健康鲫肠道菌群结构及转录组特征分析

Bacterial community structure and transcriptomic characteristics of the intestine in healthy crucian carp (Carassius auratus)

摘要

目的 分析健康鲫肠道基因表达谱及菌群结构特征，为深入解析鲫肠道稳态及抗病免疫机制提供参考依据。 方法 从平均体重100±5 g、体长15±2 cm的健康鲫中随机选取9尾，麻醉后无菌解剖，分离肠道组织并均匀混合，所得混合样品采用Illumina NovaSeq、16S rRNA高通量测序技术，对其肠道菌群结构与转录组进行分析。 结果 鲫肠道菌群以变形菌门（Proteobacteria）、鲸杆菌属（Cetobacterium）为优势菌群，α多样性和β多样性分析表明菌群丰富度、均匀度较高（Simpson＞0.97）。转录组方面，共获得62 547个基因转录本；GO功能富集分析显示，高表达基因主要涉及基因翻译、先天免疫、铁离子转运等生物学过程；KEGG富集分析显示，高表达基因主要集中在能量代谢、蛋白加工（折叠、分选与降解）及细胞生长、死亡等基础代谢通路，同时也富集于TLRs、NLRs、NF-κB等免疫相关信号通路。 结论 健康鲫以变形菌门、鲸杆菌属构成肠道优势菌群；肠道基因主要参与能量、蛋白代谢及免疫防御等生物学功能，并富集于TLRs、NLRs、NF-κB等先天免疫信号通路，进而调控鲫生长与抗病、免疫机制。

Abstract

Objectives The expression profiles of intestinal genes and the structure of intestinal microbiota in healthy crucian carp (Carassius auratus) were analyzed to provide a reference for the in-depth elucidation of intestinal homeostasis and the immune mechanisms underlying the resistance to diseases in crucian carp. Methods From a population of healthy crucian carp (mean weight 100±5 g, body length 15±2 cm), 9 individuals were randomly selected. Intestinal tissues were pooled and homogenized after anesthesia and sterile dissection. The mixed samples were used for Illumina NovaSeq platform and 16S rRNA high-throughput sequencing to analyze the intestinal microbiota structure and transcriptome. Results The intestinal microbiota of crucian carp was dominated by Proteobacteria and Cetobacterium. The results of analyzing alpha (α) diversity and beta (β) diversity showed that the richness and evenness of the microbiota were high, with Simpson index higher than 0.97. A total of 62 547 genes transcripts were obtained. The results of analyzing the Gene Ontology (GO) enrichment showed that highly expressed genes were mainly involved in biological processes including gene translation, innate immunity and the transport of iron ions. The results of analyzing the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment showed that these genes were predominantly enriched in energy metabolism, protein processing (folding, sorting and degradation), cell growth and death, as well as immune-related signaling pathways such as TLRs, NLRs and NF-κB. Conclusions Proteobacteria and Cetobacterium serve as the dominant intestinal microbiota in healthy crucian carp. Intestinal genes are mainly involved in biological functions including energy metabolism, protein metabolism, and immune defense, and are enriched in innate immune signaling pathways including TLRs, NLRs, NF-κB, which regulate the growth, disease resistance and immune mechanisms in crucian carp.

Graphical abstract

关键词

鲫 / 肠道菌群 / 转录组 / 先天免疫 / 肠道稳态 / 高通量测序

Key words

crucian carp (Carassius auratus) / intestinal microbiota / transcriptome / innate immunity / intestinal homeostasis / high-throughput sequencing

鲫（Carassius auratus）是我国淡水养殖主导品种之一。肠道作为营养消化吸收与黏膜免疫的重要器官，其健康状态直接决定机体的抗病力与生长性能。鱼类肠道菌群结构与免疫基因表达是维持肠道健康的关键因素^[1]。Cai等^[2]研究揭示了鲫肠道菌群与基因表达相关，证实肠道免疫与营养代谢基因存在高表达特征，且变形菌门、厚壁菌门为肠道优势菌群。另有研究表明，鲫肠道菌群与宿主的免疫调控、营养代谢及消化酶活性密切相关，益生素可通过调节鲫肠道菌群组成，改善机体抗氧化、生长与消化性能^[3-5]。

近年来，多组学测序技术揭示了多种鱼类组织的生理病理功能及其分子机制^[6-8]。如Huang等^[6]结合转录组与代谢组技术，揭示了鲫肝脏对高脂摄食的响应机制；此外，有研究通过转录组技术解析鲫肤色变化、卵巢发育的分子机制^[7-8]。然而，针对健康鲫肠道转录组与菌群组成的系统分析及其分子免疫机制，目前尚不明确。基于此，本研究系统解析鲫肠道基因表达谱及菌群结构，以期为鱼类健康养殖与抗病免疫提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲫购自天津市某水产养殖公司，平均体重100±5 g、体长15±2 cm，行动活泼，摄食正常，体表光洁，无充血、溃烂、出血等临床症状，无寄生虫感染；经暂养观察无发病或死亡现象，用于后续试验。

