基于微生态调控的植物性抑菌养发液的制备及功效评价

Preparation and efficacy evaluation of plant antibacterial hair⁃ nourishing liquids based on microecological regulation

摘要

各类头皮健康问题严重困扰着人们的日常生活，目前市售的头皮护理产品常针对某种单一症状添加药物进行治疗，无法较为全面地改善头皮健康问题伴随的多种症状。此外，头皮上富含多种微生物种群，长时间使用头皮护理产品还会引起头皮表面的微生态失调，导致病症反复发作。为此，提出重构头皮微生态的配方设计思路，以多种天然提取物为主要活性成分制备了植物性抑菌养发液，并较为全面地考察了其养发护发功效。结果显示，在抑菌组分含量为2 mg/mL时，养发液对糠秕马拉色菌的抑制作用较强（抑菌率94.6%），对痤疮丙酸杆菌的抑制作用相对较弱（抑菌率83.1%），对表皮葡萄球菌具有一定的抑制作用（抑菌率82.7%），表明所制备的养发液具有调控头皮微生态的作用。受试者使用养发液7周后，去屑率可达94.2%；使用养发液1个月后，油脂分泌异常症状有所好转，头皮红肿程度减轻，发丝直径明显增大，脱发程度亦有所减轻。

Abstract

Many kinds of scalp health problems seriously trouble people’s daily life. At present， commercially available scalp care products often have specific drugs added to treat a single symptom and cannot comprehensively improve the various symptoms associated with scalp health problems.In addition， the scalp has a rich microbial population， and long-term use of scalp care products can cause microecological disorders on the scalp surface， leading to repeated disease episodes.In view of this， a formulation designed to reconstruct the scalp microecology was proposed. Plant antibacterial hair-nourishing liquids with various natural extracts as the main active components were prepared， and their hair care effects were investigated.The results showed that when the antibacterial component content was 2 mg/mL， the hair-nourishing liquids had a strong inhibitory effect on Malassezia furfur （inhibition rate of 94.6%）， a relatively weak inhibitory effect on Cutibacterium acnes （inhibition rate of 83.1%）， and a certain inhibitory effect on Staphylococcus epidermidis （inhibition rate of 82.7%）， indicating that the prepared hair-nourishing liquids had the effect of regulating scalp microecology.After 7 weeks of using the hair-nourishing liquids， the dandruff removal rate of the subjects could reach 94.2%. After 1 month of using the hair-nourishing liquids， the symptoms of abnormal oil secretion were improved， the degree of scalp redness and swelling was reduced， the hair diameter was significantly increased， and the degree of hair loss was also reduced.

Graphical abstract

关键词

头皮微生态 / 养发液 / 天然提取物 / 功效评价

Key words

scalp microecology / hair-nourishing liquid / natural extract / efficacy evaluation

引　言

随着人们生活及饮食习惯的改变，越来越多的人群受到各种头皮健康问题（如头皮屑增多、头皮油腻、脱发等）的困扰^［1］。目前市售的头皮护理产品有很多种，其功能单一，仅添加针对某一类特定头皮问题的药物成分，例如使用酮康唑、奥麦丁锌（ZPT）等化学药物治疗糠秕马拉色菌（Malassezia furfur）增殖引起的头皮屑增多^［2］。虽然这些成分可以在一定程度上缓解头皮健康问题，但其只对某一类头皮健康问题具有治疗效果，无法较为全面地改善头皮健康问题伴随的多种症状，此外这些头皮护理产品还存在过度清洗导致的皮肤屏障损坏、有害菌群耐药等隐患。

