猪丹毒丝菌SpaA重组蛋白制备与表位鉴定

Preparation and epitope identification of recombinant SpaA protein from Erysipelothrix rhusiopathiae

摘要

目的 通过原核表达系统获取猪丹毒丝菌SpaA重组蛋白，进一步发掘该蛋白所含有的B细胞线性表位，为猪丹毒新型表位疫苗的设计及特异性诊断方法的建立提供候选靶标与理论依据。 方法 以猪丹毒丝菌SE38株SpaA N端结构域为研究对象，首先，克隆该菌株的SpaA基因，诱导表达后收集包涵体并进行纯化，获得包涵体形式的SpaA重组蛋白。然后，将24只ICR小鼠（4~6周龄、16~20 g）随机分为2组，每组12只：免疫组（免疫重组SpaA蛋白）、对照组（免疫PBS）。加强免疫10 d后，采用ELISA测定抗体水平并进行攻毒。随后，使用在线软件BepiPred-2.0预测线性B细胞表位，通过化学合成其中一段得分最高的序列所对应的多肽。最后，通过ELISA检测表位多肽与SpaA高免血清之间的反应，分析表位与免疫保护的联系。 结果 本研究制备出猪丹毒丝菌SpaA重组蛋白，发现仅包涵体形式的SpaA重组蛋白可诱导显著的免疫保护效果；发现了SpaA的线性表位₄₁₀SKVEPESPVKVEKPVDEEKPKDQKK₄₃₄，该表位与保护性免疫应答显著相关。 结论 成功制备了猪丹毒丝菌SpaA的重组蛋白，并鉴定到1个与免疫保护高度相关的B细胞表位，该表位具有良好的反应原性，可以用于后续猪丹毒亚单位疫苗的研发。

Abstract

Objectives The recombinant SpaA protein was obtained from Erysipelothrix rhusiopathiae with a prokaryotic expression system and the linear B-cell epitopes contained in this protein was further identified to provide candidate targets and a theoretical basis for the design of novel epitope vaccines and the establishment of specific diagnostic methods against swine erysipelas. Methods The N-terminal domain of SpaA from E. rhusiopathiae strain SE38 was used to clone the SpaA gene of this strain. The inclusion bodies were collected and purified after induced expression to obtain the recombinant SpaA protein in the form of inclusion bodies. 24 ICR mice aged 4-6 weeks with a weight of 16-20 g were randomly divided into two groups including the immunized group immunized with the recombinant SpaA protein and the control group immunized with PBS, 12 in each group. The level of antibody was determined with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 10 days after the booster immunization and a challenge test was conducted. Online software BepiPred-2.0 was used to predict linear B-cell epitopes, and the polypeptide corresponding to the sequence with the highest score was chemically synthesized. The reaction between the epitope polypeptide and SpaA hyperimmune serum was detected with ELISA, and the association between the epitope and immune protection was analyzed. Results The recombinant SpaA protein from E. rhusiopathiae was successfully prepared. The recombinant SpaA protein only in the form of inclusion body induced significant immune protective effects. A linear epitope of SpaA,₄₁₀SKVEPESPVKVEKPVDEEKPKDQKK₄₃₄, was identified, which was significantly associated with protective immune responses. Conclusions The recombinant SpaA protein of swine erysipelas was successfully prepared from E.rhusiopathiae, and a B-cell epitope highly correlated with immune protection was identified. This epitope has excellent reactivity and can be used for the subsequent development of epitope peptide vaccines against swine erysipelas.

