高迁移率族蛋白1通过PI3K/AKT通路调节三阴性乳腺癌细胞放射敏感性

摘要

目的:探究高迁移率族蛋白1(HMGB1)在三阴性乳腺癌(TNBC)细胞放射敏感性中的调控作用及其分子机制。方法:通过癌症基因组图谱分析HMGB1在不同乳腺癌亚型中的表达水平及其与乳腺癌患者生存预后的关系。体外培养乳腺上皮细胞MCF-10A,非TNBC细胞株(MCF-7、SK-BR-3)和TNBC细胞株(MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468),qRT-PCR和蛋白质印迹实验分别检测细胞中HMGB1 mRNA及蛋白表达水平；检测4 Gy X线照射不同时间点(0、24、48、72、96 h)细胞增殖情况，并检测不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)X线照射后细胞的放射敏感性；分别利用质粒和慢病毒在MDA-MB-231细胞中敲低和过表达HMGB1,采用CCK-8、克隆形成及流式细胞实验检测4 Gy X线照射后细胞的增殖、克隆形成能力和凋亡水平的变化；免疫荧光实验检测不同剂量(0、4、8 Gy)X线照射后MDA-MB-231细胞核中HMGB1变化以及转染后细胞4 Gy X线照射处理72 h后细胞核、HMGB1以及γ-H2AX的变化；MDA-MB-231细胞进行0、4、8 Gy X线照射，shControl、shHMGB1-2、Vector、Flag-HMGB1组细胞进行4 Gy X线照射72 h后，蛋白质印迹实验检测细胞内p-AKT、AKT、p-GSK-3β、GSK-3β、Caspase 9、p-H2AX、HMGB1蛋白表达。此外，将MDA-MB-231细胞分为对照组、照射组、AKT抑制剂组、AKT抑制剂联合照射组，并检测细胞增殖抑制率；在不同处理组(Vector、Flag-HMGB1、Vector+AKT抑制剂、Flag-HMGB1+AKT抑制剂)中检测4 Gy X线照射后细胞增殖活力及p-AKT/AKT、Caspase 9和p-H2AX蛋白表达变化。结果:HMGB1在TNBC中高表达，其高表达与患者不良预后相关。TNBC细胞株(MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468)中HMGB1的mRNA和蛋白表达水平显著高于非TNBC细胞株(MCF-7、SK-BR-3),且前者放射敏感性较低。敲低HMGB1显著提高MDA-MB-231细胞的放射敏感性，而过表达HMGB1则显著降低其放射敏感性。敲低HMGB1,4 Gy X线照射后细胞p-AKT表达显著降低，p-GSK-3β及p-H2AX表达显著升高；过表达HMGB1,4 Gy X线照射后细胞p-AKT表达显著升高，p-GSK-3β及p-H2AX表达显著降低。使用AKT抑制剂(AKTi-1/2)可显著阻断HMGB1促进放射抵抗的作用。结论:HMGB1在TNBC细胞中高表达，通过PI3K/AKT通路调节细胞放射敏感性，可能是TNBC放射抵抗的重要分子靶点。

关键词

高迁移率族蛋白1 / 三阴性乳腺癌 / 放射治疗 / 蛋白激酶B