伪狂犬病病毒逃避宿主先天性免疫机制的研究进展

Progress on the mechanism of the evasion of pseudorabies virus from host innate immunity

摘要

伪狂犬病（PR）又名奥耶斯基氏病或阿氏病，病原体是疱疹病毒科α疱疹病毒亚科的伪狂犬病病毒（PRV）。先天性免疫是病毒侵入动物体内遇到的第一道防线，但PRV已进化出多种逃避宿主先天性免疫应答的策略。本文综述PRV在动物体内利用US24、US3、gE/gI复合物、UL50等多种蛋白，阻断cGAS-STING和JAK-STAT免疫信号通路、抑制宿主细胞凋亡，并且通过干扰树突状细胞（pDC/cDC）功能削弱先天性免疫细胞活性等分子机制，揭示了PRV免疫逃逸的关键节点，为PRV疫苗的研发提供参考。

Abstract

Pseudorabies (PR), also known as Aujeszky's disease, is caused by pseudorabies virus (PRV), which belongs to the subfamily Alphaherpesvirinae of the family Herpesviridae. Innate immunity is the first line of defense encountered by viruses invading animal bodies, but PRV has evolved various strategies to evade the innate immune response of host. This article reviews the molecular mechanisms by which PRV utilizes various proteins including US24, US3, the gE/gI complex, UL50 in animals to block the cGAS-STING and JAK-STAT immune signaling pathways, inhibit cell apoptosis in host, and attenuate innate immune cell activity by interfering with the function of dendritic cells (pDC/cDC). The key nodes of PRV immune evasion are revealed as well. It will provide a reference for the research and development of vaccines against PRV.

关键词

伪狂犬病病毒 / 猪 / 免疫逃避 / 先天性免疫 / 疫苗研发 / 防控策略

Key words

pseudorabies virus (PRV) / pig / immune evasion / innate immunity / research and development of vaccine / strategies of prevention and control

伪狂犬病病毒（PRV）是一种双股线状DNA病毒，属于疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科。其基因组大小约150 kb，DNA碱基GC含量高，约为73%，包含70个开放阅读框，编码70多种蛋白质^[1]。PRV可以感染多种哺乳动物，猪是其唯一的自然宿主。猪伪狂犬病（PR）是以病猪、带毒猪、潜伏感染猪等作为传染源，通过唾液、鼻液、精液、呼吸道飞沫、胎盘、乳汁、污染饲料、器械和人员等方式传播的一种高接触性、非人畜共患传染病。猪伪狂犬病对仔猪、成年猪及母猪均有危害，仔猪感染后多表现为神经系统症状，且死亡率高；成年猪多表现为呼吸系统疾病；母猪则多表现为繁殖系统疾病。该病给我国乃至全球的养猪业造成了严重经济损失^[2]。

先天性免疫是宿主细胞遭遇病毒入侵后的第一道防线。病毒表面存在多种病原体相关分子模式（PAMPs），这些结构能够被宿主细胞内的模式识别受体（PRRs）识别，两者结合后激活下游信号通路，促使细胞产生Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）及一系列的促炎因子，进而消灭病毒^[3]。但PRV已经进化出多种策略逃避宿主细胞的先天性免疫。PRV在动物体内通过UL54、UL24、US3等基因抑制宿主cGAS-STING干扰素信号通路，通过UL50、UL42和US3等基因抑制宿主JAK-STAT干扰素信号通路，通过US3基因抑制宿主细胞凋亡；此外，变异毒株中的糖蛋白E/糖蛋白I（gE/gI）复合物还可以抑制浆细胞样树突状细胞（pDC）产生IFN-Ⅰ，从而抑制先天性免疫细胞的活性。本文对伪狂犬病病毒逃避宿主先天性免疫的机制进行综合阐述，以期为PRV疫苗的研发以及猪伪狂犬病的防控研究提供一定参考。