Graphical abstract

关键词

猪丹毒丝菌 / SpaA / 重组蛋白 / 表位 / 免疫保护 / 血清学检测

Key words

Erysipelothrix rhusiopathiae / SpaA / recombinant protein / epitope / immune protection / serological testing

猪丹毒（swine erysipelas）是由猪丹毒丝菌（Erysipelothrix rhusiopathiae，也称红斑丹毒丝菌或猪丹毒杆菌）引起的细菌性传染病，该病对世界范围内的生猪养殖构成较大威胁。在我国20世纪中后期，猪丹毒与猪瘟、猪肺疫曾被称为生猪养殖业的“三大疫病”。

近年来，随着疫苗接种、生物安全措施和饲养管理的逐步加强，急性暴发和大规模死亡的情况已明显减少，但是猪丹毒丝菌的检出频率依然位居细菌性疾病前列，是当前猪群健康管理中不可忽视的主要病原之一^[1-2]。我国政府已经将猪丹毒列为三类动物疫病^[3]。此外，猪丹毒丝菌还可以通过皮肤破损或黏膜接触导致人类发生类丹毒，是公共卫生和职业安全的重要隐患^[4-5]。

基因工程疫苗具有较高的安全性、抗原的稳定性，并且具备区分免疫与感染动物的显著优势，逐渐成为兽用疫苗研发的重要方向^[6]。基因工程疫苗的有效性高度依赖于保护性抗原的筛选与鉴定，目前已鉴定出包括SpaA、CbpB以及GAPDH在内的多种保护性抗原^[7]，其中SpaA是最重要的保护性抗原。SpaA蛋白主要依靠其C末端结构域锚定到细胞壁上，该区域具备GW基序，能与猪丹毒丝菌细胞壁中胆碱成分结合实现锚定^[8]。SpaA的N端结构域是其主要功能区域。先前研究表明，SpaA蛋白可以参与猪丹毒丝菌与猪源内皮细胞的黏附过程，SpaA蛋白的N端结构域可能发挥一定作用^[9]。

与可溶性重组蛋白相比，包涵体形式的重组蛋白具有表达量高、易于分离纯化、成本低廉且对蛋白酶具有较高抗性的优势，但在构象完整性上存在不足，通常需要额外的变性－复性步骤^[10]。当前已有研究显示，包涵体形式的保护性抗原可直接作为颗粒状抗原使用，通过促进树突细胞成熟和针对线性B细胞表位的T细胞应答，引发显著的保护性免疫^[11]。在兽医领域，如猪源大肠杆菌疫苗研究中，包涵体免疫组对新生仔猪腹泻相关病原的攻毒保护率可达90%~95%，与传统灭活疫苗相当^[12]。

以往的免疫保护研究主要集中在SpaA可溶性重组蛋白上，针对SpaA重组蛋白包涵体形式的免疫保护研究仍较少。病原菌保护性抗原蛋白的包涵体刺激机体产生保护性免疫应答，即线性B细胞表位可能引发免疫保护^[13]。伴随生物信息学持续发展，特别是人工智能的进步^[14]，表位预测已经成为发掘表位的重要手段。近年来，在线软件BepiPred-2.0对线性B细胞表位的预测准确性较高，已被广泛应用^[15-16]。当前，SpaA已经被用于多种基因工程疫苗的研究，但是过去的研究多关注SpaA全长蛋白和构象完整的蛋白形式，对于N端结构域蛋白及SpaA线性表位关注较少。本研究以SpaA的N端结构域为对象，制备包涵体形式的重组蛋白，评估其免疫保护效力，并鉴定出1个与保护性免疫高度相关的线性B细胞表位，旨在为猪丹毒丝菌基因工程疫苗设计及免疫效果评估提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种及实验动物

本研究使用的主要菌株、质粒及动物信息见表1。

1.2 生物材料及主要试剂

本研究所涉及的试验试剂来源如下：

1）培养基类。试验中使用的LB、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）及其基因工程大肠杆菌自诱导培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司。

2）酶学与克隆试剂。限制性内切酶购自TaKaRa公司，PCR扩增所需的酶类源自北京全式金生物科技有限公司，用于构建质粒的同源重组克隆试剂盒则由南京诺唯赞生物科技提供。

3）血清与生化试剂。试验用新生牛血清来自平睿生物科技（北京）有限公司；蛋白质定量浓度检测使用BCA法测定蛋白浓度（北京索莱宝公司的BCA法浓度测定试剂盒）；Ni-charged MagBeads（南京金斯瑞生物科技有限公司）。此外，小鼠免疫过程中使用的弗氏完全与不完全佐剂均采购自Sigma公司。