人体头皮上约有密度为10³~10⁵ CFU/mm²的微生物，它们主要存在于头皮表面以及毛囊、皮脂腺等皮肤附属器内^［3］，这些微生物与宿主组成的复杂生态系统称为头皮微生态（scalp microecology）。得益于测序技术的发展，人们获悉人体头皮上常驻的细菌属为丙酸杆菌属（痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes）占比>99%）和葡萄球菌属（表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）占比>99%），常驻的真菌为马拉色菌，真菌与细菌等微生物共同定植于人体皮肤表面^［4］。糠秕马拉色菌可促进表皮葡萄球菌的增殖和生物膜的形成，同时糠秕马拉色菌具有脲酶活性，可以通过分解尿素产氨的方式升高生长环境pH以促进表皮葡萄球菌的生长^［5］。表皮葡萄球菌可以介导甘油发酵并形成抑制区，以抑制痤疮丙酸杆菌的过度繁殖。同时，痤疮丙酸杆菌能够分泌细菌素抑制葡萄球菌的生长^［4］。因此，在健康状态下，各种微生物以特殊的机制维持相对稳定的菌群数量，它们和谐共存以保障头表皮健康。研究发现，与头皮健康的人群相比，头皮不健康的人群如头皮屑人群，其头皮上的马拉色菌和表皮葡萄球菌比例较高，痤疮丙酸杆菌的比例较低^［6］。这说明发屑增多并非某种微生物增加或减少单独作用的结果，而是菌群之间相互作用导致微生态失衡引起的。目前市售的单一抑制引发发屑增多的致病菌马拉色菌的产品难以有效重构头皮的微生态平衡，因此无法达到根本治疗的目的。此外，当头皮的脂质分泌过剩时，脂质会渗透到角质层，破坏头皮角质层结构，头皮表面的抗菌肽分泌随之发生改变。同时，脂质为马拉色菌提供大量的营养物质，使马拉色菌数量过多，引起头皮微生态失调，而大量的马拉色菌又将脂质分解成脂肪酸，脂肪酸渗透进入角质层破坏头皮屏障，造成头皮屏障、头皮微生态和皮脂代谢三者进入恶性循环^［7］，随之引发的头皮微生态紊乱会导致脂溢性皮炎、头发脱落等问题^［8］。因此，头皮微生态的重构可能是长期解决诸如发屑增多、头皮油腻、脱发等头皮健康问题较为全面且根本的解决方案。

相较于化工合成药物可能导致的皮肤干燥、部分人群过敏、人体代谢缓慢等问题（如ZPT等已被欧盟禁用），天然植物提取物的刺激性较低，并且对多种头皮健康问题都存在一定的治疗效果，因此广泛用于养发护发产品中^［9］。基于以上分析，本研究提出重构头皮微生态的配方设计理念，采用多种天然提取物为主要成分制备了植物性抑菌养发液，并验证了其养发护发功效，研究结果可为各类养发功效性配方设计提供新的思路。

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 试剂

氯化钠，分析纯，北京化工厂；氯化血红素、维生素K1，生物试剂，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；Resazurin，纯度≥90%，Solarbio公司；聚乙二醇2000（PEG2000），纯度≥99%，德国巴斯夫（BASF）公司。

1.1.2 菌种

糠秕马拉色菌 菌种编号ATCC 44344，购自广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）。菌落直径1~2 mm，圆形，边缘整齐，不透明，正面白色，反面金黄色，中间凸起，表面粗糙，质地湿润。

表皮葡萄球菌 本实验室保存。菌落直径1~2 mm，圆形，不透明，一般产生白色或柠檬色色素，故菌落呈现白色或柠檬色，在普通琼脂平板上形成凸起，质地光滑。

痤疮丙酸杆菌 本实验室保存。菌落直径0.2~0.5 mm，圆形，不透明，白色或灰白色，菌落表面有凸起且光滑。

1.1.3 培养基

DIXON培养基 蛋白胨5.0 g，酵母提取物3.0 g，麦芽提取物3.0 g，葡萄糖10.0 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH值至6.0±0.2 （固体培养基加琼脂20.0 g）。将液体培养基分装为50 mL/瓶，再加入橄榄油2.0 g，于121 ℃高压灭菌20 min，用于糠秕马拉色菌培养。

TSA培养基 胰蛋白胨15.0 g，大豆胨5.0 g，氯化钠5.0 g，调节pH至7.3±0.2 （固体培养基加琼脂13.0 g）。于121 ℃高压灭菌20 min，用于表皮葡萄球菌培养。

GAM培养基 GAM培养基59 g，蒸馏水1 000 mL（固体培养基加琼脂15.0 g）。于121 ℃高压灭菌20 min，冷却至50 ℃后加入氯化血红素溶液（1 mg/mL） 1.0 mL与维生素K1溶液（2 mg/mL）1.0 mL，用于痤疮丙酸杆菌培养。

1.2 实验仪器

DF-101S型集热式搅拌器，金坛市科析仪器有限公司；GL224i-1SCN型分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；SPX-250B型生化培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；YT-CJ-2N型超净工作台，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；UV-5100型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；M-70型皮肤检测仪，智尚合美公司。

1.3 植物性抑菌养发液制备

以配制50 mL抑菌养发液为计，根据专利^［10］所述的各天然提取物配比，称取质量比为3∶1的PEG2000和各植物精油等配方成分于无菌试剂瓶中，在搅拌下滴加天然产物提取物溶液，加入无菌水补至50 mL，拧紧瓶盖后搅拌60 min，体系均一后放入4 ℃冰箱中保存。

