基于高分辨质谱的饲料中3种聚醚类药物的快速测定

Rapid determination of 3 polyether antibiotics in feed based on high-resolution mass spectrometry

摘要

目的 建立基于高分辨质谱快速测定方法，用于检测饲料中盐霉素、甲基盐霉素和莫能菌素，实现对3种聚醚类药物的定量分析，为饲料监管提供技术支持。 方法 饲料样品经乙腈－水溶液（含0.1%甲酸）提取离心去除沉淀后，上清液经Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化，所得净化液利用超高效液相色谱－四级杆－静电场轨道阱高分辨质谱仪（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）电喷雾正离子模式，Full MS/dd-MS₂（全扫描/数据依赖型二级质谱）扫描模式开展数据采集，并对盐霉素、甲基盐霉素和莫能菌素进行定量分析。 结果 3种聚醚类药物在2~100 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数R²≥0.991 0，饲料中3种聚醚类药物的平均回收率为92.9%~98.5%，相对标准偏差（RSD）为2.3%～3.5%。 结论 所建立的高分辨质谱方法具有较好的准确性和稳定性，适用于饲料中3种聚醚类药物的快速检测。

Abstract

Objectives A method of rapidly determining 3 polyether antibiotics including salinomycin, narasin, and monensin in feed was established based on high-resolution mass spectrometry to quantitatively analyze them and provide technical support for feed regulation. Methods The samples of feed were extracted with acetonitrile-water solution (containing 0.1% formic acid) and centrifuged to remove the precipitate. The supernatant was purified via SPE using an Oasis PRiME HLB column. The purified solution obtained was used for collecting data with the UPLC-Q-Orbitrap HRMS electrospray positive ion mode and the Full MS/dd-MS2 (full scan/data dependent secondary acquisition) scanning mode. Quantitative analysis was conducted on salinomycin, narasin, and monensin. Results The linear relationship between the 3 polyether antibiotics was good within the concentration range of 2-100 ng/mL, with a correlation coefficient R²≥0.991 0. The average recovery rate of 3 polyether antibiotics in feed was 92.9%-98.5%, with a relative standard deviation (RSD) of 2.3%-3.5%. Conclusions The method with high-resolution mass spectrometry established has good accuracy and stability, and is suitable for rapid detection of 3 polyether antibiotics in feed.

关键词

UPLC-Q-Orbitrap HRMS / 饲料 / 聚醚类 / 快速测定 / 回收率

Key words

UPLC-Q-Orbitrap HRMS / feed / polyether antibiotics (PEs) / rapid determination / recovery rate

作为链霉菌等微生物发酵产生的抗生素，聚醚类药物（polyether antibiotics，PEs）（如盐霉素、甲基盐霉素、莫能菌素、拉沙洛西和马杜霉素等）具有独特的化学特征，其分子结构中含多重环状醚键，两端分别具有羧基和羟基官能团。这种特殊结构通过氢键作用形成环状构象，能够螯合K⁺、Na⁺等碱金属离子形成脂溶性络合物，促使离子向球虫细胞内转运。随之引发渗透压失衡导致水分大量进入细胞，最终通过细胞肿胀死亡的机制发挥抗球虫作用^[1]。此外，聚醚类药物还能增加瘤胃丙酸产量，改善畜禽生长性能并提高饲料转化率^[2-4]。

农业农村部公告第246号规定了盐霉素、甲基盐霉素和莫能菌素3种抗球虫兽药的质量标准、标签和说明书，并在说明书中规定药物的作用与用途、用法与用量、注意事项、休药期等内容。在生产商品饲料时，可根据药物的饲喂对象及用量合规使用，同时还需满足GB 10648－2013《饲料标签》中的相关规定。但在养殖过程中，违规或过量使用聚醚类药物，可能导致禽产品中聚醚类药物残留，对人体健康构成潜在风险，尤其可能加重心血管疾病患者的病情，安全范围较窄。因此，建立饲料中聚醚类药物残留量的检测方法，对于保障畜禽产品的安全具有重要意义。

本研究以原农业部1862号公告-4-2012《饲料中5种聚醚类药物的测定 液相色谱－串联质谱法》为基础，利用UPLC-Q-Orbitrap HRMS电喷雾正离子模式，选用Full MS/dd-MS₂（全扫描/数据依赖型二级质谱）模式进行数据采集，在确保检测结果准确可靠的前提下，优化前处理方法，建立饲料中盐霉素、甲基盐霉素及莫能菌素的定性定量分析方法，以期为聚醚类药物的分析检测提供了可靠的技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

