小白菊内酯通过抑制Piezo1表达对机械牵张应力作用下软骨细胞凋亡的影响及其机制

摘要

目的：探讨小白菊内酯（PTL）通过调控机械敏感性离子通道蛋白1 （Piezo1）表达对机械牵张应力作用下软骨细胞凋亡的影响，并阐明其相关作用机制。方法：按照拉伸性变量将软骨细胞分为0%、5%、10%、15%和20%拉伸组。另取软骨细胞，分为对照组、20%拉伸组、20%拉伸+5μmol·L^-1 PTL组、20%拉伸+10μmol·L^-1 PTL组和20%拉伸+20μmol·L^-1 PTL组。使用Piezo1短发夹RNA （shRNA）干扰慢病毒（sh-Piezo1）或shRNA-NC慢病毒感染软骨细胞，将软骨细胞分为sh-Piezo1组和sh-NC组，另设置空白对照组。另将软骨细胞分为20%拉伸组、20%拉伸+PTL组、20%拉伸+sh-Piezo1组和20%拉伸+sh-Piezo1+PTL组。Hoechst 33258荧光染色观察各组细胞核形态表现，流式细胞术检测各组细胞凋亡率，分光光度法检测各组细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3活性，CCK-8法检测各组细胞增殖率，Fluo-4/AM荧光探针法检测各组细胞中钙离子(Ca²⁺)水平，实时荧光定量PCR （RT-qPCR）法检测各组细胞中Piezo1 mRNA表达水平，Western blotting法检测各组细胞中Piezo1蛋白表达水平。结果：Hoechst 33258荧光染色观察，随着拉伸量逐渐增加，0%、5%、10%、15%和20%拉伸组软骨细胞细胞核呈碎块状致密浓染的软骨细胞数量逐渐增加。流式细胞术检测，与0%拉伸组比较，5%、10%、15%和20%拉伸组软骨细胞凋亡率均明显升高（P<0.01）；与对照组比较，20%拉伸组软骨细胞中细胞凋亡率明显升高（P<0.05）；与20%拉伸组比较，20%拉伸+5μmol·L^-1 PTL组、 20%拉伸+10μmol·L^-1 PTL组和20%拉伸+20μmol·L^-1 PTL组软骨细胞细胞凋亡率均明显降低（P<0.05）；与20%拉伸组比较，20%拉伸+PTL组和20%拉伸+sh-Piezo1组软骨细胞凋亡率均明显降低（P<0.05）。分光光度法检测，与0%拉伸组表示，5%、10%、15%和20%拉伸组软骨细胞中Caspase-3活性均明显升高（P<0.01）；与对照组比较，20%拉伸组软骨细胞中Caspase-3活性明显升高（P<0.05）；与20%拉伸组比较，20%拉伸+5μmol·L^-1 PTL组、20%拉伸+10μmol·L^-1 PTL组和20%拉伸+20μmol·L^-1 PTL组软骨细胞中Caspase-3活性均明显降低（P<0.05）；与20%拉伸组比较，20%拉伸+PTL组和20%拉伸+sh-Piezo1组软骨细胞中Caspase-3活性均明显降低（P<0.05）。CCK-8法检测，与0μmol·L^-1 PTL组比较，40.00、 80.00和160.00μmol·L^-1 PTL组软骨细胞增殖率均明显降低（P<0.05），提示20.00μmol·L^-1 PTL为最高无毒性作用浓度。Fluo-4/AM荧光探针法检测，与对照组比较，20%拉伸组软骨细胞中Ca²⁺水平明显升高（P<0.05）；与20%拉伸组比较，20%拉伸+5μmol·L^-1 PTL组、20%拉伸+10μmol·L^-1 PTL组和20%拉伸+20μmol·L^-1 PTL组软骨细胞中Ca²⁺水平均明显降低（P<0.05）；与20%拉伸组比较，20%拉伸+PTL组和20%拉伸+sh-Piezo1组软骨细胞中Ca²⁺水平均明显降低（P<0.05）。RT-qPCR法检测，与空白对照组和sh-NC组比较，sh-Piezo1组软骨细胞中Piezo1 mRNA表达水平明显降低（P<0.05）。Western blotting法检测，与对照组比较，20%拉伸组软骨细胞中Piezo1蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与20%拉伸组比较，20%拉伸+5μmol·L^-1PTL组、20%拉伸+10μmol·L^-1 PTL组和20%拉伸+20μmol·L^-1 PTL组软骨细胞中Piezo1蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）；与空白对照组和sh-NC组比较，sh-Piezo1组软骨细胞中Piezo1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论：PTL可抑制高强度周期性机械牵张应力诱导的软骨细胞凋亡，其作用机制可能与抑制Piezo1介导Ca²⁺内流引起的细胞凋亡有关。

关键词

小白菊内酯 / 机械敏感离子通道蛋白1 / 机械牵张应力 / 软骨细胞 / 细胞凋亡