凯氏定氮法测定饲料中粗蛋白的方法优化

Optimizing the Kjeldahl method for determining the content of crude protein in feed

摘要

目的 明确全自动凯氏定氮仪测定饲料中粗蛋白含量时各类影响因素对测定结果准确性的影响，优化测定条件，以提升检测可靠性。 方法 采用单因素试验研究法，系统探究了取样环节、消解环节及试剂相关等问题对测定结果的影响，并针对性开展优化试验。 结果 取样均匀且根据粗蛋白含量选择适宜取样量，用称量纸包裹样品可减少取样损失；消解采用梯度升温，并在消化管上放置小漏斗；按国标要求，6.4 g催化剂搭配12 mL硫酸可满足大部分饲料消解需求，氢氧化钠加入量为浓硫酸量的4倍可保证蒸馏碱性环境；选用有光泽的紫色结晶甲基红，按甲基红乙醇溶液∶溴甲酚绿乙醇溶液=1∶5，临用前混合，且硼酸溶液与指示剂配比为100∶1，可避免终点无法判断。 结论 取样、消解及试剂相关的各项因素均会影响饲料粗蛋白的测定准确性，通过本研究优化的各项条件，可有效提高全自动凯氏定氮法测定饲料粗蛋白的准确性与稳定性。

Abstract

Objectives The effects of factors affecting the determination of the content of crude protein in feed with a fully automatic Kjeldahl nitrogen analyzer on the accuracy of the results were studied to optimize the conditions of measurement and improve the reliability of the detection. Methods The effects of the process of sampling and digestion, and reagent-related issues on the results of measurement were systematically identified with a single factor experiment method. Experiments of targeted optimization were conducted. Results The uniform sampling, an appropriate amount of sampling based on the content of crude protein, and wrapping the sample with weighing paper reduced the loss of sampling. The gradient heating was used for digestion, and a small funnel was placed on the digestion tube. 6.4 g of catalyst combined with 12 mL of sulfuric acid met the needs of digesting most samples of feed according to national standards. Adding 4 times the amount of concentrated sulfuric acid to sodium hydroxide ensured the alkaline environment required for distillation. The methyl red with glossy purple crystals was selected and mixed with a ratio of methyl red ethanol solution to bromocresol green ethanol solution of 1:5 before use, and the ratio of boric acid solution to indicator was 100:1 to avoid the inability to determine the end point. Conclusions Factors related to sampling, digestion, and reagents all affect the accuracy of measuring the content of crude protein in feed. The conditions optimized in the article can effectively improve the accuracy and stability of determining the content of crude protein in feed with the automatic Kjeldahl method.

关键词

饲料 / 粗蛋白 / 凯氏定氮法 / 催化剂用量 / 加碱量 / 消化温度

Key words

feed / crude protein / Kjeldahl nitrogen determination method / dosage of catalyst / dosage of alkali / digestive temperature

饲料作为畜牧业发展的物质基础，质量安全直接关系到动物健康、畜产品品质和人类食品安全。粗蛋白作为饲料营养价值的重要评价指标之一^[1]，不仅对饲料原料的成本起决定性作用，更是饲料企业检验原料是否合格、成品是否达标的基本工作。从营养学角度来看，蛋白质是动物生长发育、新陈代谢和生产性能的关键营养物质。精确测定饲料中的粗蛋白含量对于合理配制动物日粮、优化饲料配方、提高饲料利用效率具有重要意义。同时，饲料粗蛋白含量的准确检测也是保障动物产品质量安全、推动畜牧业可持续发展的重要技术支撑。

