文物是人类历史发展过程中遗留下来的具有历史、文化及科学价值的实物。其中不可移动的石质文物(以下简称石质文物)如:石窟、石雕、岩画等,因其历史悠久,分布范围广泛,具有重要的历史与科学价值,为研究古代文明提供了完善的实物资料
[1]。石质文物往往由于体量较大,不宜整体进行移动,因此随着环境条件的复杂多变,会遭受各种因素引发的破坏,生物病害即是其中最为常见的一类
[2]。可引发石质文物生物病害的如细菌、藻类、真菌和地衣等生命体,它们在石质文物表面及其裂隙中繁衍生长,掩盖石刻精美纹饰,导致石质文物表面变色及表层风化等不可逆 变化
[2-4]。
龙门石窟是全国重点文物保护单位,世界文化遗产,是具有极高艺术价值和历史价值的中国皇家石窟,被联合国教科文组织评价为:“龙门石窟是中国北魏晚期至唐代(公元493年~907年)期间,最具规模和最为优秀的造型艺术,代表了中国石刻艺术的最高峰。”敬善寺区域作为龙门石窟重要的组成部分,共有编号洞窟97个,包括由唐太宗李世民之妃韦氏出资营造的皇家洞窟敬善寺、对我国早期佛教传播影响深远的21个优填王造像龛
[5]、龙门石窟刻有《金刚经》的3处洞窟之一429窟等。敬善寺区域坡面径流造成地表水无序排放,洞窟存在不同程度渗漏现象,生物病害发育,对石窟寺的安全保存不利。研究引发石窟寺生物病害的物种类型,揭示其对石窟文物的侵蚀机理,从而实施针对性的保护,对石窟寺保护具有重要的现实意义。国际上对石质文物生物病害尤其微生物病害的研究已有一个多世纪,在微生物多样性、生态功能、退化机理及防治技术等方面取得了较大进展。我国近年来对包括龙门石窟
[6]、云冈石窟
[7]、乐山大佛
[8]、麦积山石窟
[9]等石质文物的微生物病害开展了一定的研究,但研究主要集中在对砂岩质文物生物病害种类、侵蚀机理方面,对石灰岩质文物生物病害的研究相对较少。龙门石窟对生物病害的研究主要涉及部分区域的调查和腐蚀机理的探讨
[10],未涉及敬善寺区域,亟需借助新型多学科手段进一步开展研究。
因此,本研究以龙门石窟敬善寺区域生物病害调查为切入点,对调查区域采集到的生物病害样品进行分析,进一步揭示生物病害物种种类及分布,探究损伤机理,旨在为后续的生物病害控制提供依据,并为石窟寺修复和减缓生物病害进程等方面提供借鉴和参考。
1 材料和方法
1.1 研究区域及采样点
本调查研究以龙门石窟西山敬善寺区域为整体,随机选取31个采样点(
图1),采样点类型涉及洞窟内岩壁与地表、洞窟门口、洞窟间岩面、佛像表面等,采集样品的原则为生物病害肉眼可见,即已明显引发石窟表面颜色变化或直接可见生物体(个体或群体)。
1.2 试剂材料
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA,北京奥博星生物技术有限责任公司)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSA,北京奥博星生物技术有限责任公司)、孟加拉红培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)、PCR试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)、CTAB(纯度99%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)等。
1.3 试验方法
1.3.1 生物病害样品采集
采集生物病害样品共64份,包含地衣9份,苔藓9份,附着于石窟表面的沉积物9份,生物结皮状复合物30份,与石窟具有紧密接触特征的疑似微型真菌及地衣样品7份。采集时用无菌手术刀在石窟表面轻轻刮取,放入无菌袋或无菌离心管中,置于盛放干冰的样品箱中,次日带回实验室,-80 ℃保存备用。
1.3.2 微生物分离与纯化
