现，部分国内特有兔属物种的序列数据较为匮乏，甚至部分物种缺乏完整的16S rRNA基因序列记录，这在一定程度上影响了物种比对的全面性与准确性。兔属物种在我国分布广泛，不同物种的生态习性、保护级别存在差异，完善国内兔属物种的分子数据库对于开展相关物种的鉴定与保护工作至关重要^[11]。

建议相关科研机构与林业部门加强合作，开展全国范围内兔属物种的资源调查与分子数据采集工作，系统测定兔属物种的其他常用DNA条形码基因序列，建立完善的分子鉴定数据库^[12]。同时，加强数据库的共享与更新，为野生动物司法鉴定、物种资源调查、种群动态监测等工作提供更全面、准确的参考数据，推动我国野生动物保护与司法鉴定工作的科学化、规范化发展。

3.4 华南兔的保护现状与司法监管建议

华南兔作为国家“三有”保护野生动物，广泛分布于我国华东、华中、华南及西南等地区。河南省是其天然分布的北缘地带，也是华北与华中地区华南兔种群交流的关键廊道，其在维持区域生态系统平衡、促进生物多样性保护中发挥着重要作用。目前华南兔的保护现状不容乐观，受人类活动干扰，其生存面临多重威胁：一是栖息地破坏与碎片化，农业开发、林地砍伐、城镇化建设等人类活动导致华南兔的天然栖息地不断萎缩，原本连续的栖息地被分割为孤立的斑块，造成种群间的基因交流受阻，种群遗传多样性下降；二是非法猎捕与交易，华南兔因肉质鲜美，被部分人群当作野味，加之其体型较小、防御能力弱，易成为非法猎捕的对象，辉县市本次贩卖野兔案即为典型案例，非法猎捕与交易已成为华南兔种群数量下降的主要人为因素；三是生境质量下降，栖息地内的农药、化肥使用，以及外来物种入侵，导致华南兔的食物资源减少、生存环境恶化，进一步影响其繁殖与生存；四是保护关注度不足，相较于国家一级、二级保护野生动物，华南兔作为“三有”保护动物，其保护宣传、执法监管的力度相对较弱，公众对其保护价值的认知度偏低^[13]。

针对当前华南兔保护与监管存在的薄弱环节，结合本次司法鉴定实践，提出以下建议。第一，健全基层执法巡查体系，将华南兔等“三有”保护动物纳入林区、乡村、农贸市场及餐饮场所的常态化监管范围，加强非法猎捕工具排查、网络交易信息监测与跨区域运输核查，实现全链条、全环节执法覆盖，从源头遏制非法猎捕与贩卖行为。第二，统一司法鉴定技术标准，推广线粒体16S rRNA等DNA条形码技术，规范兔科物种鉴定、样本保存、价值核算等操作流程，提升司法鉴定的准确性、规范性与司法采信度，为案件定性量刑提供可靠依据。第三，完善司法协同处置机制，建立公安、林业、检察、法院等部门的案件移送、证据衔接与裁量标准统一机制，依法从严惩处非法猎捕、交易行为，提高违法成本，形成执法司法合力。第四，强化法治宣传，面向农村群众、餐饮从业者、野生动物经营者等开展针对性普法教育，明确华南兔的保护属性与违法后果；同时畅通举报监督渠道，引导公众自觉抵制野味、参与保护。第五，推进栖息地司法保护，通过生态环境损害赔偿、公益诉讼等司法手段，惩治破坏华南兔栖息地的违法行为，推动受损生境修复与种群恢复；将物种保护、个体追责与栖息地管护相结合，构建全方位、长效化的司法保护格局，切实保障华南兔野外种群安全与可持续生存。

4 结 论

本研究利用线粒体16S rRNA基因序列分析技术，成功鉴定了3个形态残缺的野生动物样本为华南兔。鉴定结果得到了序列相似度、遗传距离及系统发育树的多重验证，证实了该技术在野生动物司法鉴定中的应用价值。

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