猪链球菌病DNAzyme快速诊断技术与综合防控研究进展

Progress on DNAzyme-based rapid diagnosis and comprehensive prevention and control of swine Streptococcosis

摘要

猪链球菌是重要的人兽共患病原菌，其引发的猪链球菌病严重威胁养猪业发展与公共卫生安全，快速精准诊断和综合高效防治是该病防控的核心。脱氧核酶（DNAzyme）兼具核酸识别特异性与酶催化放大效应，且合成简便、稳定性强，在病原快速检测领域展现出显著优势。本文以猪链球菌病的DNAzyme诊断技术和综合防治为核心，综述猪链球菌检测用DNAzyme的筛选技术及相关检测传感器的构建研究，整合该病免疫预防、药物防治与生物安全防控的研究成果，分析当前基于DNAzyme的诊断技术及猪链球菌病综合防治体系的现存挑战，未来研究应聚焦多技术融合的智能化诊断、血清型全覆盖检测、新型疫苗与替代抗菌疗法研发，为猪链球菌病的科学精准防控提供理论依据和技术支撑。

Abstract

Streptococcus suis (SS) is an important zoonotic pathogen posing a serious threat to the development of pig farming and the public health and safety. Rapid and accurate diagnosis, and comprehensive and efficient prevention and control, are the core of prevention and control of diseases. Deoxyribozyme (DNAzyme) combines the specificity of recognizing nucleic acid with the effect of amplifying catalyzed enzyme, with the advantages of simple synthesis and strong stability, having significant superiority in the field of rapidly detecting pathogen. This article focused on the DNAzyme-based diagnosis and the comprehensive prevention and control of swine Streptococcosis, and reviewed the progress on the technology of screening DNAzyme and the construction of related biosensors for the detection of swine SS. The existing challenges of DNAzyme-based diagnosis and the comprehensive prevention and control system of swine Streptococcosis were analyzed by integrating the achievements of immunized prevention, drug prevention, and prevention and control of biosafety. Studies in the future should focus on the intelligent diagnosis through the integration of multiple technologies, full-coverage detection of serotypes, the R & D of new vaccines and alternative antibacterial therapies to provide the theoretical basis and technical support for the scientific and precise prevention and control of swine Streptococcosis.

Graphical abstract

关键词

猪链球菌 / 脱氧核酶 / 快速诊断 / 生物传感器 / 重组酶聚合酶扩增

Key words

swine / Streptococcus suis (SS) / deoxyribozyme (DNAzyme) / rapid diagnosis / biosensor / recombinase polymerase amplification (RPA)

猪链球菌病是全球性分布的急性细菌性传染病，自1954年首次在丹麦分离鉴定以来，已在世界主要养猪国家和地区广泛流行，成为集约化养猪业的重要疫病之一^[1]。该菌血清型多样性显著，目前已发现29个传统血清型及多个新荚膜基因簇变体^[2]，其中猪链球菌2型（SS2）毒力最强、流行最广，是导致猪群发病和人类感染的主要血清型^[3]。猪链球菌可通过破损皮肤、黏膜接触病（死）猪体液，或食用未煮熟的污染猪肉等途径感染人类，引发脑膜炎、败血症等严重疾病，病死率高达20%，被世界卫生组织列为重点关注的人兽共患病原体^[4]。我国自1958年首次报道该病以来，多地曾发生SS2暴发流行，凸显了防控工作的紧迫性^[5]。

快速、准确的病原诊断是阻断疫病传播的前提。传统病原分离培养需耗时3~5 d，对低浓度感染样本的检出率有限^[6]；血清学检测易受交叉反应影响，无法实现早期诊断^[7]；常规PCR等分子方法依赖专业仪器，不适用于基层现场检疫^[8]。近年来，等温扩增技术虽解决了仪器依赖问题，但仍存在特异性不足的短板^[9]。

1994年，Breaker和Joyce首次发现具有催化活性的DNAzyme，打破了“酶仅为蛋白质”的认知^[10]。DNAzyme凭借高特异性、易修饰等优势，成为病原检测传感器的核心元件^[11]。在猪链球菌检测领域，国内外学者已在DNAzyme筛选与传感器构建方面取得突破性进展^[12]。与此同时，猪链球菌的抗生素耐药性持续加剧^[13]、疫苗保护存在局限性^[14]，综合防控体系亟待完善^[15]。基于此，本文聚焦DNAzyme诊断技术核心进展，整合防治研究关键成果，以期为猪链球菌病的精准防控提供参考。