1 伪狂犬病概述

猪伪狂犬病是严重危害世界养猪业的重要种源性疫病之一，也是养殖场需要进行净化消灭的疫病。PRV可以感染牛、羊、猪等多种哺乳动物，传播途径包含直接接触（黏膜创伤）、间接接触（尿液、唾液、乳汁等）和垂直传播（母猪经胎盘脐带传给仔猪）。感染PRV后，各年龄阶段的猪均会受到不同程度的危害，其中以仔猪和母猪最为严重。一月龄内的仔猪感染PRV后潜伏期较短，随着病程的发展，表现出体温升高、精神萎靡、反应力低、视力下降、咳嗽气喘、呼吸困难等症状；后期可见转圈、兴奋不安、共济失调等神经症状，甚至衰竭死亡。妊娠母猪因生殖系统功能损伤，表现出产死胎、木乃伊胎和带毒的病弱胎等临床症状。成年猪感染PRV后症状不明显，种公猪偶见睾丸炎，影响其繁殖能力^[4]。

我国在20世纪50年代首次报道该病。2011年下半年起，多个接种伪狂犬病疫苗的猪场暴发疫情，提示PRV变异株已迅速扩散^[5]。对河南省2020－2024年猪的108 370份样品检测分析发现，PRV-gE抗体阳性检出率呈下降趋势，疫情主要发生在每年3月，并且在屠宰场中检出的gE阳性率最高^[6]。在对云南省2022－2023年部分地区猪场的248份样品的检测中发现，PRV野毒株仍然存在^[7]。在对我国东北、华北、华东、华中、西北、西南地区的共6 172份血清抗体检测中发现，PRV-gE阳性率仍然有8.55%^[8]。多项调查结果指明，当前我国PR得到一定控制，但野毒株对养殖业的威胁依旧存在。由于PR治疗尚无特效药物，只能进行对症治疗，我国防控要求已从控制转变为净化。主要净化措施包括淘汰患病猪只、进行科学的饲养管理、健全养殖场生物安全管理制度以及实施疫苗接种等。

2 PRV逃避宿主先天性免疫的机制

先天性免疫是宿主细胞抵御病毒入侵的第一道防线：PRV被宿主cGAS-STING通路中的DNA感受器（cGAS和TLR9）识别，诱导IFN-Ⅰ产生，从而抑制病毒复制；在JAK-STAT通路中则通过诱导干扰素刺激基因（ISGs）表达，阻断病毒蛋白合成，从而抑制病毒复制；TLR-NF-κB通路促进IL-6、IL-1β等炎症因子，增强宿主免疫反应。此外，宿主还可通过细胞自噬、细胞凋亡，体液免疫和细胞免疫等方式对PRV进行多层次防御。然而，PRV已进化出逃逸策略，如通过自身基因阻断宿主信号通路、干扰抗原传递、沉默自身基因躲避宿主免疫识别等方式逃逸宿主免疫。PRV编码的免疫逃避蛋白见表1。

2.1 抑制cGAS-STING信号通路

cGAS-STING信号通路机制：宿主细胞遭受PRV侵入后，病毒释放自身双链DNA，在细胞质中被环形GMP-AMP合成酶（cGAS）识别，经过酶催化合成环形GMP-AMP（cGAMP），cGAMP可结合并激活高尔基体的干扰素刺激因子（STING），后者进一步招募并激活其下游分子TANK结合激酶1（TBK1），活化的TBK1磷酸化修饰IRF3，促使其进入细胞核，最终诱导IFN-Ⅰ产生。此外，TBK1亦可激活下游的NF-κB通路，从而诱导机体产生促炎性细胞因子和IFN-Ⅰ^[16]。

PRV的UL54基因由1 092个核苷酸组成，编码363个氨基酸的蛋白。PRV UL54基因不抑制NF-κB启动子活性，但可以显著抑制IRF3、维甲酸诱导基因Ⅰ蛋白（RIG-Ⅰ）、TBK1和核因子κB抑制蛋白激酶ɑ（IKKɑ）诱导的IFN-β启动子活性^[9]。

杨月麟^[10]的研究发现，PRV UL24蛋白不仅对cGAS-STING信号通路的激活具有明显的抑制作用，而且过表达该蛋白同样能抑制TNF-α介导的NF-κB信号通路的激活。免疫共沉淀和间接免疫荧光试验证实，UL24蛋白可与P65蛋白及干扰素调节因子7（IRF7）形成一定的相互作用，并通过蛋白酶体降解途径显著降低P65与IRF7蛋白的表达水平，以此抑制cGAS-STING通路介导的IFN-β活化过程^[11]。

