不同口蹄疫病毒O型免疫抗体ELISA检测试剂盒的比对分析

Comparison of different ELISA kits for detecting immune antibodies against foot-and-mouth disease virus type O

摘要

目的 评价不同品牌口蹄疫病毒O型免疫抗体ELISA检测试剂盒的有效性，以确保实验室检测结果更加客观可靠。 方法 采集湖北省家畜血清样品108份，分别用GB/T 18935－2018《口蹄疫诊断技术》国家标准ELISA和8种ELISA试剂盒（包括阻断法、竞争法、间接法）进行口蹄疫病毒O型免疫抗体检测。以该标准方法的检测结果为标准，通过Kappa一致性检验、McNemar检验及诊断效能评价（特异性、敏感性、符合率和变异系数），比对分析8种商品试剂盒的检测效果。 结果 试剂盒A的综合检测性能与稳定性最优：敏感性为93.9%、特异性100%、符合率96.3%，变异系数（CV）=0%，Kappa值0.923，与标准检测法一致性极强。试剂盒C-2和E虽敏感性高（97.0%、95.5%），但特异性仅为47.6%和42.9%，假阳性率高达52.4%和57.1%。在不同物种（猪、牛、羊）血清检测中，各试剂盒表现差异显著。其中试剂盒A在各物种血清检测中均表现良好（牛、羊血清检测符合率均为100%，猪血清为91.7%）。 结论 不同品牌的商品化试剂盒检测效果存在差异，建议在实际监测工作中，以标准方法为参考，对商品化试剂盒进行一致性、差异性和诊断效能评价，将检测效果作为筛选试剂盒的首要考量因素，以确保实验室检测结果客观准确。

Abstract

Objectives The diagnostic performance of different enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits for detecting immune antibodies against foot-and-mouth disease virus type O was evaluated to ensure that results of laboratory tests are more objective and reliable. Methods The ELISA method specified in GB/T 18935-2018 and 8 brands of commercial kits including blocking method, competitive method, and indirect method were used to detect immune antibodies against foot-and-mouth disease virus type O in the 108 samples of clinical serum collected from livestock in Hubei Province. With the results of the national standard method as the reference, the performance of the 8 commercial kits was compared through Kappa consistency test, McNemar test, and diagnostic performance indicators including the specificity, sensitivity, conformity rate, and coefficient of variation (CV). Results The comprehensive performance of detection and stability of kit A was the best, with the sensitivity of 93.9%, specificity of 100%, overall conformity rate of 96.3%, CV of 0%, a Kappa value of 0.923, highly consistent with the standard method of detection. Kits C-2 and E had high sensitivity of 97.0% and 95.5%, but their specificity was only 47.6% and 42.9%, with false positive rate as high as 52.4% and 57.1%, respectively. There were significant differences in the performance of each kit for detecting serum of different species including pig, cattle, and sheep, with kit A performing well across all species and achieving 100% conformity rate in both cattle and sheep, and 91.7% conformity rate in pig. Conclusions There are differences in the diagnostic performance of commercial kits from different brands. It is recommended to use standard methods as a reference in practical monitoring work to evaluate the consistency, difference, and diagnostic performance of commercial kits. The detection performance should be the primary consideration for screening kits to ensure that results of laboratory tests are objective and accurate.

关键词

口蹄疫病毒 / 血清检测 / Kappa检验 / McNemar检验 / 诊断效能 / 比对评价 / 免疫抗体

Key words

foot-and-mouth disease (FMD) virus / serological test / Kappa test / McNemar test / diagnostic performance / comparison and evaluation / immune antibody

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种全球性的烈性传染病，对各种偶蹄目动物均有危害，被世界动物卫生组织（WOAH）列为法定报告动物疫病，我国农业农村部将其列为一类动物疫病^[1]。该病有传染性强、地理分布广泛的特点，在全球范围内频繁发生，给畜牧业造成了严重冲击和巨大经济损失^[2]。我国实行以免疫为主的综合性防控措施，主要通过接种口蹄疫灭活疫苗，使动物获得特异性保护抗体，达到预防和控制的目的^[3]。近年来，随着新型合成肽疫苗技术的发展，新一代的O型口蹄疫疫苗开始被广泛应用^[4]。为评价免疫效果，制定科学的防控措施，亟需建立准确、可重复的检测方法。