称取生物结皮状复合物和沉积物各0.5 g,移入离心管中与100 µL无菌水混合,在离心管内用玻璃研磨棒研磨,加入1000 µL无菌水混匀,制成1100 µL混合溶液。从中吸取100 µL,分别滴加在PDA、TSA与孟加拉红培养基中,每种培养基2个重复,25 ℃恒温培养36 h,长出菌落后用划线法纯化,直至出现单菌落,取单菌落扩大培养。
1.3.3 DNA提取、测序和片段分析
DNA提取采用改良CTAB法
[11]。真菌扩增ITS片段,细菌扩增16SrDNA片段。PCR扩增反应体系为25 μL:DNA 2 µL,2×Taq PCR MasterMix 13 µL,上下游引物各1 µL(
表1),超纯水8 µL。真菌DNA扩增的反应条件:95 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸72 s,33个循环,72 ℃后延伸2 min;细菌DNA扩增的反应条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,共30个循环,72 ℃后延伸10 min。PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测,委托北京天一辉远有限公司进行测序。
1.3.4 系统发育分析
在NCBI网站下载参考序列,与本研究所获得的序列进行系统发育分析,并选择合适的外群,利用BioEdit v.7.0.5
[12]中的ClustalW Multiple Alignment
[13]进行序列比对。对单基因数据集进行最大似然法
[14]分析,使用在线网站Cipres Science Gateway (
http://www.phylo.org)中的RAxML HPC v.8.2.6
[15]构建系统发育树,运算方法选择GTR+I+G模型,每个节点假设1000次重复来评价自展值,得到的树文件用FigTreeV.1.4.2查看和编辑,自展支持值(Bootstrap support values)≥75%的分枝具有可信度。
1.3.5 物种鉴定
地衣物种鉴定基于形态学观察和ITS片段分析;苔藓物种鉴定及由生物结皮状复合物和沉积物中分离培养出的真菌物种鉴定基于形态学观察;生物结皮状复合物和沉积物高通量测序的物种鉴定基于USEARCH方法,对各样品的Effective Tags进行聚类,将序列相似性达到97%的序列聚类成1个OTU,OTU即分类操作单元(Operational Taxonomic Unit)。
1.3.6 生物病害程度检测
利用扫描电子显微镜(Hitachi SU8010)对部分代表微生物侵蚀文物本体的情况进行了形貌观察。利用薄层层析方法
[19-21]检测地衣体中的化学酸。利用高效液相色谱法测定地衣和由生物结皮状复合物与沉积物中分离培养出的真菌中化学酸的含量。色谱条件为:XSelect HSS T3色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,Waters公司,美国),流动相为20 mmol·L
-1磷酸水溶液,流速1.0 mL·min
-1;检测波长220 nm。
2 结果与分析
2.1 微生物在内的生物病害种类组成
本研究调查的龙门石窟敬善寺区域内的生物病害由地衣、微型真菌、细菌、苔藓和藻类组成(
表2~
表3)。其中最具明显个体结构特征的为地衣和苔藓,经鉴定确认地衣7种,隶属于子囊菌门(Ascomycota)3纲(茶渍纲Lecanoromycetes,异极衣纲Lichinomycetes和散囊菌纲Eurotiomycetes)3目(黄枝衣目Teloschistales,异极衣目Lichinales和瓶口衣目Verrucariales)3科(黄枝衣科Teloschistaceae,异极衣科Lichinaceae和瓶口衣科Verrucariaceae)3属;苔藓4种,隶属于真藓门(Bryophyta)真藓纲(Bryopsida)丛藓目(Pottiales)丛藓科(Pottiaceae)4属。