4）酶标抗体。本研究中酶联免疫吸附试验使用的二抗（HRP标记山羊抗鼠IgG）由北京索莱宝生物科技有限公司供应。

1.3 猪丹毒丝菌SpaA基因的克隆

根据NCBI网站公布的猪丹毒丝菌SE38菌株的全基因组序列（NZ_CP011861.1），设计猪丹毒丝菌SpaA的克隆引物，引物序列（小写字母为同源臂）：F，5′gccatggctgatatcggatccGATTCGACAGATATTTCTGTG3′；R，5′gcaagcttgtcgacggagctcATTATCTTTCTTAATCCACCC3′，扩增片段大小为1 275 bp，退火温度51 ℃；委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成合成。

将丹毒丝菌SE38菌株接种到含有10%新生牛血清的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基中，置于摇床在37 ℃、200 r/min环境下振荡培养。培养菌群进入对数生长期后离心收集，并通过细菌基因组DNA提取试剂盒获取丹毒丝菌基因模板DNA。随后，利用PCR技术扩增得到SpaA基因片段。将PCR产物与经过双酶切处理的pET-32a（+）质粒混合，严格参照同源重组试剂盒的说明书操作规程完成连接过程，构建重组表达载体，所得产物转化到BL21（DE3）感受态细胞中。通过菌落PCR筛选阳性克隆，并将初步鉴定正确的质粒送至生工生物进行序列测定，以验证目的片段插入的准确性与读码框的完整性。

1.4 目的蛋白的表达与纯度测定

挑取重组大肠杆菌工程菌单菌落，加入10 mL基因工程大肠杆菌自诱导培养基中，37 ℃、200 r/min下过夜摇菌，诱导基因工程大肠杆菌表达目的蛋白。离心收集菌体，用超声波破碎裂解菌体并离心保留上清收集包涵体，将包涵体彻底洗涤后使用8 mol/L尿素溶解包涵体，获得包涵体形式的重组蛋白，将获得的包涵体使用Ni-charged MagBeads提取获得纯化后的SpaA重组蛋白包涵体，进行SDS-PAGE并采用考马斯亮蓝染色来检测表达效果，同时通过BCA法测定纯化后的蛋白浓度。

1.5 小鼠免疫与血清抗体检测

取24只小鼠，随机分成2组，每组12只。试验组免疫猪丹毒丝菌SpaA包涵体形式重组蛋白：100 μg/只重组蛋白（经8 mol/L尿素溶解的包涵体）用等体积的弗氏完全佐剂乳化后，经腹腔注射免疫小鼠。二次免疫于初免后第28天启动。试验组的免疫佐剂变更为弗氏不完全佐剂，其余试验参数参照初免设定。对照组则以PBS替代靶向抗原，并遵循相同的佐剂添加原则。在末次加强免疫结束后的第10天，对所有试验动物行尾静脉取样以制备血清样本，随后定量检测血清中诱导产生的抗体效价。

试验采用变性溶解（8 mol/L尿素）后的重组SpaA蛋白包涵体进行抗原包被。具体操作：将蛋白稀释至0.1 μg/孔，并于37 ℃条件下吸附2 h。利用PBST缓冲液执行3次洗涤程序，随后引入5%脱脂奶粉在37 ℃恒温环境下封闭1 h。将待测小鼠血清按1∶200比例稀释后，与包被抗原在37 ℃下共孵育1 h。洗涤去除非特异性结合物后，加入HRP标记的羊抗鼠二抗反应30 min。显色阶段采用TMB单组分显色液（100 μL/孔），遮光反应10 min后，滴加50 μL 2 mol/L硫酸终止生化反应。最终通过酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光值（OD值）。

1.6 攻毒试验

通过ELISA检测各组小鼠特异性抗体产生水平，待确认各组小鼠产生高水平抗体后进行攻毒试验，以评价免疫保护效果^[1]。选取处于对数生长末期的猪丹毒丝菌SE38菌株，按100 CFU（约1×MLD）/只的剂量对小鼠进行皮下注射攻毒。各试验组小鼠在攻毒后的7 d内，每日观察并记录小鼠的临床发病情况与死亡数量。