血清学抗体检测在口蹄疫综合防控体系里起着非常重要的作用。GB/T 18935－2018《口蹄疫诊断技术》中的ELISA检测是目前国家认可的标准检测方法^[5]，由于其特异性良好、敏感性较高，在评价疫苗免疫效果以及监测疾病流行程度方面具有很高的应用价值，被业界视为权威的标准方法^[6]。然而，传统的ELISA检测技术仍然存在着一些不足之处，如检测时间长、成本高、储存条件严格、操作复杂、对技术人员的专业技能要求高等，而且对复杂疫苗抗体检测的适应性较差，试剂盒有效期短等问题也日益突显^[7]。

基于此，本文以目前市场上主流的口蹄疫O型免疫抗体ELISA试剂盒产品为研究对象，以GB/T 18935－2018《口蹄疫诊断技术》中ELISA的检测结果为参照标准，系统比较分析8种ELISA商品试剂盒（包括阻断法、竞争法、间接法）对口蹄疫O型免疫抗体的检测性能，以期为提高相关检测数据的准确性与可靠性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）检测试剂盒。本试验中所测试的8种口蹄疫O型免疫抗体ELISA试剂盒购自5家国产试剂公司，编号分别为A、B、C、D、E、F、G、H。试剂盒A、B、G来源于同一家公司，试剂盒E、H来源于同一家公司，试剂盒C、D、F分别来自三家公司。8种试剂盒的详细信息见表1。

2）血清样品。采集血清样品共计108份，均来源于湖北省临床免疫后的家畜，其中猪血清样品48份，牛血清样品30份，羊血清样品30份。

口蹄疫标准血清购自国家口蹄疫参考实验室，其他动物疫病阳性血清和阴性血清购自普道（北京）标准技术有限公司。其中，敏感性试验使用已知效价的口蹄疫O型阳性标准血清作为参照；特异性检测共使用8种口蹄疫O型阴性对照血清，分别为：①口蹄疫A型的阳性血清；②其他动物疫病的阳性血清（猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病、牛病毒性腹泻、羊小反刍兽疫）；③未接种口蹄疫O型疫苗动物的阴性血清（猪、牛、羊）。

3）试验设备。F50型96孔酶标仪购自TECAN公司；2台恒温培养箱分别购自CARBOLITE、上海精宏科技有限公司。单通道和多通道精密移液器均购自RAININ公司。

1.2 ELISA试剂盒评价方案

本试验共采集108份血清样本，用8种口蹄疫O型免疫抗体ELISA试剂盒对不同背景的血清样品进行抗体水平的筛查分析。对于48份猪源性血清样本，使用所有的8个试剂盒进行测定；对于30份牛源性、30份羊源性的血清样本，分别用5种不同的ELISA试剂盒（A、B、C、D、E）检测。所有检测均严格按照各试剂盒说明书操作并判读。C试剂盒给出了2种不同的结果判定方法，分别用C-1、C-2表示。试剂盒F、G、H仅检测猪血清样品，因此后文对不同物种的分析中，F、G、H的结果仅涉及猪血清部分。

试剂盒性能评价的主要指标有敏感性、特异性、重复性、符合率这4个方面。

1）敏感性。①分析敏感性：选用效价已知的口蹄疫O型阳性标准血清为实验样本，按照产品说明书进行标准化操作，以试剂盒能够检出O型抗体的最高血清稀释倍数表示分析敏感性；②诊断敏感性：用采集的108份临床血清样品进行检测，评价各试剂盒对阳性样品的检出能力，诊断敏感性=（正确检出的阳性样品数/总阳性样品数）×100%。其中总阳性样品数为GB/T 18935－2018《口蹄疫诊断技术》国家标准ELISA法检出的阳性样品数。