试验前，将鲫置于45 L的充气淡水箱中，在25±2 ℃条件下驯化7 d。驯化期间，每日定时投喂商业配合饲料2次，日投喂量为鱼体体重的3%；光照周期设定为12 L∶12 D；水质保持良好，溶解氧含量≥6 mg/L，氨氮含量＜0.1 mg/L。

1.2 样品采集与处理

驯化结束后，随机选取健康鲫共9尾（n=9），麻醉后无菌解剖，分离肠道组织。每3尾鲫的肠道组织均匀混合为1个样品，共计3个样品（CMC1、CMC2、CMC3），经液氮速冻后，置于-80 ℃条件下保存，送由百迈客生物有限公司进行转录组测序和肠道菌群16S rRNA测序。

1.3 肠道菌群16S rRNA测序分析

采用Omega E.Z.N.A.^® DNA Kit（美国Omega Bio-tek公司），参照说明书提取肠道内容物DNA，并以其为模板，扩增16S rRNA基因V3~V4区。随后采用Illumina MiSeq Reagent Kit v3构建文库，并于Illumina MiSeq平台进行测序。测序所得下机数据经质控、拼接、OTU聚类后进行物种注释，分析群落组成及菌群多样性^[9-10]。

1.4 转录组测序与数据分析

采用Illumina TruSeq™ RNA Sample Preparation Kit（美国Illumina公司），参照说明书构建cDNA文库，并于Illumina NovaSeq 6000平台进行双端测序（PE150）。原始数据经质控过滤后获得清洁数据（clean data），随后使用StringTie软件重构转录组并完成基因组装，获得高质量unigene序列。将序列与NR、GO、KEGG等数据库进行比对（E-value≤1e-5），在测序云平台完成功能注释及富集分析^[11-12]。

2 结果与分析

2.1 鲫肠道菌群结构与多样性分析

1）菌群组成。健康鲫肠道菌群门、属水平组成见图1。门水平上，变形菌门（Proteobacteria，29.00%）为优势菌门，其余主要菌门按丰度依次为厚壁菌门（Firmicutes，12.50%）、梭杆菌门（Fusobacteria，12.28%）、放线菌门（Actinobacteriota，11.24%）、拟杆菌门（Bacteroidota，5.56%）和酸杆菌门（Acidobacteriota，5.21%）等。属水平上，鲸杆菌属（Cetobacterium，13.92%）为优势菌属，其余主要菌属依次为气单胞菌属（Aeromonas，5.19%）、戴尔福特菌属（Delftia，3.09%）、鼠杆状菌科下未分类属（unclassified_Muribaculaceae，1.60%）等。

2）Alpha（α）多样性。Coverage指数均达0.999以上，测序深度充足；ACE指数（2 573.504~2 695.125）和Chao1指数（2 566.153~2 689.102）显示菌群丰富度高且稳定；Simpson指数＞0.97、Shannon指数为8.813~9.078，表明菌群分布均匀、多样性高，初步显示鲫肠道微生态良好。

3）Beta（β）多样性。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）结果显示，CMC1、CMC2、CMC3间菌群差异不显著；第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分别解释总变异的51.33%和48.67%，累计解释率达100%。3个样品间Bray-Curtis距离为0.527~0.540，平均距离为0.533±0.006，表明健康鲫个体间肠道菌群结构存在轻微波动，可能与摄食节律、遗传背景差异相关。但结合α多样性结果，表明各样本菌群均具有高丰富度和均匀度，肠道微生态整体维持稳态。

2.2 鲫肠道高表达基因与信号通路富集分析

1）转录组测序分析。共获得59.60 Gb清洁数据，Q₃₀≥95%，GC含量为45.71%~47.19%。进一步将测序数据与金鱼基因组20对染色体进行比对分析，覆盖度结果显示测序数据质量高、组装效果好，可用于后续基因表达及富集分析。通过StringTie软件组装，共获得62 547个基因转录本。

2）基因本体论（GO）功能富集分析。对鲫肠道表达基因进行GO富集分析，按生物学过程、细胞组分和分子功能3大类划分（图2）。生物学过程中，基因翻译富集程度最高，先天免疫、炎症反应及铁稳态、铁转运显著富集；细胞组分中，核糖体（蛋白质合成）、线粒体（能量代谢）、胞外及细胞骨架等相关组分富集；分子功能中，RNA结合、DNA结合及亚铁离子结合及营养物质转运体结合条目富集，同时还涉及趋化因子活性、氧化还原酶活性及结构分子活性等相关功能富集。