饲料中粗蛋白质的测定方法种类很多，无论采用何种检测方法，若试验操作不规范、会引入较大误差，显著影响检测结果的准确性。当前饲料粗蛋白测定的经典方法为凯氏定氮法^[2]。该方法原理如下：样品在催化剂作用下，经浓硫酸高温消解，分解破坏试样中的有机物，使样品中的氮转化为硫酸铵；再向消解液中加入强碱进行蒸馏，促使氨气逸出；逸出的氨气被硼酸溶液充分吸收后，以盐酸标准滴定溶液进行滴定，据此测得样品总氮含量；将氮含量乘以换算系数6.25，最终换算得出样品中的粗蛋白质含量^[3-5]。为了使测定结果有更好的准确度和精密度，需要分析总结影响饲料中粗蛋白测定过程的因素，本文总结粗蛋白测定过程中遇到的取样问题、前处理过程的注意事项和催化剂用量、硫酸加入量和碱加入量；样品消解过程中出现的上冲爆沸，酸气体挥发，消化温度和时间；无法判断滴定终点时药品的选择和配制，并结合实际操作经验，对自动定氮仪方法在应用过程中遇到的常见问题进行详细阐述，旨在为饲料粗蛋白的检测工作提供可靠的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）试验样品。饲料苜蓿干草，东莞市精析标物计量科技有限公司的粗蛋白标准物质RMY-D069，此标准物质证书中的粗蛋白含量为（10.40±0.52）%。

2）主要仪器。电子天平MS304TS/02（精密度为0.000 1ｇ）；石墨消解仪（型号SH220F）；海能全自动凯氏定氮仪（型号K9860）。

3）试剂。0.1 mol/L盐酸标准滴定液，400 g/L氢氧化钠溶液，20 g/L硼酸溶液；甲基红与溴甲酚绿分别用无水乙醇配成0.1 g/100 mL溶液，临用前1份甲基红溶液加5份溴甲酚绿溶液混匀，再按1∶100的比例加入硼酸溶液中；浓硫酸，混合催化剂（硫酸钾与五水硫酸铜的质量之比为6∶0.4）。以上试剂均为分析纯，用水均为无氨蒸馏水。

1.2 试验方法

首先，精确称量约0.5 g样品（精确到0.1 mg），并将其放入专用的消化管中。接着，添加6.4 g的混合催化剂（硫酸钾与五水硫酸铜的质量之比为6∶0.4）和12 mL浓硫酸，确保充分混合。将消化管置于设定好温度的石墨消解仪中加热，当消化完成后，让消化管自然降温。然后，取出消化管，放入全自动凯氏定氮仪，设置硼酸吸收液、稀释水、氢氧化钠溶液加液量，蒸馏5 min；用0.1 mol/L盐酸标准溶液进行滴定，溶液由蓝绿色变为紫红色即为终点^[6]。测定样品同时做空白试验，空白组不加样品，其余试剂、操作步骤完全相同。计算公式如下：

X=\frac{[(V_{\mathrm{2}}-V_{\mathrm{1}})\times C\times \mathrm{0.014}]\times \mathrm{100}\times \mathrm{6.25}}{m}

式中，V₂为滴定试样消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL；V₁为滴定空白消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL；C为盐酸标准滴定溶液的摩尔浓度，mol/L；m为待测试样质量，g。

2 结果与分析

2.1 取样问题

1）样品不均匀，取样无代表性。所采集样品应具备代表性。受饲料生产加工工艺限制，成品饲料颗粒均匀性较差，因此检测前需对样品进行粉碎处理，确保称量试样组分均匀一致，以此保障检测结果精准可靠。因此，应采用四分法对样品进行划分，利用粉碎机或研钵对样品进行充分粉碎后全部通过0.45 mm孔径样品筛。

2）选择适合的取样量。可根据不同样品蛋白质含量对取样量进行调整。一般自动定氮仪为25 mL滴定管，建议样品中含氮量为5~30 mg，滴定盐酸标准滴定溶液的体积在一滴定管之内，避免滴定体积过大或过小，影响试验的准确度和效率。

3）取样过程有损失或误差。一是对于固体样品取样时，建议采用称量纸进行包裹；二是对于液体样品，滴落至消化管1/3以上的样品要用清水及时进行冲洗，避免粘在消化管壁的样品消化不完全，给试验带来误差。