蛋白激酶可以使宿主蛋白磷酸化并改变其功能，从而调控转录、翻译、细胞周期、蛋白质降解和细胞凋亡等生物学过程。PRV US3和UL13蛋白均属于保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。US3蛋白可改变宿主细胞骨架、抑制组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）和2（HDAC2）、干扰IFN应答，破坏宿主的各种防御机制^[12]。孔正杰^[13]通过体内外实验发现，UL13蛋白可抑制STING介导的下游信号分子活化，以及IFN-Ⅰ和其下游ISGs的表达，从而抑制STING介导的宿主抗病毒免疫。

gE是位于核膜上的跨膜糖蛋白。研究表明，gE可与糖蛋白gI形成异源二聚体，诱导CREB结合蛋白（CBP）降解，且降低cGAS-STING介导的IFN-β启动子活性和mRNA表达水平，最终导致IRF3无法结合CBP，从而抑制IFN-β的产生^[17]。

2.2 抑制JAK-STAT信号通路

JAK-STAT信号通路机制：IFN-Ⅰ以自分泌或旁分泌方式，与细胞表面的同源受体（IFNAR1和IFNAR2）结合，结合后形成二聚体，进而诱导Janus蛋白酪氨酸激酶家族的成员JAK1和JAK2的激活和磷酸化。活化的Janus激酶（JAK）可介导信号转导与转录激活因子（STATs），如STAT1、STAT2的磷酸化反应，形成pSTAT1/pSTAT2异二聚体。该异二聚体与IRF9共同构成的三聚体复合物ISGF3，在进入细胞核后能够结合ISRE的特定DNA序列，启动ISGs的转录，抑制病毒的复制^[18]。

为逃避宿主免疫，PRV已进化出多种方式来抑制或破坏JAK-STAT信号通路。宿主感染PRV会抑制IFN诱导的STATs磷酸化和ISGs转录，也会导致包括IFNAR1和JAKs在内的关键信号分子的降解，从而阻断ISGF3和ISG启动子的结合^[19-20]。

PRV UL50蛋白是一种脱氧尿苷三磷酸水解酶（dUTPase），可催化脱氧尿苷三磷酸（dUTP）水解为脱氧尿苷一磷酸（dUMP）和无机焦磷酸。研究发现，PRV UL50蛋白具有抑制IFN通路下游JAK-STAT信号传导的功能^[14]；根据已有研究线索推测，其作用机制可能是通过加快IFNAR1的溶酶体降解，从而抑制IFN-Ⅰ诱导的STAT1磷酸化。

PRV UL42蛋白通过阻止ISGF3和ISRE的结合来抑制IFN-Ⅰ信号传导，从而实现免疫逃避^[20]。研究发现，UL42蛋白直接与ISRE相互作用，干扰ISGF3与ISRE的结合；这种相互作用依赖于UL42蛋白上4个保守的DNA结合位点。用丙氨酸取代这些DNA结合位点，会导致UL42蛋白的ISRE结合能力降低，并削弱PRV逃避IFN反应的能力^[15]。

研究发现，Bclaf1可以调节IFN诱导的STAT1/STAT2磷酸化，通过形成ISGF3-Bclaf1-ISRE复合物来增强ISGF3复合物向ISG启动子的募集。在PRV感染期间，US3蛋白可通过磷酸化Bclaf1，导致其泛素化和降解，从而抑制IFN诱导的抗病毒基因转录^[21]。

2.3 抑制宿主细胞凋亡

病毒感染细胞后，一方面，宿主细胞会产生促凋亡信号，诱导细胞凋亡，从而限制病毒的复制和扩散过程；另一方面，病毒自身的基因或其诱导表达的蛋白能够发挥抗凋亡作用，造成持续性感染。US3是PRV中唯一具有抗凋亡活性的基因，可编码US3a和US3b两种蛋白亚型，其抗凋亡作用依赖激酶活性。其中，含线粒体定位序列的US3a可直接靶向线粒体，抗凋亡活性更强。机制上，US3a和US3b蛋白通过激活宿主PI3K-Akt和NF-κB等抗凋亡通路，抑制caspase-3、caspase-7等促凋亡分子，阻断细胞的天然免疫凋亡信号（磷酸化IRF3、降解Bclaf1），从而在多个节点阻断细胞凋亡，支持病毒的持续感染^[22-23]。体外试验表明，US3蛋白在感染后期可抑制PRV诱导的猪睾丸（ST）细胞凋亡^[24]。