1.4 菌悬液制备

对糠秕马拉色菌、表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌进行菌种活化后，分别在30 ℃、37 ℃、35 ℃下培养24 h、24 h、48 h（痤疮丙酸杆菌需厌氧培养）。使用紫外可见分光光度计在600 nm波长下测定菌悬液的吸光度。稀释后的菌悬液吸光度控制在0.150±0.005，对应的菌悬液浓度约为10⁶ CFU/mL。

1.5 最小抑菌浓度（MIC）测定

采用96孔板微量稀释法^［11］测定供试药液的最小抑菌浓度，96孔板的装样孔位如图1所示，具体操作步骤如下。

（1）在无菌环境下，采用对倍稀释法在96孔板中稀释待测养发液。向A2~A10孔中加入100 μL液体培养基，将200 μL药液加入A1孔中混匀，从A1孔中吸取100 μL药液至A2孔，混匀后，从A2孔中吸取100 μL药液至A3孔，以此类推，直至A10孔。混匀后，从A10孔中吸取100 μL药液。

（2）按照（1）中对A行的加样过程，对B~H行的1~10孔进行加样。

（3）第11列为阳性对照列，向A11~H11孔中加入50 μL液体培养基、50 μL生理盐水和100 μL含液体培养基的菌悬液；第12列为阴性对照列，向A12~H12孔中加入50 μL生理盐水和150 μL液体培养基。

（4）向A~H行的第1~10孔中加入100 μL含液体培养基的菌悬液。

（5）另取干净无菌的96孔板作为颜色对照组，重复操作（1）~（3），并在A~H行第1~10孔中加入100 μL液体培养基。

（6）加样完成后，将96孔板置于培养箱中培养，糠秕马拉色菌、表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌的培养温度分别为30 ℃、37 ℃、35 ℃。24 h后，对痤疮丙酸杆菌进行厌氧培养。向所有孔中加入20 μL Resazurin指示剂（0.2 mg/mL），继续培养30 min后观察颜色变化。若无菌生长则颜色没有变化，若有菌生长则颜色变为粉红色，颜色发生变化的最低药液浓度为药液对该供试菌种的MIC值。

1.6 微生物生长曲线测定

测试不同抑菌组分浓度下处于生长对数期的糠秕马拉色菌、表皮葡萄球菌及痤疮丙酸杆菌的生长曲线，其中处理糠秕马拉色菌的抑菌组分质量浓度为0.2、0.4、0.8 mg/mL，处理表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌的抑菌组分质量浓度为0.2、0.8、1.6 mg/mL。同时以加入不含抑菌物质的PEG2000混合液作为空白对照组。调整培养基中菌浓度为10⁶ CFU/mL，糠秕马拉色菌的测试组及空白对照组在30 ℃、180 r/min下于无菌摇床中共同持续培养，表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌的测试组及空白对照组分别在37 ℃和35 ℃下于无菌摇床中（180 r/min）共同持续培养。在不同时间取样，使用紫外可见分光光度计在600 nm波长下测定各组菌液的光密度（OD₆₀₀），各组实验重复3次，结果取平均值，绘制微生物生长曲线。

1.7 平板抑菌率测定

向无菌平板中加入培养基，将不同浓度的植物性抑菌养发液100 μL与含有糠秕马拉菌、表皮葡萄球菌或痤疮丙酸杆菌的菌液100 μL混匀，接种到平板上，分别在30 ℃、37 ℃、35 ℃下培养24 h（其中痤疮丙酸杆菌进行厌氧培养），对菌落数进行统计。同时设置对照组（用生理盐水代替养发液），按照下式计算抑菌率R。

R=\frac{N_{\mathrm{c}}-N_{\mathrm{t}}}{N_{\mathrm{c}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

式中：N_c为对照组的菌落数，N_t为试验组的菌落数。

1.8 植物性抑菌养发液的功效评价

选取有不同程度的头屑、头皮油脂分泌异常、发质干枯、头皮炎症的受试者10名，每日于头皮处涂抹植物性抑菌养发液（抑菌组分含量为2 mg/mL）约5 mL，按照以下方法评价养发液的功效。

1.8.1 去屑效果

受试者洗完头后处于常温环境中2 h，对着黑纸用梳子梳理头发50次后拍照记录，利用ImageJ软件对黑纸图片进行分析，计算黑纸上头皮屑的面积。在头部不同位置取样3次，结果取平均值，按照下式计算去屑率D。

D=\frac{A_{\mathrm{0}}-A_{\mathrm{t}}}{A_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