2.2 消解问题

1）上冲、爆沸。若样品中糖类、脂类含量较高，建议采用梯度升温，控制反应，保持平稳进行。若样品在常温条件下与酸反应强烈（比如含碳酸根较多的样品），应放置一段时间后再进行消解。若取样量大，在消解过程中出现上冲及消解不彻底的现象，在试验允许的情况下可以适当减小取样量；同时建议采用梯度升温，控制反应，保持平稳进行。

2）消解过程中酸气体挥发。消解炉不要留有空位，可用密封消化管或者空白消化管加5~10 mL硫酸进行补位。如果消解样品数量较少，可不使用排废罩，直接将小漏斗放置在消化管上。以上这些措施可以减少样品消解过程中硫酸的挥发，避免造成样品消解不完全。

3）消解不完全。消解完全时溶液颜色呈澄清透明的蓝绿色，冷却后样品呈浅蓝色或灰白色。需要注意：对于含有难消解成分的样品，如赖氨酸、色氨酸、酪氨酸等，需要适当延长消解时间；在硝态氮测定过程中，由于需要加入铬粉，高温环境下会产生粉色沉淀，此时可根据实际情况适时停止消化。

4）消化温度及时间。样品消化过程需缓慢加热，消化初期采用小火低温炭化，待样品完全焦化后，再逐渐提高加热温度。若升温过快，部分含氮物质来不及反应转化为硫酸铵，就以气态形式逸出，最终导致测定结果偏低。

消化时长是饲料粗蛋白检测的关键控制点：消化时间不足，样品中含氮组分无法完全转化；消化时间过长，则易引发氨挥发损失，干扰测定精度。因此，选择样品变绿后不同消化时间对粗蛋白测定的影响进行试验，结果（表1）表明：样品变绿后消化0.5 h，粗蛋白测定值偏低；随着消化时长的延长，检测结果逐渐升高；消化时长达到2 h后，粗蛋白含量增幅趋于平缓，且2.0 h与2.5 h的测定结果偏差处于1%允许误差范围内。综上确定，样品消解液变绿后，最优消化时长控制为2 h；过长的消化时间对提升检测结果无显著作用，反而会增加能耗与时间成本，造成资源浪费。通过对试验结果的分析，最终选择的升温过程是在220 ℃保持1 h，320 ℃保持1 h，420 ℃保持2 h。

2.3 试验药品的加入量

1）催化剂用量的影响。催化剂中硫酸钾的作用是提高消化温度，在样品消化阶段，随着浓硫酸的分解与水分不断蒸发，消化液中硫酸钾浓度逐渐升高，使消化液沸点随之上升，进而加快有机物的分解速率。但需严格把控硫酸钾投加量，不可过量；若消化温度过高，反应生成的硫酸铵会发生分解，形成氨气逸出，最终造成测定结果偏低。当消化液冷却后呈固态，表明硫酸钾用量过大；当硫酸钾用量偏少时，消化温度就偏低，试样中有机物的分解速度就会缓慢。催化剂中硫酸铜的作用一方面是作为催化剂进一步加速试样的消化分解；另一方面，在蒸馏氨时可作为碱性反应的指示剂。国标明确规定：6.4 g催化剂搭配12 mL浓硫酸^[7]，可以满足绝大多数常规样品的消解检测需求。若样品需加大硫酸的用量，应同步适当调整催化剂添加比例；同时，蒸馏环节的碱液投加量也需进行相应调整。

2）加碱量。样品蒸馏时必须加碱，加入碱的作用是中和硫酸，并使溶液处于强碱性，使铵根变成氨气被硼酸吸收。由表2可知：40%氢氧化钠的加入量为消化时加入浓硫酸量的2倍和3倍时，饲料粗蛋白标准物质RMY-D069和饲草苜蓿样品检测结果偏低，这是氢氧化钠的加入量不足，不能使溶液处于碱性环境，铵根不能完全变成氨气被硼酸吸收，导致试验结果偏低。