3）京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析。鲫肠道转录高表达基因分为6大功能类别（图3）。在细胞过程类别中，注释高表达基因最多，其中发现181个转运与分解代谢相关的高表达基因，144个细胞生长、死亡相关基因。代谢方面，主要富集于能量代谢、全局与概览图谱（涉及多条基础代谢通路）等；遗传信息处理方面，蛋白折叠、分选与降解通路占优势；有机体系统类别中，发现67个基因主要参与免疫系统，包括Toll样受体（TLRs）、NOD样受体（NLRs）和NF-κB等信号通路，这可能与肠道黏膜免疫应答有关。

3 讨 论

本研究基于健康鲫肠道内容物16S rRNA测序，结果显示肠道菌群在门、属水平组成稳定，其中变形菌门、鲸杆菌属分别为门、属水平的优势菌群；α与β多样性结果表明，菌群丰富度高、分布均匀，多样性良好，且样本间菌群差异不显著，提示健康鲫肠道微生态处于稳定状态。陈鹏等^[11]通过16S rRNA基因测序，分析异育银鲫肠道微生物多样性，发现其肠道菌群组成稳定，且厚壁菌门和变形菌门优势特征明显，这与本研究中健康鲫肠道菌群的组成及高稳定性特征基本一致。功能上，刘波等^[3]研究表明，肠道菌群可参与鱼类营养代谢，其中变形菌门主要参与碳氮代谢及黏膜免疫调控，可为宿主提供营养代谢支持并增强黏膜免疫功能；Wang等^[10]报道鲸杆菌属可参与能量代谢调控，为宿主补充营养、促进生长发育。此外，已有研究表明病原感染会导致鱼类肠道菌群α多样性降低^[13]，本研究α多样性结果显示试验鲫肠道菌群分布均匀、多样性高，进一步证实了试验所用鲫肠道微生态处于健康状态，可为后续研究鲫健康与病理状态下肠道菌群的差异提供基础数据。

本研究对鲫肠道组织进行转录组测序分析，共获得6万多个基因转录本，且与金鱼（鲫）参考基因组染色体具有较高的比对覆盖度，证明测序结果的准确性较高，能够准确反映健康鲫肠道基因的表达特征，不仅可为筛选肠道免疫、营养代谢相关功能基因奠定基础，也为深入解析肠道基因表达与肠道功能提供了可靠保障。GO功能富集分析显示，健康鲫肠道基因在生物学过程中“翻译”富集程度最高，表明肠道细胞处于活跃的蛋白质合成状态，此为肠道黏膜修复、免疫分子产生及营养代谢酶合成的基础；同时，先天免疫、炎症反应及铁稳态、铁转运等条目显著富集，并涉及趋化因子活性、氧化还原酶活性、结构分子活性等功能，说明健康鲫肠道维持着基础的免疫相关功能和结构稳定性，且提示铁代谢可能在调节免疫功能与能量代谢平衡中发挥潜在作用。KEGG富集结果进一步揭示，细胞过程相关通路中富集的基因数最多；此外，能量代谢及基础代谢通路富集，提示肠道能量代谢较为活跃，可为肠道生理活动与免疫应答提供能量支撑。值得注意的是，TLRs、NLRs和NF-κB等免疫相关信号通路富集，这与Lei等^[13]在地衣芽孢杆菌对嗜水气单胞菌感染鲫的免疫保护研究，以及Zhang等^[14]在疱疹病毒感染鲫的免疫应答研究中报道的通路特征一致。由此可见，这些免疫通路在鱼类肠道黏膜免疫应答中发挥重要作用，其富集状态表明健康鲫肠道黏膜免疫系统发育完善，能够通过激活相关免疫通路，启动免疫应答，维持肠道健康。

综上，鱼类肠道组织作为物理屏障，既为基因表达提供稳定环境，也为菌群提供定植场所，且与转录组中免疫功能相关基因的高表达协同作用^[2,10]。已有研究证实，鱼类肠道转录组中蛋白质合成、先天免疫、营养代谢的相关基因及免疫通路富集，可为肠道功能稳定和菌群组成调控提供分子保障^[2,4,11]。

本研究不仅为解析鲫肠道健康维持机制提供了基础数据，而且为鱼类健康养殖、疾病防控及微生态制剂研发提供参考依据。

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基金资助

天津市大学生创新训练计划项目(202510061207)

津甘双地科技特派员项目(24CXNA078)