从生物群体构成的结皮状复合物和沉积物中分离培养出绿藻、微型真菌和细菌,其中:绿藻共1目(胶毛藻目Chaetophorales);微型真菌20种,隶属于子囊菌门3纲(座囊菌纲Dothideomycetes,散囊菌纲Eurotiomycetes,粪壳菌纲Sordariomycetes)5目(煤炱目Capnodiales,散囊菌目Eurotiales,肉座菌目Hypocreales,格孢腔菌目Pleosporales,粪壳菌目Sordariales)8科(格孢腔菌科Pleosporaceae,曲霉科Aspergillaceae,枝孢霉科Cladosporiaceae,毛壳科Chaetomiaceae,麦角菌科Clavicipitaceae,Neopyrenochaetaceae,线虫草科Ophiocordycipitaceae,球腔菌科Phaeosphaeriaceae)11属;细菌包括蓝细菌门共3目(拟色球藻目Chroococcidiopsidales, 念珠藻目Nostocales, 颤藻目Oscillatoriales)4科(拟色球藻科Chroococcidiopsidaceae, 微鞘藻科Microcoleaceae,念珠藻科Nostocaceae,伪枝藻科Scytonemataceae);细菌门2目(肠杆菌目Enterobacterales,芽孢杆菌目Bacillales)2科(肠杆菌科Enterobacteriaceae,芽孢杆菌科Bacillaceae),放线菌门1目(小单孢菌目Micromonosporales)1科(小单孢菌科Micromonosporaceae)。通过高通量测序复合物和沉积物中未检测到绿藻,但检测到了大量微型真菌和细菌,检测到的真菌占比最大的为子囊菌门,种类组成与上述培养结果具有高度一致性(
表3);检测到的细菌多样性相比培养方法更强,包括变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、黏球菌门(Myxococcota)、芽单孢菌门(Gemmatimonadetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、Patescibacteria、厚壁菌门(Firmicutes),另外还包括古菌中的泉古菌门(Crenarchaeota)。高通量测序结果与传统培养结果具有互补性,完整地反映了结皮状的复合物和沉积物中的生物组成(
表3)。
2.2 微生物在内的生物病害物种主要分布情况
在采样区域内(
图1)采集到的不同种类生物病害样品分布情况为:
9份具明显结构特征的地衣分布于敬善寺区域的303~306窟之间的岩面、331~307窟之间岩表的裂隙、415~414窟之间的分界石以及摩崖三佛龛南侧壁面。
9份苔藓分布于443窟的洞口,307窟南造像底部裂隙处、332窟南壁、403窟洞口南侧底部和413窟南壁。
9份沉积物分布于284~260窟之间、289窟、284窟壁面、305窟、362窟北壁、363窟、403窟、443窟内壁面和445窟地面。
7份待进一步确定的微型真菌和地衣分布于286窟下侧、288窟南侧、292窟、440窟壁面、445窟和303窟和306窟之间的岩面。
30份生物结皮复合物分布于261窟造像周边、285窟~260窟之间、288窟内正壁造像下地面、443窟内壁面、437窟造像底部和墙壁、439窟地面和壁面上、445窟壁面、地面和水道处、307窟内南侧造像底部、332窟造像右臂处、362窟窟口、404窟窟口、416窟地面、418窟内壁、419窟壁面、422窟北侧、摩崖三佛龛地面、摩崖三佛龛最南侧造像水沟内、摩崖三佛龛说明牌旁地面、摩崖三佛龛主佛上。
调查显示主要生物病害为地衣和苔藓,原因为其在调查区域内常见,具明显特征结构,且盖度较大。
2.3 代表生物病害的致害程度检测