UltiMate 3000-Q-Exactive plus液-质联用系统配电喷雾离子源（美国Thermo Fisher Scientific公司）；固相萃取柱Waters Oasis PRiME HLB（3 cc/150 mg）；高速冷冻离心机SIGMA-3-30K（德国SIGMA公司）；超声波清洗机HS3120（HENGAO T D）；超纯水系统Milli-Q SAS（美国Millipore公司）；分析天平BP211d（北京塞多利斯天平有限公司）；多管涡旋振荡器VX-Ⅲ（北京踏锦科技有限公司）。甲醇、乙腈、甲酸（均为色谱纯）购自德国Merck公司；3种聚醚类标准品（纯度为97.0%~99.9%）购自德国Dr.Ehrenstofer公司。

1.2 试验方法

1）标准溶液的配制。单个聚醚类标准储备液（质量浓度为200 μg/mL）的配制：分别精密称定盐霉素、甲基盐霉素及莫能菌素标准品约10 mg置于3个50 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，摇匀备用（于-18 ℃冷冻保存）。3种聚醚类混合标准中间液（质量浓度为20 μg/mL）的配制：精密量取各单个聚醚类标准储备液1 mL置于同一个10 mL容量瓶中，甲醇稀释并定容，摇匀备用（于-18 ℃冷冻保存）。3种聚醚类混合标准工作液的配制（临用现配）：分别精密量取质量浓度为20 μg/mL混合标准中间溶液适量，使用流动相初始比例的溶液依次稀释成2、5、10、50、100 ng/mL的混合标准工作液。

2）样品前处理。提取步骤：准确称取经粉碎过筛的饲料样品2.00 g（精确至0.01 g）置于50 mL塑料离心管中，加入含有0.1%甲酸的乙腈∶水=80∶20（V/V）提取溶液10 mL，涡旋混匀，先超声提取10 min，再振荡提取5 min。

净化步骤：在4 ℃、10 000 r/min条件下离心5 min，去除沉淀杂质，保留上清液。取3 mL上清液经Waters Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化，过柱时弃去初滤液约1 mL，收集2 mL净化液，混匀后过0.22 μm微孔滤膜，滤液供仪器检测。

3）色谱－质谱条件。在已有工作基础上^[5]，选择合适的色谱条件－质谱条件（表1）以及洗脱程序（表2）。

2 结果与分析

2.1 数据库的建立

在本试验的色谱条件下，混合标准工作溶液（100 ng/mL）在Full MS/dd-MS₂模式下，获得各药物的母离子、保留时间和碎片离子等准确信息（表3）。

2.2 标准曲线和线性范围

高分辨质谱的显著优势在于能够实现更准确的定性分析，即使目标化合物浓度在检出限水平，一级母离子仍可直接用作定量离子。本试验将通过逐级稀释的方式配制成的混合标准工作液进行上机检测，各药物均呈现良好的线性关系，3种聚醚类药物的相关系数（R²）≥0.991 0。为验证本方法的可行性，在空白饲料样品中添加10 μg/kg（参照原农业部1862号公告-4-2012《饲料中5种聚醚类药物的测定 液相色谱－串联质谱法》的定量限）浓度水平的聚醚类药物，进行6次平行添加回收试验，利用标准工作液进行定量分析，测得各药物的平均回收率集中在92.9%~98.5%，相对标准偏差（RSD）为2.3%~3.5%（表4）。

2.3 实际样品的检测及分析

应用本试验所建立的分析方法对不同种类的商品饲料进行聚醚类药物检测，结果显示在4份饲料样品中检出3种聚醚类药物（实际样品检测结果见表5），进一步验证了本研究所建立的方法可以用于实际饲料样品中聚醚类药物残留的检测。