1 猪链球菌检测用DNAzyme的筛选技术

DNAzyme的靶向特异性是实现猪链球菌精准检测的核心，筛选依赖指数富集的配体系统进化技术（SELEX）。传统SELEX以纯化靶标为核心，通过多轮“结合→分离→扩增”的正筛与反筛富集特异性DNAzyme序列，但存在靶标纯化繁琐、筛选周期长的缺陷^[16]。针对猪链球菌检测，靶标选择至关重要。根据检测目的不同，靶标主要分为两类：一是血清型特异性基因，如cps2J基因（SS2/1/2型特异性）、cps7H和cps9H基因（SS7和SS9型特异性）；二是种属保守功能基因，如recN基因可区分猪链球菌与重新分类的副猪链球菌（Streptococcus parasuis）^[12]。

针对SS2分型检测，Eiamphungporn等^[17]以cps2J基因为靶标建立的RPA-NALFIA检测体系，对SS2识别特异性达100%，可有效区分其他28种常见病原菌，检测限为10³ CFU/mL。该研究同时采用cps2K基因区分SS2与SS1/2型，通过单核苷酸多态性（SNP）位点实现精准分型^[17]。Sun等^[12]开发的CRISPR/Cas12a-DNAzyme平台进一步引入反向筛选策略，以SS7、SS9基因组DNA为反筛靶标，筛选的DNAzyme对目标血清型识别特异性显著高于其他血清型及同属链球菌，且无交叉反应，灵敏度比传统PCR高1 000倍，检测限达1 fg。针对通用型检测，以recN基因为靶标的检测体系可覆盖SS2、SS7、SS9等我国高发血清型，为猪链球菌的通用检测奠定了基础。值得注意的是，gdh基因虽为常用种特异性靶标，但无法区分猪链球菌与S. parasuis（原SS20、22、26型），而recN基因可有效鉴别^[18]。

为解决传统SELEX技术的不足，新型SELEX技术不断涌现。重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）技术将RPA与侧流层析结合，可在37 ℃恒温下30 min内完成检测，无需昂贵的热循环仪，适用于资源有限现场的快速筛查^[19-20]。CRISPR/Cas12a系统进一步提升了检测特异性，其反式切割活性可实现信号放大，结合G4DNAzyme化学发光可视化技术，无需专业设备即可肉眼判读结果^[21]。此外，基于cps基因簇的分型策略，可分阶段筛选多种流行血清型的特异性DNAzyme，实现一次检测覆盖主要病原型别^[23-24]。

综上所述，SELEX技术的不断优化与靶标选择的精细化，为猪链球菌特异性DNAzyme的高效筛选和精准检测提供了有力工具。结合RPA等恒温扩增技术与CRISPR/Cas系统的DNAzyme检测平台，显著提升了现场快速检测能力，推动了该病原检测技术向高灵敏度、高特异性、便携化方向发展^[22-23]。

2 基于DNAzyme的猪链球菌检测传感器构建

基于筛选得到的特异性DNAzyme，结合信号转换技术构建的生物传感器，是实现猪链球菌快速检测的核心载体^[16]。目前，已开发出荧光DNAzyme传感器、化学发光DNAzyme传感器和DNAzyme-CRISPR-Cas12a级联传感器三大类，分别适配实验室精准检测与基层现场筛查。

2.1 荧光DNAzyme生物传感器

荧光DNAzyme传感器是目前技术最成熟的类型，核心原理是利用靶标介导的DNAzyme切割反应，通过荧光信号判断^[24]。该传感器通过构建荧光共振能量转移（FRET）淬灭体系，将荧光基团与淬灭基团分别标记于DNAzyme底物链两端，靶标存在时，DNAzyme切割底物链，释放荧光信号^[25]。

