脂毒性肝细胞外泌体通过抑制铁死亡促进肝星状细胞活化

摘要

目的:探讨脂毒性肝细胞外泌体(lipotoxic hepatocyte-derived exosome, LTH-ex)对肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)铁死亡和活化的作用。方法:采用油酸和棕榈酸诱导人肝细胞系LO2的脂毒性损伤，收集脂毒性损伤肝细胞的上清液，超速离心法提取LTH-ex,透射电镜、Nanosight纳米颗粒分析系统测定LTH-ex的形态、粒径和浓度，蛋白免疫印迹检测LTH-ex表面标志物。将人HSC细胞系LX-2与LTH-ex或铁死亡诱导剂Erastin共培养48 h,分为PBS对照组，LTH-ex处理组，LTH-ex和铁死亡诱导剂Erastin共处理组，采用FDA和JC-1染色检测LX-2的细胞活力、线粒体膜电位，铁离子浓度试剂盒检测LX-2的铁水平，qRT-PCR、蛋白免疫印迹分别检测铁死亡抑制基因GPX4、xCT和HSC活化基因ɑ-SMA的mRNA及蛋白表达。高脂饮食喂养构建非酒精性脂肪性肝病模型小鼠，通过尾静脉注射LTH-ex, HE染色观察肝组织结构，免疫组织化学染色观察肝组织GPX4、ɑ-SMA蛋白表达，天狼星红染色观察肝组织胶原沉积。结果:LTH-ex的粒径为110 nm左右，具备外泌体的特征性脂质双层结构，表达外泌体标志蛋白TSG101、Alix、CD63。与PBS对照组相比，LTH-ex处理组的LX-2细胞活力增强，线粒体膜电位升高，铁水平下降，铁死亡抑制基因GPX4、xCT和HSC活化基因ɑ-SMA的表达增强；而与LTH-ex处理组相比，LTH-ex和铁死亡诱导剂Erastin共处理组的LX-2细胞活力、线粒体膜电位降低，GPX4、xCT、ɑ-SMA的表达下降。HE染色、免疫组织化学和天狼星红染色显示，LTH-ex能够加重非酒精性脂肪性肝病小鼠肝组织中肝细胞的空泡变性，促进GPX4、ɑ-SMA蛋白表达，增加肝组织胶原沉积。结论:LTH-ex增加HSC的细胞活力，升高铁死亡抑制基因GPX4、xCT的表达，可能通过抑制铁死亡促进HSC活化，加重非酒精性脂肪性肝病小鼠的肝组织胶原沉积。

关键词

脂毒性肝细胞 / 外泌体 / 铁死亡 / 肝星状细胞活化 / 非酒精性脂肪性肝病