虽然甲基盐霉素可作为抗球虫药添加在鸡饲料中使用，但在产蛋后备鸡前期配合饲料中检出372 μg/kg的甲基盐霉素，该含量尚不能很好地发挥抗球虫作用。该残留可能是由于生产线曾生产过加药饲料，之后未对生产设备进行有效清洗，导致后续生产的饲料中含有药物残留。有研究^[6]表明，生产加药饲料后，药物很容易残留在饲料生产线中，即使经过多次洗仓和生产，生产线及生产出的饲料中仍能检出高浓度的药物。而3个猪饲料样品中检出抗球虫药盐霉素和莫能菌素，也可能是在生产过程中交叉污染所致。将加药饲料和不加药饲料分线生产，能有效避免此类情况。

3 讨 论

高分辨质谱（UPLC-Q-Orbitrap HRMS）的显著优势是将高效的分离能力与卓越的质量分辨率和精确度相结合，能够对复杂基质样品中的未知化合物进行快速、高准确度的筛查与鉴定，同时还能实现对目标物准确定量。该技术已广泛应用于药物研发、食品安全和环境监测等领域，可用于药物代谢产物鉴定、农药残留、兽药残留和新兴污染物的非靶向筛查与精准定量。

聚醚类药物目前主要用作抗球虫，但其安全范围较窄，适用动物种类有限，若在饲料中不当使用，可能对养殖动物造成危害。目前，检测饲料中聚醚类药物残留主要有高效液相色谱法（HPLC）^[7-9]和高效液相色谱－串联质谱法（HPLC-MS/MS）^[10-11]。然而，这些方法普遍存在前处理步骤复杂，有害试剂使用量较大，前处理设备使用频繁等问题。本研究采用提取液提取，经离心、过柱后直接上机检测，与上述方法相比，无需对目标物进行衍生化，也无需对提取液进行氮吹浓缩操作。该方法简化了前处理流程，显著提高了工作效率。但是，本研究仅对饲料中3种聚醚类药物进行定性定量分析，所涵盖的目标化合物种类相对单一，未包含其他禁用或限用药物。然而，随着研究的深入，高分辨质谱标准数据库也会不断扩展和完善，在本方法基础上进一步拓展检测药物种类，进而实现对多种残留药物的高通量筛查和定量。

4 结 论

综上所述，本研究借助高分辨质谱技术，成功建立了用于饲料中3种聚醚类药物残留的快速检测方法。该方法充分发挥了高分辨质谱的高精确度特性，具备操作简便、结果准确可靠等特点，不仅显著提高了检测效率，也能适用于日常监测工作，可为饲料安全监管提供技术支撑。

参考文献

[1] 吕爱军，穆阿丽，宋小敬，等.聚醚类抗生素的作用机理及应用研究进展[J].吉林畜牧兽医，2004，25(5)：22-24.

[2] 王志博，姜万富，辛杭书，等.饲粮添加海南霉素和莫能菌素对奶牛瘤胃发酵特性和氮平衡的影响[J].动物营养学报，2012，24(6)：1098-1104.

[3] 周伟伟，卜仕金.聚醚类离子载体抗生素的研究进展[J].兽药与饲料添加剂，2006，11(3)：13-15.

[4] 黄滨.抗病促生长药物在禽饲料中的应用[J].养殖技术顾问，2014(1)：164.

[5] 张玉利，赵全成，张莹雪，等.基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap高分辨质谱快速筛查饲料中19种兽药[J].郑州师范教育，2025，14(6)：5-8.

[6] 卜泽明，李文静，陈芳，等.饲料生产线中尼卡巴嗪药物污染清洗规律研究[J].饲料工业，2025，46(6)：159-164.

[7] 陈明，陈美琴，耿志明，等.饲料中聚醚类抗生素的柱后衍生同时测定方法研究[J].中国饲料，2005（20）：27-29.

[8] 国家市场监督管理总局，国家标准化管理委员会. 饲料中盐霉素的测定：GB/T 20196－2006 [S].北京：中国标准出版社，2006.

[9] 贾涛.高效液相色谱法检测饲料中甲基盐霉素[J].饲料广角，2012(6)：37-39.

[10] 杜杨，杜磊，孟佳.饲料中三种聚醚类药物残留检测的改进方法[J].甘肃畜牧兽医，2021，51(7)：65-67.

[11] 陈彤，钟名琴，邱永为，等.一种检测饲料中聚醚类抗生素的液相色谱-串联质谱方法[J].国外畜牧学(猪与禽)，2023，43(3)：70-73.

基金资助

河南省市场监督管理局科技计划项目(HNSCJK202592)