2）特异性。①分析特异性：使用待检试剂盒对8种不同来源的口蹄疫O型阴性血清进行交叉反应检测；②诊断特异性：用采集的108份临床血清样品进行检测，评价各试剂盒对阴性样品的检出能力，诊断特异性=（正确检出的阴性样品数/总阴性样品数）×100%。其中总阴性样品数为国家标准ELISA法检出的阴性样品数。

3）重复性。选用效价已知的口蹄疫O型标准阳性血清，在实验室条件下按照预设的梯度连续稀释到8个浓度点，根据试剂盒类型，检测效价、阻断率、PI值、Cut-off值或S/P值，做3次独立重复检测，通过计算变异系数（CV）评估试剂盒的重复性。CV=（标准差/平均值）×100%。其中标准差表示3次检测结果的离散程度，平均值为3次检测结果的算术平均值。CV值越小说明试剂盒的重复性越好，判断标准为：CV＜2%为优秀，2%≤CV＜5%为良好，5%≤CV＜10%为可接受，CV≥10%为不理想；建议试剂盒CV值应不超过5%。

4）符合率。将各试剂盒的检测结果与GB/T 18935－2018《口蹄疫诊断 技术》国家标准ELISA法的检测结果进行对比，评价试剂盒检测的准确性。符合率=（与标准方法检测结果一致的样品数/总检测样品数）×100%。

1.3 数据处理分析

对检测数据采用Excel处理，用SPSS 20.0软件进行统计学分析。将8种试剂盒与GB/T 18935－2018《口蹄疫诊断技术》国家标准ELISA法的检测结果进行对比分析。

1）结果一致性。以各试剂盒与国家标准ELISA法的检测结果（阳性/阴性）为对象，应用Kappa检验进行一致性评估^[8]：Kappa系数＜0，一致性极差；0~0.2，微弱；0.21~0.4，弱；0.41~0.6，中度；0.61~0.8，高度；0.81~1.0，极强。

2）结果差异性。应用配对χ²检验（McNemar检验）比较8种试剂盒与国家标准ELISA法的检测结果（阳性/阴性）差异，计算P值。P＜0.05表示检测结果存在显著差异，P＜0.01为差异极显著^[9]。

2 结果与分析

2.1 试剂盒检测特性分析

1）适用范围。8种试剂盒的适用范围如表1所示。其中，试剂盒C、D对口蹄疫疫苗抗体检测最具有兼容性，试剂盒A、B、E主要用于灭活疫苗抗原特异性抗体检测，试剂盒F、G、H主要用于合成肽疫苗特异性抗体检测。

2）分析特异性。对8份不同来源的口蹄疫O型阴性血清进行检测，结果显示，所有试剂盒对阴性样品均正确识别，无交叉反应。

3）分析敏感性。各试剂盒的分析敏感性表现不同，其中C-2和F分析敏感性最高，其次为C-1和E，再次为A，最次为B、D、G、H。

2.2 诊断效能评价

对108份血清样品，以GB/T 1893－2018《口蹄疫诊断技术》国家标准ELISA方法为标准，检出66份口蹄疫O型抗体阳性、42份阴性。8种待测试剂盒的检测结果详见表2；根据结果分别计算8种试剂盒的诊断敏感性、诊断特异性、符合率和变异系数(CV)，详见表3。

试剂盒A检测性能最佳，诊断敏感性为93.9%，诊断特异性100.0%，符合率96.3%，CV=0%，各指标均在理想范围内。试剂盒G次之，诊断敏感性96.6%、诊断特异性100.0%、符合率97.9%，CV=2.35%，除变异系数为良好外，其余指标均在理想范围内。试剂盒F、H的诊断敏感性均为100.0%，但诊断特异性较低，分别为36.8%、78.9%，表明假阳性率偏高（F为63.2%、H为21.1%）。试剂盒C-2、E的诊断敏感性较高（分别为97.0%和95.5%），但是诊断特异性均低于50%，其中试剂盒E的CV为10.81%，说明在检测的重复性上不理想。试剂盒D的诊断特异性良好（100.0%），但诊断敏感性很低（77.3%），表明假阴性率偏高（22.7%）。