本研究选择了6份具代表性的微生物和植物病害样品,包括地衣、微型真菌和绿藻,因为地衣是由真菌和藻类或蓝细菌组成的联合共生体,也是调查区域内常见的生物病害。从外部形态观察,这些生物样品与石窟接触紧密。对这6份样品进行扫描电镜观察,检测其对石窟岩石的侵蚀程度(
图2、
图3),结果表明位于采样点4(286窟)石窟表面的地衣(样品号20200206),其菌丝进入白云岩岩石内部约50 μm,菌丝与浅表层岩石颗粒之间发生接触,且出现缠绕现象,证明存在侵蚀;图
2C和
2D显示:位于采样点8(292窟)石窟的地衣(样品号20200215)在白云岩上未深入内部,但可见菌丝与接触的岩石颗粒有相互作用,推测其有潜在侵蚀作用;图
2E和
2F显示:位于采样点14(445窟)石窟的非地衣型真菌(样品号20200241)的菌丝与白云岩浅表层的岩石颗粒有接触,伴有菌丝相互缠绕现象,深入岩石内部约100 μm,说明其对岩石有明显的侵蚀作用。
图
3A和
3B显示,位于采样点13(440窟)石窟表面附着物的绿藻(样品号20200240),藻细胞深入至白云岩岩石内部50 μm处,与岩石颗粒有相互接触,两者之间接触的紧密程度较高,推断该附着物对岩石的侵蚀作用较为明显;图
3C和
3D显示,位于采样点14(445窟)石窟的非地衣型真菌(样品号20200245)仅限于表面而未深入岩石内部,但与岩石颗粒有相互接触,推测其对岩石仍存在侵蚀作用;图
3E和
3F显示,位于采样点16(洞窟303和洞窟306之间)石窟的中华石果衣
Endocarpon sinense(样品号20200249)中的菌丝不仅与岩石表面有紧密接触,而且可见已延伸至岩石内部,与岩石颗粒有相互接触,推测对岩石有一定侵蚀作用。
生物侵蚀的产生原因除了物理作用,也与化学作用有很大关系
[22-23]。化学作用一般利用生物产生的有机酸等化合物,使石窟表面发生层状片状剥落、风化裂隙等病害。高效液相色谱系统检测结果显示(
表4),在8份地衣样品中,石果衣
Endocarpon pusillum(样品号20200254)、石果衣
Endocarpon sp.(样品号20200255)和丽石黄衣
Xanthoria elegans(样品号20200272)含有柠檬酸;地衣待定物种(样品号20200273、20200291、20200293)和黑边石果衣
Endocarpon nigromarginatum(样品号20200294)含有琥珀酸;黑边石果衣
Endocarpon nigromarginatum(样品号20200296)含有乳酸和琥珀酸。对从生物结皮复合物中分离培养出的5种非地衣型真菌进行液体培养后,极细枝孢
Cladosporium tenuissimum(样品号20200202)含有柠檬酸,淡紫拟青霉
Purpureocillium lilacinum(样品号20200231)、聚多曲霉
Aspergillus sydowii(样品号20200226)、葡萄汁曲霉
Aspergillus uvarum(样品号20200274)和桔青霉
Penicillium citrinum(样品号20200284)含有2~3种以上的有机酸。
3 讨论
龙门石窟敬善寺区域的生物病害种类多样,其中主要的生物病害如地衣对石窟的侵蚀既有物理作用,又有化学作用。本研究选择了包括地衣在内的6份与石窟相关且连带岩石的生物样品进行了扫描电镜观察(
图2、
图3),发现不同生物对石窟岩石的侵害深度不同,真菌菌丝或藻细胞通过石窟岩石纹理由岩石表面的间隙向岩石内部渗透,在湿度影响下发生膨胀或收缩,使文物表面出现碎裂、剥落、空鼓以及崩解等现象。石窟碎裂同时也伴随着化学作用,对地衣以及生物结皮复合物中的真菌检测结果显示,它们至少能分泌1种有机酸,且呼吸产生的CO
2等气体与岩石发生化学反应,加速对石窟的腐蚀过程。地衣是由真菌和藻类或蓝细菌组成的共生联合体
[24-25],被称为先锋生物,因地衣重要的生物学特性之一即为风化岩石,助力原始土壤的形成