式中：A₀为未使用养发液时黑纸上头皮屑的面积，A_t为使用养发液后黑纸上头皮屑的面积。

此外，为了观察植物性抑菌养发液的实际去屑效果，采用皮肤检测仪附带的皮肤镜对受试者的同一受试部位进行头皮检测。受试者在采集图片前均在适宜的室内环境静候30 min，且距离上次洗发6 h以上。

1.8.2 改善头皮红肿、平衡头皮水油、固发养发的效果

采用“皮肤镜结果四分制划分”评定法评估植物性抑菌养发液改善头皮红肿状况的效果。采用问卷调查的方式评估养发液调节头皮水油平衡（即改善头皮干燥或油腻状况）的效果。在固发效果的评估中，要求受试者对着白纸用梳子梳理头发50次，然后统计纸张上的发丝数量；在养发效果的评估中，利用皮肤镜自带的程序测量发根直径，随机取相同区域内的3处发根进行测量。植物性抑菌养发液的功效评分表如表1所示。

1.8.3 统计学分析

使用SPSS27.0软件对数据进行统计分析，采用t检验对数据进行显著性分析，P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异较显著，P<0.001表示差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 天然提取物配比对抑菌活性的影响

由于养发液中各天然提取物的配比对不同菌种的抑制效果存在显著差异，因此通过调控天然提取物的配比可以在尽可能抑制目标有害菌的同时减少对被保护菌的影响，以实现调节菌群数量、调控微生态平衡的目的。在配方设计初期，本研究对各天然提取物在配方中的占比进行调整后设计了3种配方，使用96孔板微量稀释法测试了这3种配方对受试菌种的最小抑菌浓度，结果如表2所示。可以看出，配方A具有较强的抑制糠秕马拉色菌的能力，同时对痤疮丙酸杆菌的抑制作用较弱，此外还具有一定的抑制表皮葡萄球菌的能力，因此选择配方A作为植物性抑菌养发液中天然提取物的配比成分。

2.2 抑菌组分浓度对微生物生长曲线的影响

测试了配方A中抑菌组分的浓度对糠秕马拉色菌、表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌生长曲线的影响，结果如图2所示。由图2（a）可以看出，对于糠秕马拉色菌，空白对照组的菌群数量在进入对数期后迅速增殖，而不同抑菌组分浓度的养发液均显著抑制了糠秕马拉色菌在对数生长期的繁殖，尤其是在0.8 mg/mL以上时该菌的生长几乎完全被抑制。由图2（b）可以看出，不同抑菌组分浓度的养发液抑制了痤疮丙酸杆菌在各个时期的增殖，与糠秕马拉色菌相比，相同浓度的药液对痤疮丙酸杆菌的抑制能力较弱。由图2（c）可知，不同抑菌组分浓度的养发液对表皮葡萄球菌显示出一定的抑制作用，与对照组相比明显延缓了该菌的对数增长期。

以上结果表明，采用配方A制备的植物性抑菌养发液能够显著抑制头皮有害菌糠秕马拉色菌，对其拮抗菌群痤疮丙酸杆菌具有相对较弱的抑制作用，同时对表皮葡萄球菌有一定的抑制效果。此外，养发液对于这3种微生物的抑制作用均显示出剂量依赖性，抑制效果随抑菌组分浓度的提高而增强，因此，应对其合适的使用浓度进行测定，以保证在高效调控微生态的同时，避免对头皮微生态的破坏。

2.3 不同抑菌组分浓度的养发液的平板抑菌率

最小抑菌浓度的测定环境是液体培养基，而在实际应用中养发液难以与头皮菌群充分接触，因此在最小抑菌浓度下养发液无法产生相同的抑菌效果。为了获得养发液实际应用于头皮的抑菌效果，测定了不同抑菌组分浓度的养发液的平板抑菌率，结果如表3所示。当抑菌组分质量浓度为2 mg/mL时，养发液对糠秕马拉色菌的抑制作用较强（抑菌率94.6%），对痤疮丙酸杆菌的抑制作用相对较弱（抑菌率83.1%），对表皮葡萄球菌具有一定的抑制作用（抑菌率82.7%）。值得注意的是，由于痤疮丙酸杆菌定植于毛囊深处，因此在实际应用中药物对丙酸杆菌的抑制作用进一步降低。以上结果显示2 mg/mL为实际应用的最佳抑菌成分含量，有望实现对头皮微生态的调控。