对不同动物来源血清的检测结果见表4，各试剂盒的性能特点在不同物种血清检测中存在明显差别（表5）。在猪血清检测中，除试剂盒F（符合率75.0%）外，其他试剂盒符合率均高于80%。试剂盒D、G的符合率最高，均为97.9%；试剂盒C-1次之，为93.8%；试剂盒A和H相当，为91.7%；其后依次为试剂盒B、C-2、E、F。在牛血清检测中，试剂盒A符合率最好（100.0%），诊断敏感性和特异性均为100.0%；试剂盒C-2的符合率最低（63.3%），尽管其诊断敏感性高达100.0%，但诊断特异性低至8.3%，无法对阴性样品进行有效筛选。在羊血清检测中，试剂盒A符合率最好（100.0%），试剂盒C-1次之（83.3%），试剂盒C-2和B相当（均80.0%），试剂盒D、E最低（均66.7%）。

同一试剂盒对不同动物源血清的检测性能差异较大，在牛、羊血清中尤为明显。因此，在实际应用时需根据检测对象来选用合适的试剂盒种类。

2.3 一致性与差异性分析

采用Kappa一致性检验法，对各试剂盒检测结果与国家标准ELISA法结果进行比较，结果见表6。试剂盒A的总体一致性最好，Kappa值为0.923（P＜0.01），与标准结果一致性极强；其他试剂盒按照一致性优劣排序为：试剂盒D（0.726）、试剂盒B（0.719）、试剂盒C-1（0.677）、试剂盒C-2（0.488），试剂盒E（0.421），结果均达到显著一致水平（P＜0.01）。

从物种角度出发，Kappa一致性检验结果见表7。在猪血清样本的检测中，试剂盒D、G的Kappa值均为0.957(P＜0.01)，一致性最优；在牛、羊血清样本的检测中，试剂盒A的Kappa值均为1.000，与标准结果完全一致，一致性明显优于其他试剂盒。以上结果表明，各试剂盒在不同物种的血清抗体检测中，实际检测性能存在较大差别。

将各试剂盒的检测结果分别与国家标准ELISA法的检测结果进行McNemar检验，比较差异性，结果详见表8。试剂盒A（P=0.125）、C-1（P=0.077）的检测结果与标准方法间无明显统计学差异。试剂盒B与标准方法间存在显著差异（P＜0.05）；试剂盒C-2、D、E与标准方法差异极显著（P＜0.01）。其中，C-2、E两种试剂盒倾向于过度检出阳性样品，而B、D假阴性率较高。

从不同动物种类分析，结果见表9。在猪血清检测中，仅试剂盒F出现极显著差异（P=0.000），检测阳性百分比（85.42%）明显高于标准阳性百分比（60.42%），表明其假阳性率较高；其他试剂盒与标准方法间均无显著差异。在牛血清检测中，试剂盒C-2、E与标准方法结果间有极显著差异（P＜0.01），均表现为高假阳性。在羊血清检测中，试剂盒C-2（P=0.031）、D（P=0.002）和E（P=0.002）与标准法间有显著差异，其中D表现为高假阴性，C-2和E表现为高假阳性。

3 讨 论

从本次试验的综合分析结果可知，基于液相阻断技术的试剂盒A在针对猪、牛、羊这3种动物血清样本的检测中，均表现出良好的稳定性以及准确性，总体Kappa值高达0.923，且与标准ELISA方法的检测结果间无显著统计学差异。相比之下，其余试剂盒普遍存在敏感性和特异性难以兼顾的问题，且在不同动物中的检测性能也表现出明显的异质性特征。

3.1 不同ELISA技术对检测性能的影响

不同试剂盒采用的检测技术路线存在差异，主要包括液相阻断法、固相阻断法、固相竞争法、间接法等，因此其在检测性能方面表现出较大差别。

1）液相阻断法。该方法以完整的病毒颗粒作为抗原，在体外环境中能够与血清样本中的目标抗体充分结合。由于液相阻断法保留了抗原全部的特异性构象表位，可同时检测多种亚型抗体，因此在诊断敏感性和诊断特异性两方面均表现良好^[6]，适用于多物种检测。