Sun等^[12]开发的CRISPR/Cas12a-DNAzyme平台采用双重信号输出策略，通过FAM标记的荧光探针实现荧光检测（激发波长485 nm，发射波长535 nm），同时结合G4DNAzyme化学发光技术实现肉眼判读。该平台针对recN、cps7H、cps9H基因的检测限达1 fg（基因组DNA），灵敏度较传统PCR提升100~1 000倍。DNAzyme荧光法检测时，阳性样本在蓝光激发下呈绿色荧光，阴性样本呈黄色；化学发光法检测时，阳性样本呈蓝色，阴性样本无色，2种方法均可在30 min内完成判读。

2.2 化学发光DNAzyme生物传感器

化学发光DNAzyme传感器凭借“肉眼可判读、无需专业仪器”的优势，成为基层适配性最强的检测技术^[16]。该技术的核心是利用G-四链体（G-quadruplex）与血红素（hemin）形成的G4DNAzyme复合物，模拟过氧化物酶活性，催化ABTS²⁻与H₂O₂反应生成显色产物ABTS⁻（绿色）^[26-27]。

Sun等^[12]将CatG4R探针融入CRISPR/Cas12a检测系统，构建了G4DNAzyme化学发光平台，反应物与hemin形成活性G-四链体－血红素复合物，实现显色反应的催化。该方法无需荧光检测设备，仅依靠温度控制装置即可完成检测，5~7 min内可肉眼判读结果，检测限与荧光法一致。

与荧光法相比，G4DNAzyme化学发光法具有显著的环境稳定性。G-四链体结构通过Hoogsteen碱基配对形成，在不同温度条件下均能保持催化活性，其熔解温度（T_m）范围宽，适用于现场检测中精确温控难以实现的场景^[28-29]。此外，该方法消除了对额外标记的需求，降低了检测成本。

2.3 DNAzyme-CRISPR-Cas12a级联传感器

为突破传统DNAzyme传感器的灵敏度瓶颈，多技术融合成为研究热点，其中DNAzyme与CRISPR-Cas12a的级联体系表现出最优性能^[30]。该体系由Chen等^[21]首次提出，利用CRISPR-Cas12a的反式切割活性，实现“双重识别、双重放大”，将检测灵敏度提升至单拷贝靶标水平。

由图1可知，CRISPR-Cas12a结合靶标DNA后，会激活非特异性单链DNA切割活性^[21]。Sun等^[12]构建的猪链球菌级联传感器检测过程分为两步：首先，重组酶聚合酶扩增（RPA）在37 ℃恒温下扩增靶标基因，15~30 min完成；随后，扩增产物激活CRISPR-Cas12a复合物，使其切割荧光标记的报告探针或G4DNAzyme探针，释放检测信号。该策略将RPA的恒温扩增优势与CRISPR的高特异性相结合，检测限低至1 fg，较传统PCR方法灵敏度提升1 000倍^[31]。

值得注意的是，Sun等^[12]首次将G4DNAzyme化学发光技术应用于猪链球菌血清型7和9的特异性检测，填补了此前研究主要集中于SS2的空白。该平台通过RPA-CRISPR-Cas12a-G4DNAzyme的级联设计，实现了“恒温扩增－高特异识别－可视化输出”的全程便携化检测，为资源有限地区的猪链球菌现场筛查提供了新工具。

3 猪链球菌病的防治

猪链球菌病的防控遵循“预防为主、防治结合、综合防控”的原则，核心包括免疫预防、药物防治和生物安全防控三大板块。新型疫苗研发、精准用药及标准化防控体系成为研究重点^[32]。

3.1 免疫预防

疫苗免疫是预防猪链球菌病最经济有效的手段之一。目前，临床应用的疫苗主要分为灭活疫苗和亚单位疫苗两类^[15]。

灭活疫苗因安全性高、工艺成熟，成为规模化猪场的主流选择。我国主流多价灭活疫苗覆盖SS2、SS7、SS9等高发血清型，可为猪群提供基础群体保护^[33]。但该类疫苗免疫原性相对较弱，需2~3次免疫才能诱导持久保护力。Wisselink等^[34]在欧洲七国的研究表明，灭活疫苗对同源血清型保护效果较好，但对异源血清型交叉保护不足。

