Circ＿0022382/let-7a-5p/PI3K/AKT/mTOR轴促进乳腺癌细胞增殖和迁移

摘要

目的:研究circ＿0022382对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响及可能的作用机制。方法:(1)筛选乳腺癌中高表达的circRNA,首先分别对乳腺癌circRNA相关GEO数据集(GSE165884)和miRNA相关GEO数据集(GSE45498)进行差异分析，然后通过ENCORI数据库预测差异表达的circRNA所结合的miRNA,最后通过韦恩图对circRNA结合的miRNA和GEO数据库预测的miRNA取交集，得到交集的miRNA及其对应的circRNA。(2)分别予以收敛引物和发散引物对乳腺癌细胞MDA-MB-231来源的互补DNA(cDNA)和基因组DNA(gDNA)进行PCR,并通过琼脂糖凝胶电泳实验对PCR产物进行分离以验证circ＿0022382的环形结构。(3)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别检测乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7及正常乳腺上皮细胞MCF-10A,乳腺癌组织和癌旁组织中circ＿0022382表达水平。(4)在MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中分别转染si-NC、si-circ＿0022382,采用qRT-PCR检测转染效率，分别采用克隆形成实验和划痕愈合实验检测乳腺癌细胞增殖和迁移；qRT-PCR检测let-7a-5p的表达水平；在si-circ＿0022382组中分别转染let-7a-5p inhibitor NC、let-7a-5p inhibitor,克隆形成实验和划痕愈合实验检测乳腺癌细胞增殖和迁移。(5)通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析let-7a-5p的下游信号通路；在MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞中分别转染let-7a-5p NC、let-7a-5p mimic,蛋白质印迹法和细胞荧光免疫法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达，蛋白质印迹法检测let-7a-5p inhibitor和si-circ＿0022382共转染后乳腺癌细胞p-AKT表达。结果:(1) GSE165884差异分析得到37个高表达的circRNA,GSE45498差异分析得到6个低表达的miRNA,37个高表达的circRNA中，circ＿0022382对应的miRNA和6个低表达的miRNA有交集基因let-7。(2)乳腺癌细胞MDA-MB-231来源的cDNA既可以通过发散引物又可以通过收敛引物来扩增，而gDNA只能通过收敛引物来扩增。(3)与MCF-10A细胞相比，circ＿0022382在乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中均显著高表达(P均<0.001);乳腺癌组织中circ＿0022382表达亦明显高于癌旁组织(P<0.05)。(4)下调circ＿0022382表达后，MDA-MB-231和MCF-7细胞的增殖和迁移能力均显著下降(P均<0.001),let-7a-5p的表达水平均显著升高(P<0.01和P<0.05);在si-circ＿0022382组中，共转染let-7a-5p inhibitor能够显著挽救MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖和迁移能力的下降(P<0.01和P<0.001)。(5) KEGG信号通路富集分析结果显示，PI3K-AKT和mTOR信号通路显著富集；与let-7a-5p NC组相比，let-7a-5p mimic组的p-AKT、p-PI3K和mTOR的蛋白水平显著下降；在si-circ＿0022382组中，共转染let-7a-5p inhibitor能够显著挽救MDA-MB-231和MCF-7细胞中p-AKT表达水平的降低。结论:circ＿0022382在乳腺癌中高表达，通过靶向let-7a-5p/PI3K/AKT/mTOR轴促进乳腺癌细胞的增殖和迁移能力，其有可能作为乳腺癌治疗和诊断的潜在靶点。

关键词

circ＿0022382 / let-7a-5p / PI3K/AKT/mTOR信号通路 / 增殖 / 迁移