本研究中，基于液相阻断法的试剂盒A整体检测表现最优，与标准方法一致性最强。试剂盒B虽然也采用液相阻断法，但其诊断敏感性和诊断特异性均低于试剂盒A，符合率为86.1%，Kappa值为0.719。这可能与B为提高检测效率而缩短反应时间，以及采用了不同的显色方法有关。

相比之下，基于固相竞争法的试剂盒C、D、E均存在诊断敏感性和诊断特异性难以兼顾的问题，间接法试剂盒F、G、H的检测性能差异更大，进一步验证了液相阻断法（特别是试剂盒A）的相对优势。本研究中液相阻断法优于固相竞争法和间接法的结论，与赵灵燕等^[7]的研究结果大体一致，表明本试验所使用的检测体系具有良好的可靠性与可重复性。

2）固相竞争法。通过单克隆抗体对特定抗原表位的竞争性抑制特性来实施检测，其检测性能在很大程度上受到靶标表位选择以及阈值参数设定的影响。

本次试验中，采用该方法的试剂盒C、D、E性能差异很大。试剂盒C-1诊断敏感性93.9%、诊断特异性71.4%、符合率85.2%、Kappa值0.677；试剂盒D诊断敏感性77.3%、诊断特异性100%、符合率86.1%、Kappa值0.726；试剂盒E诊断敏感性95.5%、诊断特异性仅42.9%、符合率75.0%、Kappa值0.421。可见C、D、E 3种试剂盒在诊断敏感性和诊断特异性的平衡上各不相同，表明虽然都采用竞争法，但不同厂家在单克隆抗体的表位选择、检测阈值标准的建立上存在较大差异，从而影响检测性能。

3）间接法。此类试剂盒以VP1合成肽作为包被抗原，仅能检测针对VP1上特定表位的抗体，因此适用范围最窄。

试剂盒F、G、H均采用该方法，仅适用于猪血清的检测，且各试剂盒间性能差异明显：试剂盒F诊断敏感性为100%，但诊断特异性仅为36.8%，符合率为75.0%；试剂盒G诊断特异性为100%，诊断敏感性96.6%，符合率97.9%，检测性能较好；试剂盒H的诊断敏感性为100%，诊断特异性78.9%，符合率91.7%，但重复性较差（CV=6.23%）。这充分说明了间接法依赖于单一VP1表位，其检测性能与厂家的抗原制备和表位选择高度相关，在3种方法中稳定性最差。

以上结果表明，即使试剂盒使用的方法学原理相同，不同厂家在抗原纯度、包被策略和判定标准等方面的差异，同样能够显著影响试剂盒的检测性能。综合分析可知，除生物学因素以外，厂家在选择原料、改进生产工艺、建立质量管理体系等各方面的具体措施，都会对终端产品的实际使用性能产生重要影响。

3.2 商品化试剂盒存在的问题

已有文献表明，市场上使用的O型口蹄疫ELISA试剂盒在商品化过程中仍面临诸多技术瓶颈需要解决。部分产品过分追求敏感性的提升而牺牲了特异性，导致交叉反应率升高，对动物免疫状态的准确判定产生影响^[10]，大部分试剂盒说明书对于目标检测对象以及疫苗适用范围的描述较为笼统，缺少针对特定物种或者群体的验证数据，不同品牌的检测结果稳定程度有较大差别^[11]。此外，由于各生产厂商自行设定的阳性判定阈值标准不一致，造成同类试剂盒及仪器之间的检测数据无法互认和互相兼容，这一状况严重阻碍了区域协同防疫工作的有效开展。据现有研究数据可知，在口蹄疫灭活疫苗免疫效果评价方面，不同品牌的商品化试剂盒之间存在明显差异^[3]。这种差异并非源于样本来源或地域因素，而是反映出当前市场上试剂产品质量良莠不齐的现状，亟需通过技术创新加以改善。