亚单位疫苗以MRP、EF、SLY等毒力相关蛋白为核心抗原，具有纯度高、免疫原性强、安全性好等优点^[35]。但亚单位疫苗存在血清型交叉保护力弱的缺陷，且生产成本较高，限制了其规模化应用。Wisselink等^[34]证实，MRP和EF联合使用可诱导一定保护力，但单独使用无保护作用；Marois等^[22]建立的多重PCR方法可用于筛选携带特定毒力基因的菌株，为亚单位疫苗的靶标选择提供依据。Gottschalk等^[35]指出，针对CPS的抗体反应具有保护潜力，但CPS免疫原性较差，如何克服这一缺陷是疫苗研发的主要挑战。

基因工程疫苗是未来发展方向。Li等^[36]鉴定的Sao蛋白是目前唯一被证明能诱导交叉保护的抗原成分，但其对大多数血清型的保护有效性仍有待评估。Kerdsin等^[37]通过多位点序列分型（MLST）技术，揭示了泰国SS2的分子流行病学特征，为疫苗靶标选择提供了数据支撑。未来需通过基因工程技术融合多血清型保守抗原，优化佐剂系统，提升交叉保护力。

科学的免疫程序是保障疫苗效果的关键。规模化猪场应根据当地流行血清型制定合理免疫程序：母猪产前4~5周免疫，通过母源抗体保护仔猪；仔猪21~28日龄首免，间隔2~3周加强免疫。

3.2 药物防治

猪链球菌的耐药性呈逐年上升趋势，且具有明显的地域差异。Zhang等^[13]对我国SS2分离株的耐药性分析显示，对四环素的耐药率最高。Lun等^[38]的研究证实，猪链球菌耐药性已在全球范围内传播，成为临床治疗的重大挑战。Goyette-Desjardins等^[39]的全球分布研究指出，不同地区耐药谱差异显著，需建立针对性用药策略。

临床治疗应遵循“药敏试验指导、精准用药”的原则：优先选择头孢菌素类、喹诺酮类、酰胺醇类等敏感抗生素；败血症型和脑膜炎型应尽早、足量、足疗程使用抗生素（一般连续用药3~5 d）；脑膜炎型需配合甘露醇降低颅内压；关节炎型采用局部注射联合全身用药。

新型抗菌策略成为研究热点。Liu等^[40]的研究结果表明，纳米银（AgNPs）对猪链球菌具有潜在抗菌作用，可能通过抑制细胞壁肽聚糖合成实现杀菌效果。中草药如黄连、金银花等醇提物具有显著抗菌活性，为替代疗法提供了新思路。Segura等^[4]指出，在抗生素限制时代，开发新型抗菌策略尤为迫切。

3.3 综合防控策略

生物安全管理是阻断疫病传播的第一道防线。规模化猪场应建立严格的准入制度，对人员、车辆、物资实施分级管控和消毒登记。Arai等^[41]在日本的猪肉污染调查显示，57.9%的样本检出猪链球菌，提示屠宰加工环节的生物安全控制至关重要。Boonyong等^[42]的研究证实，猪肉及可食用猪器官污染是重要传播风险。猪舍应定期采用含氯消毒剂、过氧乙酸等进行环境消毒；病死猪必须按规范进行无害化处理。

监测预警与人员防护是防控体系的重要补充。猪场应定期采集样本进行血清学检测和病原分离，明确流行血清型与耐药性特征。Xia等^[43]系统综述了从传统细菌培养到免疫传感器的检测方法演进，为监测技术选择提供参考。鉴于猪链球菌的人畜共患病特性，从业人员需加强个人防护，避免接触病（死）猪体液，杜绝食用未煮熟猪肉。食品安全、卫生和健康教育对降低人感染风险具有重要意义。

4 结语与展望

本文系统梳理了猪链球菌快速检测与疫病防控相关研究，首先剖析了常规PCR检测设备依赖度高、灵敏度有限、耗时较长等固有短板，进而全面介绍RPA恒温扩增联合CRISPR-Cas12a、G4DNAzyme化学发光的一体化核酸检测体系的完整作用机制，整合现有文献试验数据对比其检测性能，证实该体系可在37 ℃恒温环境下15~30 min完成整套检测，最低检出限可达1 fg，相较于传统终点PCR灵敏度提升1 000倍，十分适配基层现场病原筛查场景。同时，本文汇总了该类新型生物传感技术在畜禽致病菌检测中的应用案例，并整理现阶段猪链球菌主流防控策略与现存痛点。未来将针对该一体化检测平台现存缺陷、可行优化路径以及产业化应用前景展开深入探讨。