2.4 植物性抑菌养发液的功效评价结果

2.4.1 去屑效果

图3为平均去屑率随时间的变化曲线。由图3可知，在使用养发液5周后，去屑率达到90%以上，使用养发液7周后，去屑率达到94.2%，结果表明微生态调控养发液的去屑效果显著。图4为通过皮肤镜观测到的头皮屑患者在使用抑菌养发液过程中的头皮照片，可以看出受试者A、B、C在使用养发液前均有不同程度的头屑问题，在使用养发液1个月后受试者的头屑明显减少，头屑问题得到显著改善。

2.4.2 改善水油失衡和头皮红肿的效果

研究表明，糠秕马拉色菌的生长具有明显的嗜脂性^［7］。在头皮等油脂分泌旺盛的皮肤部位，糠秕马拉色菌会基于过度分泌的油脂大量生长繁殖，其分解脂质产生的脂肪酸会破坏表皮角质层，刺激头皮产生炎症反应，也会造成头皮微生态紊乱，继而引发溢脂性皮炎等头皮问题^［8］。根据糠秕马拉色菌的嗜脂性特点，维护头皮水油平衡的一个思路是将头皮油脂分泌量调控至正常水平，从而抑制糠秕马拉色菌过度生长繁殖对头皮微生态的破坏，因此可在配方中添加用于控油的天然提取物如茶树精油、天竺葵精油、牛至精油等^［12］。此外，头皮缺水而长期无法得到有效保湿也会引起脱发及头皮敏感等问题^［13］。因此，本研究提出维护头皮水油平衡的另一个思路，即在配方中加入保湿补水成分如甘油葡萄糖苷、透明质酸、荷荷芭油等来调控头皮微生态的平衡。

图5为通过皮肤镜观测到的头皮油脂分泌异常患者在使用抑菌养发液过程中的头皮照片。可以看出，受试者A、B、C在使用养发液前均有不同程度的油脂分泌异常症状，在使用养发液1个月后症状均有所好转，表明头皮水油平衡得以重建。此外，受试者C存在较为严重的头皮发炎症状，在使用养发液的过程中，头皮红肿问题逐渐改善。表4为养发液缓解头皮水油失衡和红肿的效果评分结果。与使用养发液前（0 d）相比，在第7天水油失衡和头皮红肿状况发生改善（P<0.05），在第14天发生显著改善（P<0.01），在第30天水油失衡评分由3.60下降至1.30（P<0.001），红肿程度评分由3.00下降至1.17（P<0.001），结果表明微生态调控养发液可明显改善水油失衡和头皮红肿状况。

2.4.3 生发固发效果

头皮微生态失调常会引发脂溢性皮炎，导致头皮毛囊逐渐微型化发育，头发由此变软变细或者发生变色脱落，严重时形成的毛囊纤维化会造成永久性脱发^［14］。因此，在配方设计时可添加具有高效抑制有害菌增殖与调节头皮菌群平衡的复配成分，以期通过重构头皮微生态的方式使得头皮环境整体回归健康状态，为脆弱细软发根的修复提供良好环境，从而解决脂溢性头皮健康问题以防止脱发进一步恶化。

由图5的镜检结果可以观察到受试者A、B、C在使用养发液前发丝较细、发根脆弱，在使用养发液1个月后毛孔中出现新生发丝，并且发丝直径明显增大。进一步利用皮肤检测仪测量3名发质细软的受试者在使用养发液1个月后发根直径的变化，结果见表5。在使用养发液30 d后，不同受试者的发根直径均显著增大（P<0.001），表明微生态调控养发液具有壮发的功效。此外，在脱发程度的评估中，在使用养发液前（0 d）脱发评分为2.90，在第14天脱发评分为2.50（P<0.05），在第30天脱发评分降为1.17（P<0.01），结果表明微生态调控养发液可明显改善脱发状况。

3 结论

本研究提出调控头皮微生态的配方设计理念，以多种天然提取物为主要成分制备了微生态调控养发液，并评价了其养发护发功效，所得结论如下。

（1）在抑菌组分含量为2 mg/mL时，养发液对糠秕马拉色菌的抑制作用较强（抑菌率94.6%），对痤疮丙酸杆菌的抑制作用较弱（抑菌率83.1%），对表皮葡萄球菌具有一定的抑制作用（抑菌率82.7%），表明所制备的养发液可用于头皮微生态的调控。

（2）养发护发功效评价结果显示，受试者使用养发液7周后，去屑率可达94.2%；使用养发液1个月后，油脂分泌异常症状有所好转，头皮红肿程度减轻，发丝直径明显增大，脱发程度亦有所减轻。

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基金资助

国家重点研发计划(2021YFC2101500)