[22,26]。但因为地衣具有不同的生长型,其含有的有机酸种类也不尽相同,因此石质文物上生长的不同种类的地衣致害程度也不完全相同,这也是本研究对不同地衣样品以及代表性的真菌和藻类样品通过扫描电镜观察和高效液相色谱法进行化学酸检测的原因,以期通过藻细胞、真菌菌丝细胞在岩石上向下生长的深度以及地衣和真菌产生的有机酸情况进行综合判断。
在本研究调查的敬善寺区域中,还鉴定出4种苔藓,分别为灰土对齿藓、卷叶湿地藓、铜绿净口藓、小扭口藓,均属于丛藓科。这4种苔藓的化学相关资料欠缺,因此本研究无法对其产生的化合物进行定向检测。已有研究表明苔藓植物具有多种生物活性,主要含有萜类、甾醇、芳香族化合物、黄酮类化合物及脂类
[27-28]。苔藓植物还可以分泌一些酸性物质
[29],溶解岩石中的矿物质,降低岩石颗粒之间的凝聚力。据此推断敬善寺区域的4种苔藓也具有潜在的化学侵蚀作用。此推断基于有关其它苔藓的相关报道,并结合了现场观察。苔藓与地衣的物理侵蚀作用类似,利用假根向石质文物内部侵蚀,具有很强的侵蚀深度。本研究中苔藓样品20200217(灰土对齿藓)对石窟表层岩石具有明显的侵蚀作用,该苔藓假根延伸能力较强,与石窟土层形成了高度约38 mm的蜂窝状形貌。苔藓是一类不可忽视的石窟常见植物,敬善寺白云岩石质的高含钙量石材能够为苔藓提供适宜的生长条件,但石窟文物表面苔藓的研究尚不充足,对石窟的作用有待深入研究。
龙门石窟敬善寺调查区域的生物病害除了以个体形式存在的地衣和苔藓外,还包括以结皮形式存在的复合物和沉积物。2种类型的生物病害在石窟的分布情况不同,地衣和苔藓主要覆盖在石窟外周的岩面,以结皮形式存在的复合物和沉积物主要覆盖在石窟内部的岩壁或地面。基于培养和高通量测序综合分析,发现生物结皮主要由包括蓝细菌在内的细菌和真菌组成。虽然生物结皮内的细菌和真菌的生物量相比地衣和苔藓较小,且与石窟接触连接不紧密,随着时间推移,这些生物群落在石质文物上可能会形成连续程度不一的生物膜,从而产生生物腐蚀
[2];但最近也有研究指出,以蓝细菌为主要组分的生物结皮覆盖于夯土长城城墙表面,显著增强了城墙抗压强度等系列特性,对长城起到了很好的保护作用
[30]。生物结皮内的蓝细菌属于自养微生物,兼具固碳和固氮的重要生态学功能,可以为生物群落中的异养微生物(如异养细菌和真菌)提供有机物质,而本研究显示由生物结皮中分离培养出的真菌,当其大量生长时会产生有机酸,因此石质文物上的生物结皮存在危害隐患。
龙门石窟依山而建,置于户外环境中,因此石窟生物病害受所在周边环境的影响,灰尘及植物残体在石窟上的堆积会为生物提供营养来源从而有助于生物定殖。现场勘察发现真菌和藻类在石窟内外壁面及佛像本身的水迹处更加明显,加之洞窟内地面及角落处存在积水现象,真菌和藻类产生的孢子在潮湿的环境中会进一步定殖在石窟及周边环境,加剧石窟的生物病害。
虽然相比石窟风化、洞窟渗漏水以及危岩体崩塌病害,生物病害破坏程度看似相对较小,但在长期累积效应作用下,其对文物的破坏作用仍不容忽视
[3]。
4 结论
本研究首次较为系统的查明了敬善寺区域生物病害物种种类主要由地衣、苔藓、藻类、真菌和细菌组成,其中地衣7种,苔藓3种,藻类1种,真菌20种,可培养细菌7种。地衣和苔藓以个体形式存在,主要覆盖于石窟外周岩壁,与岩壁接触紧密,它们具有明显特征结构,且盖度较大,是敬善寺区域最主要的生物病害,它们对石窟的侵蚀既有物理作用,又有化学作用;不同地衣对石窟岩体的物理侵蚀深度不同,含有的有机酸种类也不尽相同,因此对石窟造成的损伤亦有不同。蓝细菌等细菌、真菌以生物结皮形式存在,主要覆盖在石窟内部的岩壁或地面,与基物接触不紧密,虽然生物量低,但由于生物群落稳定,随时间累积,仍存在危害隐患。生物病害的发育与石窟所处环境密切相关,应通过对石窟微环境控制并定期对生物病害的发展进行监测,有效防治生物病害。
国家重点研发计划项目(2021YFC1523400)
国家自然科学基金(32370105)
河南兴文化工程文化研究专项项目(2022XWH119)