4.1 DNAzyme诊断技术面临的挑战

尽管基于DNAzyme的猪链球菌检测技术取得了显著进展，但在实际应用中仍面临多重挑战。靶标稳定性与突变风险是首要问题。Sun等^[12]指出，虽然recN基因可有效区分猪链球菌与重新分类的Streptococcus parasuis（原SS20、22、26型），但针对cps基因簇的检测可能受到菌株序列变异的影响。未发现的序列突变可能影响检测方法的准确性，因此需要扩大样本量并纳入更多田间分离株以确保检测体系的稳健性。此外，猪链球菌血清型多样性强，目前已鉴定29种传统血清型及多个新荚膜基因簇变体，针对新兴变异血清型的DNAzyme筛选体系尚未建立。

当前RPA扩增与CRISPR/Cas12a检测仍需分步进行，存在气溶胶污染风险。虽然通过分区操作和核酸去污染方案可部分缓解该问题，但多步骤操作增加了现场应用的复杂性。

基层适配性与成本控制仍需优化。G4DNAzyme化学发光法虽无需专业设备，但仍依赖温度控制装置完成全程检测。在资源极度匮乏的偏远地区，恒温装置的获取仍是障碍。此外，CRISPR-Cas12a体系试剂成本高于传统PCR，该方法虽大幅降低仪器投入、缩短检测时长，但试剂成本偏高的问题仍制约其大范围落地，后续还需进一步压降成本、提升推广可行性。

4.2 防治体系的局限性

疫苗交叉保护力不足是免疫预防的核心难题。现有灭活疫苗对同源血清型保护效果较好，但对异源血清型交叉保护不足；亚单位疫苗虽纯度高、安全性好，但同样面临血清型交叉保护力弱的问题。尽管Sao蛋白被证明可诱导交叉保护，但其对大多数血清型的保护有效性仍有待系统评估。基因工程疫苗的研发需融合多血清型保守抗原，优化佐剂系统，但这需要大量基础研究与临床试验支撑。

耐药性监测与精准用药体系尚不完善。猪链球菌对四环素等常用抗生素耐药率持续上升，且耐药谱存在显著地域差异。当前基层兽医诊疗中，药敏试验普及率低，经验性用药普遍，加速了耐药性传播。纳米银等新型抗菌策略尚处于实验室研究阶段，距离临床应用仍有距离。

4.3 未来发展方向

多技术融合与智能化升级是诊断技术发展的主旋律。未来应致力于开发集成化微流控芯片，将样本裂解、RPA扩增、CRISPR检测与信号输出整合于单一平台，实现真正的“一键式”检测。结合智能手机图像识别技术，可对G4DNAzyme化学发光结果进行定量分析，提升基层检测的客观性与准确性。此外，基于人工智能的序列分析工具可辅助预测靶标基因突变对检测体系的影响，提前设计包容性更强的crRNA序列。

血清型全覆盖与分型同步化是检测体系完善的重点。当前研究多集中于SS2、SS7、SS9等主要流行血清型，未来需建立覆盖全部29种血清型及新兴变体的DNAzyme库。多重PCR与DNAzyme技术的结合可实现单管反应同步分型，为精准防控提供支撑。同时，应建立开放共享的猪链球菌基因组数据库，实时更新各血清型特征序列，指导检测靶标选择。

新型疫苗与替代疗法研发是实现防治突破的关键。基因工程疫苗应聚焦保守毒力因子与荚膜多糖的融合抗原设计，通过结构生物学手段提升CPS免疫原性。mRNA疫苗技术在猪链球菌病防控中的应用值得探索。在替代疗法方面，需深入解析纳米银、中草药活性成分的抗菌机制，开展体内药效学与安全性评价，为抗生素减量化提供科学依据。

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基金资助

新疆农业职业技术大学校级科研项目(XJNZYKJ202320)