当氢氧化钠的加入量为消化时加入浓硫酸量的4倍时，饲料粗蛋白标准物质RMY-D069的结果变化范围为10.21%~10.67%，均在饲料粗蛋白标准物质RMY-D069标准值的浮动范围内，即（10.40±0.52）%，说明此时加入的氢氧化钠量符合要求。而当氢氧化钠的加入量为消化时加入浓硫酸量的5倍时，饲料粗蛋白标准物质RMY-D069和苜蓿样品的检测结果和氢氧化钠的加入量为消化时加入浓硫酸量的4倍时的结果相差很小，饲料粗蛋白标准物质RMY-D069的结果均在其标准值的浮动范围内，说明此时过量加碱对试验结果的正确性无影响，但会造成试剂的浪费。

因此，氢氧化钠的加入量为消化时加入浓硫酸量的4倍，这样可以保证蒸馏过程的碱性环境。

向消化管中加入碱液后，溶液颜色会由无色转变为黑褐色，这是碱与硫酸铜发生化学反应，生成氢氧化铜，在浓硫酸遇水放热、酸碱反应放出热量后，氢氧化铜受热后分解生成氧化铜沉淀所致，同时出现黑褐色沉淀也是加碱液足够的标志。

2.4 试验用药品的选择和配置

1）药品的选择。在试验过程中会遇到试验终点无法判断的情况，此时应考虑配制混合指示剂的药品是否合适，例如在选择甲基红时需选用有光泽的紫色结晶，红棕色粉末不能使用；再者甲基红比较难溶解，在配制时需要超声半小时溶解或提前几天配制。

2）接收液的配制。接收液中指示剂的混合比例及硼酸溶液和指示剂的混合比例要按照自动定氮仪厂家给出的要求进行混合，不然会出现无法判定滴定终点的情况。

此试验过程中，海能全自动凯氏定氮仪（型号K9860）指示剂的配制方法：甲基红乙醇溶液与溴甲酚绿乙醇溶液的比例为1∶5，临用前混合均匀；硼酸溶液与指示剂配比为100∶1，如一次配制3 L硼酸溶液，加5 mL甲基红乙醇溶液和25 mL甲酚绿乙醇溶液的混合液。

3 讨 论

本试验围绕全自动凯氏定氮仪测定饲料中粗蛋白含量的关键影响因素展开研究，通过针对性优化试验确定了取样、消解、试剂选择及配制等环节的最优条件。首先，取样规范性是测定准确的前提，现有研究^[8-9]均强调取样代表性和均匀性，但未明确取样损失控制措施及具体操作细节。本研究提出按粗蛋白含量选取样量和采用称量纸包裹样品等措施来减少损失，提升了取样规范性与可控性。

其次，消解作为前处理的核心步骤，现有研究多优化单一温度或时间，未涉及系统性梯度升温，易出现消解不彻底或反应剧烈的问题，且未明确梯度参数^[10-13]。本研究采用梯度升温，搭配消化管小漏斗防止酸气挥发，避免上冲、爆沸，保证消解彻底且反应平稳，为仪器规范化操作提供具体参数。

再次，试剂选择与配制。试剂影响测定的准确性，现有研究未明确试剂搭配用量、甲基红选择标准及指示剂具体配比^[14-15]。本研究明确最优试剂搭配（6.4 g催化剂+12 mL硫酸，氢氧化钠为浓硫酸4倍量），确定指示剂配比（甲基红∶溴甲酚绿=1∶5，硼酸∶指示剂=100∶1），解决终点判断模糊问题。

本研究优化措施实用、创新，但仍有完善空间，未来将扩大样品范围，提升方法普适性，结合仪器自动化实现全流程管控，将优化后的全自动凯氏定氮法与其他粗蛋白检测方法（如杜马斯燃烧法）进行对比，分析不同方法的优缺点及适用场景，研究饲料中其他成分的干扰影响及消除措施，推动饲料粗蛋白检测方法完善，支撑饲料工业高质量发展。

4 结 论

本试验明确了全自动凯氏定氮法测定饲料中粗蛋白的取样、梯度消解及试剂配比最优条件，完善了取样控损、梯度升温消解和指示剂配制等关键操作参数，有效提升了检测准确度与方法实操规范性，可为饲料粗蛋白检测提供技术参考。

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