1.7 猪丹毒丝菌SpaA表位预测

使用在线软件BepiPred-2.0（http://www.detaibio.com/tools/epitope-prediction-vr.html）评估猪丹毒丝菌SpaA N端结构域中各个氨基酸残基的表位潜能。试验设定软件预设值0.5作为判定界限，凡是得分超出该标准且呈现出较长连续分布的肽链片段，均被初步鉴定为SpaA的候选线性B细胞表位。

1.8 表位多肽的化学合成

在确认BepiPred-2.0预测的线性表位序列后，采用固相肽合成法（SPPS）于金斯瑞公司进行人工合成。该工艺流程涉及氨基酸在树脂上的逐级偶联、脱保护反应以及最终的树脂切割。合成后的粗品经高效液相色谱（HPLC）纯化。通过对各组分进行分子量测定和纯度扫描，最终分离并确认目标序列的多肽。

1.9 多肽ELISA检测

使用间接ELISA验证预测表位多肽与SpaA免疫血清的反应性，方法与本文“1.5血清抗体检测”相同，抗原包被量为10 μg多肽/孔。

1.10 数据处理与统计

试验数据以“平均值±标准差（mean ± SD）”表示，采用Student’s t检验比较免疫组与对照组之间的数据差异，以“P＜0.05”为差异显著，“P＜0.01”为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 猪丹毒丝菌SpaA重组蛋白的制备

通过对目的基因的克隆与转化，成功获得具备稳定表达能力的猪丹毒丝菌SpaA重组原核表达体系。经PCR扩增、克隆及Sanger测序验证，成功将猪丹毒丝菌SpaA的N端结构域基因连接至表达载体。诱导表达后收集包涵体（8 mol/L尿素溶解），获得分子质量约为60 ku的SpaA重组蛋白（图1）。

2.2 SpaA包涵体的免疫原性与免疫保护效力

ELISA检测结果（图2）显示，加强免疫10 d后免疫组产生了极显著高水平的特异性抗体（P＜0.01）。结果表明，SpaA的N端结构域包涵体具有优良的免疫原性，能够有效刺激动物机体产生抗体。

在攻毒试验中，PBS对照组小鼠在感染后全部发病，并于感染后5 d内全部死亡，存活率为0%（0/12）。

相比之下，SpaA免疫组小鼠表现出较好的免疫保护效果，在攻毒后仍有部分小鼠存活，至观察终点存活率为50%（6/12）（图3）。结果表明，包涵体形式的重组蛋白SpaA免疫能够为动物赋予显著的免疫保护效力。

2.3 SpaA线性B细胞表位预测结果

通过研究选取猪丹毒丝菌SE38株的SpaA为靶序列开展表位预测，所得该蛋白分子的线性B细胞表位分布状况详见图4。多个氨基酸残基得分高于默认阈值0.5，其中连续序列最长且得分较高的一段（氨基酸残基400~454）可能包含线性表位。选择最中间的第410至434位氨基酸残基序列（SKVEPESPVKVEKPVDEEKPKDQKK），命名为SpaAepitope1，作为候选表位序列进行后续验证。

2.4 表位对应多肽与猪丹毒丝菌SpaA高免血清的反应

通过体外化学合成手段，将预测得到的SpaA关键B细胞表位序列成功转化为实物多肽，用于下游试验。多肽ELISA检测结果（图5）显示，SpaA免疫组存活小鼠体内产生了高水平的靶向SpaAepitope1的抗体（P＜0.01），而SpaA免疫组和PBS免疫组死亡小鼠体内则未产生明显的靶向该表位的抗体。结果表明，SpaAepitope1是猪丹毒丝菌SpaA的1个新的表位，而且与免疫保护高度相关。