在国际上，对于此类检测产品的标准化建设已经取得了一定成果。WOAH对ELISA试剂盒的性能评估建立了规范的验证体系，要求对敏感性、特异性、重复性等关键指标进行系统评估。泰国学者Seeyo等^[2]通过比较分析6种市售非结构蛋白（NSP）ELISA试剂盒发现，这些试剂盒的敏感性区间为97.75%~99.50%，特异性达到97.25%~100%。这一研究结果为不同试剂盒的性能评价提供了参考数据，有助于推动该类产品检测标准的统一。尽管该研究主要针对非结构蛋白抗体的检测，但其采用的以明确阳性和阴性背景血清为参考标准的设计思路，仍具有重要的借鉴意义。

在我国科研实践中，部分商品化试剂因缺乏严格的质量控制标准，导致检测结果稳定性较差，在多物种交叉验证中存在明显缺点。相较之下，以单克隆抗体为基础的高特异性阻断ELISA技术已经被广泛应用于多种动物疾病的临床诊断，且表现出良好的兼容适用性，不受生物种属的限制。目前，学术界尚未形成一套统一规范的操作标准，难以有效减小系统误差所带来的不确定性，因此，有必要通过加强行业自律来促进国产试剂产品品质的提高，从而满足多样化的检测需求^[12]。

3.3 改进建议

为了解决上述问题，在产品研发阶段需要基于实际需求进行专项研究，采用先进技术手段来改善敏感性与特异性之间的平衡关系，优化判定阈值的设定，在敏感性与特异性之间寻求更好的平衡^[9]。从应用角度出发，可以采取复合策略：利用高效的初筛工具对疑似阳性的样品进行快速甄别，再将其送至高精度检测平台进行复核确认。这样既可以有效降低假阳性率，又可以提高整体的检测效率。同时，建议建立商品化试剂盒的统一质控评价体系，定期组织多中心比对评价，为基层实验室提供选用参考；加强第三方机构对市售产品性能评价体系的建设与监督；以此推动行业的技术革新与规范化发展^[2,13]。

3.4 研究局限与未来方向

本次试验研究存在以下局限性：①样品来源单一。本研究所用样品均采集自湖北省，地域来源较为单一，代表性有限。②样品阳性率较高。由统计资料可知，较高的阳性样本比例可能会对检测的特异性产生一定干扰，若有61.1%的样品血清呈阳性反应，在一定程度上可能会降低实验结果的特异性及可靠程度^[14]。③样本量较少。研究仅选取了30份牛血清、30份羊血清作为分析样本，在样本量较少的情况下，检测结果的准确性与稳定性难以得到保证。④试剂盒批次单一。试验所用试剂盒为单一批次，缺乏对批间差异性、稳定性的系统检验和比较。

在未来研究中，应扩大样品量及采集范围，纳入多省份、多免疫程序的畜群样品，以增强研究结论的普适性；同时应采用多批次平行对照实验，全面考察试剂盒在实际使用过程中的长期性能表现。当前研究表明，通过改进传统ELISA，可以在不降低检测准确性的同时提高检测速度。一系列新兴的生物传感技术，例如化学发光免疫分析、多重ELISA等，正在逐渐被应用到临床当中。这些技术具有较高的检测效率和良好的操作便捷性，是未来口蹄疫抗体监测的新趋势，值得进一步深入研究与推广。

4 结 论

本研究以GB/T 18935－2018《口蹄疫诊断技术》国家标准ELISA方法为参照，对8种商品化口蹄疫病毒O型免疫抗体ELISA检测试剂盒的性能进行了比对评价。结果表明，不同品牌的商品化试剂盒在检测效果上存在差异，且针对不同动物种属的检测结果表现出较大差别。其中，试剂盒A具有良好的检测性能及稳定性，在猪、牛、羊血清样本中的检测结果与标准方法均具有较高的一致性，诊断特异性达100.0%。鉴于商品化试剂盒质量参差不齐且缺乏统一评价标准，在实际监测工作中不能盲目选择试剂盒，而应根据检测对象的动物种类和疫苗免疫背景，在充分了解各项技术参数的基础上做出合理的决策，不能仅依靠某一单项评价指标来判定试剂盒检测性能。

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