基于CRISPR/Cas13的单分子高灵敏检测

摘要

分子诊断技术在病原微生物检测、疫情防控、疾病诊断与精准医疗中具有重要作用，但存在耗时长、灵敏度低及特异性差等缺点。因此，亟需开发快速、灵敏度高和特异性强的分子诊断技术。本研究结合CRISPR/Cas13系统和全内反射荧光显微镜（TIRF）开发了一种无扩增的单分子检测方法。首先，通过突变Cas13蛋白的保守结构域2×HEPN domain将Cas13突变为dCas13(deactivated Cas13)，使蛋白失去核酸酶的活性但保留结合酶的活性，从而使dCas13蛋白可以特异性识别并结合RNA分子。然后，利用捕获探针捕获反应体系中由dCas13蛋白、sgRNA（荧光基团标记）和SARS-CoV-2病毒的S基因（靶标RNA）分子形成的三体复合物，通过TIRF对靶标RNA分子进行检测。实验结果表明：在无靶标扩增的条件下，所建立的单分子检测方法对靶标RNA的检测灵敏度达1 pmol/L，相较于Cca Cas13b蛋白固有的附属切割活性，灵敏度提升了1 000倍；该检测体系具有较高的特异性，可有效区分SARSCoV-2病毒的S基因及其常见的突变体（N501Y和D614G）；此外，利用该检测方法成功检测到SARS-CoV-2病毒的基因组RNA(158 ng/μL)。本研究建立的单分子检测技术灵敏度高、特异性强，并且无需额外的核酸扩增步骤，为后续快速诊断方法的开发提供了新思路，具有潜在的应用价值。

关键词

CRISPR/Cas13系统 / dCas13蛋白 / TIRF / 单分子检测 / 高灵敏度