2.4 与先天性免疫细胞的相互作用

浆细胞样树突状细胞（pDC）是树突状细胞的小亚群，约占猪外周血单核细胞（PBMC）总量的0.1%，专门生产大量的IFN-Ⅰ。pDC产生的IFN-Ⅰ比任何其他细胞多1 000倍，因此在控制病毒感染方面起着至关重要的作用^[25]。IFN-Ⅰ可以通过JAK/STAT信号通路干扰病毒复制周期，从而限制病毒在体内的进一步传播。研究发现，与野生型PRV毒株的基因组相比，PRV Bartha活疫苗株基因组存在多处突变，尤其是在短独特区（US）的缺失，包括US2的部分缺失、大部分US7（编码gI）的缺失，以及US8（编码gE）和US9的完全缺失。与感染野生型PRV毒株（Becker和Kaplan）的细胞相比，感染Bartha活疫苗株的细胞能够引起猪pDC产生的更多的IFN-Ⅰ^[26]。对Bartha株US基因全缺失或部分缺失试验表明，病毒gE/gI复合物的缺失导致IFN-Ⅰ反应增加，即gE/gI复合物可以抑制pDC产生IFN-Ⅰ。进一步研究表明，PRV gE的缺失导致pDC中细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的磷酸化增强，引起下游IFN-Ⅰ分泌增加^[26]。以上研究表明，PRV gE/gI复合物通过抑制ERK1/2磷酸化来阻断IFN-Ⅰ分泌，从而抑制宿主pDC活性；Bartha活疫苗株的gE/gI编码基因缺失，因此解除了此抑制，使ERK1/2过度激活与IFN-Ⅰ高表达，可增强疫苗免疫原性。

自然杀伤细胞（natural killer cell，NK细胞）是先天免疫的组成部分，其抗病毒活性受表面激活/抑制受体与病毒感染细胞表面相应配体之间一系列复杂相互作用的影响。PRV可以通过多种方式抑制NK细胞的活性，例如PRV的囊膜糖蛋白（gD）介导NK细胞上的激活受体DNAM-1的配体CD122下调^[27]；US3蛋白介导NK细胞上的抑制受体CD300a的配体上调^[28]，激活受体NKG2D的配体的下调^[29]，从而抑制宿主的先天性免疫功能。

3 PRV疫苗的研究现状

疫苗免疫是猪伪狂犬病最有效的防控手段，其作用效果与毒株类型、病毒含量及疫苗佐剂等因素有关^[30]。当前，全球最典型的PRV毒株是Bartha毒株，通过鸡胚致弱Bartha毒株制成的疫苗已经帮助许多国家成功根除该病。现有PRV疫苗类型包括灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程缺失苗、亚单位疫苗和重组PRV载体疫苗等，目前我国广泛使用的是gI/gE双基因缺失的Bartha-K61株疫苗，该疫苗既降低了毒力反强的风险，又保障了疫苗的有效性。但随着2011年以来变异毒株的持续变化，为探究PRV疫苗的稳定性和安全性，各地研发团队已经开发了多种基因工程疫苗。其中，华中农业大学研发的HNX-12株疫苗可针对变异毒株提供稳定的免疫保护^[31]；普莱柯生物工程股份有限公司研发的HN1201-R1株猪伪狂犬活疫苗，免疫效果优于传统的Bartha-K61株疫苗^[32]。当前也有部分地区尝试免疫伪狂犬Ｃ株疫苗，结果表明达到一定免疫效果，保护率达80%^[33]。根据对病毒的毒力基因结构和基因的功能研究将是未来PRV疫苗的研发方向。

4 结 语

PRV已进化出多种逃避宿主先天性免疫应答的策略，例如借助US3、gE/gI复合物、U50等多种蛋白干扰IFN-Ⅰ的产生与阻断JAK-STAT信号通路；通过激活PI3K-Akt、NF-κB通路、稳定线粒体膜电位、阻断Caspase级联活化，从而抑制宿主细胞凋亡；通过抑制树突状细胞（pDC/cDC）的抗原呈递与细胞因子分泌来削弱固有免疫细胞活性等，最终成功建立病毒的持续性感染。综上，了解PRV逃避宿主天然免疫的具体途径及其关键毒力基因，将为PRV疫苗的研制提供参考。

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