3 讨 论

猪丹毒丝菌可以感染多种动物，也给人类带来感染风险，是兽医领域重要的病原菌。本研究以猪丹毒丝菌SE38株SpaA蛋白N端结构域为研究对象，通过原核表达系统制备包涵体形式的重组SpaA蛋白，并进一步评价其免疫原性和攻毒保护效果。在此基础上，结合BepiPred-2.0线性B细胞表位预测、多肽合成及ELISA验证，鉴定到1个与免疫保护高度相关的SpaA线性B细胞表位。

与传统观点认为的包涵体蛋白需要经过复性后才可恢复免疫活性不同，近年来，越来越多的研究^[10-12]发现，部分包涵体蛋白本身即可保留一定天然结构特征，并能够作为颗粒化抗原被机体有效识别。包涵体颗粒具有尺寸适宜、稳定性较高及缓释效应明显等特点，能够增强抗原递呈效率并促进树突状细胞活化，从而诱导较强的体液免疫和细胞免疫应答^[11,17]。此外，包涵体形式的重组蛋白在工业化生产过程中具有表达量高、纯化流程简化及生产成本较低等优势，更适合大规模兽用疫苗制备^[10,12]。因此，本研究中SpaA包涵体能够产生明显免疫保护作用，也提示包涵体形式可能成为猪丹毒新型基因工程疫苗研发的重要方向。

本研究显示，SpaA的N端区域能在大肠杆菌工程菌中成功表达。重组蛋白包涵体形式可诱导免疫动物产生高水平的保护性免疫应答，这一结果提示线性表位在SpaA引发保护性免疫应答中发挥重要作用。有研究^[18]将巴氏杆菌保护性抗原的片段展示到兔瘟病毒样颗粒上，从而获得了能对2种病原同时产生免疫保护力的新型联合疫苗。可以借鉴该思路，将SpaA蛋白质片段展示到猪的其他病原表面获得新型联合疫苗。

针对猪丹毒丝菌SpaA线性表位的筛选，本研究采用了预测准确率较高的BepiPred-2.0在线工具。根据软件算法原理^[19]，认为评分高且连续的氨基酸序列是表位的几率较大。结合多肽合成技术特点，选择了1段包含25个氨基酸残基的SpaA序列（SpaAepitope1）作为候选表位。随后的血清学验证结果显示，合成的表位肽能与特异性高免血清发生有效结合。这一结果不仅证实了该位点的抗原性，也证实了BepiPred-2.0在猪丹毒抗原研究中的应用价值。本研究中尚有多个连续的高分区域（图4）未被研究，未来有必要对这些区域进行研究，以期获得更全面的SpaA表位分布图谱。

血清学检测结果显示，SpaAepitope1抗体与免疫保护高度相关，SpaA免疫组存活小鼠体内可以检测到高水平的该表位特异性抗体，但死亡小鼠体内没有检测到明显的该表位特异性抗体。结果表明，可以将该表位开发成免疫效力检测方法用于替代动物试验^[20]。但是这并不意味着SpaA的保护力就是由该表位引发，之前的研究已经表明保护力相关的表位单独使用时并不会产生免疫保护^[13]。因此，关于该抗原位点在新型疫苗研发中的实际应用潜能，仍需开展更为系统的评估工作。

综上所述，本研究成功制备了猪丹毒丝菌SpaA蛋白N端结构域的重组包涵体蛋白，证实了其具有良好的免疫原性与免疫保护效力，并鉴定出1个与免疫保护高度相关的全新线性B细胞表位。随着精准疫苗设计理念的发展，保护性表位在兽医生物制品研发中的应用价值正受到越来越多的关注。与传统全菌灭活疫苗相比，表位疫苗具有安全性高、成分明确及便于多价组合等优势。未来可进一步围绕SpaAepitope1开展多表位组合、载体递送及免疫增强等方面研究，并探索其在竞争ELISA、阻断ELISA等新型血清学检测技术中的应用潜力，为猪丹毒疫苗免疫效果评价及自然感染监测提供新的技术手段。

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基金资助

河北省自然科学基金面上项目(C2025204092)

河北农业大学人才引进专项(YJ2022011)

河北省现代农业产业技术体系建设专项(HBCT2024230201)