本氏烟NbGAD1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

摘要

γ-氨基丁酸（GABA）作为一种非蛋白质氨基酸，普遍存在于植物体内，在植物生长发育和抗胁迫方面发挥着重要作用。谷氨酸脱羧酶（GAD）是合成GABA的关键蛋白酶，目前关于GAD介导GABA调控植物防御病毒侵染的分子机制尚不清楚。利用RT-PCR克隆本氏烟NbGAD1基因，并与原核表达载体pET-28a连接，构建重组载体pET-28a-NbGAD1,诱导产生重组蛋白，经Ni-NTA柱纯化蛋白后免疫新西兰白兔，最终获得抗血清。结果表明：成功构建原核表达载体pET-28a-NbGAD1,经大肠埃希菌诱导纯化后获得分子量约57 ku的重组蛋白NbGAD1。免疫制备的抗血清经Western blot检测显示，抗血清效价达1∶100 000,抗血清稀释2 000倍仍能检测到浓度为0.005 mg·mL^-1的重组蛋白，且能检测到本氏烟中内源表达的NbGAD1蛋白，说明该抗血清特异性强、灵敏度高，为今后深入探究GAD在植物病毒侵染过程中的作用机制奠定了基础。

关键词

本氏烟 / γ-氨基丁酸 / 谷氨酸脱羧酶 / 原核表达 / 抗血清制备