赣南设施丝瓜根结线虫种类鉴定及杀线剂对其防效测定

Identification of root-knot nematode species in green house sponge gourd in Gannan area and efficacy of Nematicides

摘要

目的 针对赣南地区设施蔬菜根结线虫病危害严重问题，鉴定赣南地区设施丝瓜根结线虫病病原物种类，明确化学杀线剂对病原物的毒力活性并进行田间防效试验，为丝瓜根结线虫病的防控提供理论支撑。 方法 采用五点取样法采集南康区具有丝瓜根结线虫病典型特征病害样品进行分离、纯化及致病性测定，观察分离物的形态特征，通过rDNA-ITS序列和28S rDNA D2D3序列进行测序分析。以该根结线虫二龄幼虫（J2s）为材料，进行室内毒杀活性测定和田间防效试验。 结果 丝瓜根结线虫分离纯化后进行室内回接，丝瓜产生明显根结，且与自然发病典型特征一致，再分离后得到与接种病原线虫形态特征一致的线虫。该病原线虫的形态特征与南方根结线虫Meloidogyne incognita基本一致，rDNA-ITS序列及28S rDNA D2D3序列与Genebank中M. incognita相似性达99%以上，构建系统发育树发现该病原线虫与M. incognita聚在一支。室内毒力测定结果表明：5%阿维菌素EC对M. incognita毒杀活性最高，24 h时EC₅₀为1.106 5 mg·L^-1，41.7%氟吡菌酰胺SC、11%阿维·噻唑膦GR和20%噻唑膦EW依次减弱，24 h和72 h时EC₅₀分别为1.891 9 mg·L^-1和0.355 2 mg·L^-1、5.476 2 mg·L^-1和3.707 8 mg·L^-1、39.861 6 mg·L^-1和32.149 8 mg·L^-1。田间防效试验结果表明：5%阿维菌素EC和41.7%氟吡菌酰胺SC处理对土壤中根结线虫相对防效分别为70.49%和77.99%，作物根结防治效果分别为58.41%和68.71%，均高于其它处理。 结论 赣南地区设施丝瓜根结线虫病病原物为M. incognita，5%阿维菌素EC和41.7%氟吡菌酰胺SC对M. incognita室内毒力和田间防治效果均较好。

Abstract

Objective To address the serious problem of root-knot nematode disease in greenhouse vegetables in Gannan region，this study aimed to identify the pathogen species causing root-knot nematode disease in greenhouse-grown sponge gourd and to evaluate the toxicity and field control efficacy of chemical nematicides against the pathogen. The results would provide theoretical support for controlling root-knot nematodes in Luffa. Method Samples showing typical root-knot nematode disease symptoms were collected from Nankang district using a five-point sampling method. The sample were isolated， purified， and tested pathogenicity. The morphological characteristics of the isolates were observed， and sequencing analysis was conducted using rDNA-ITS and 28S rDNA D2D3 sequences. The second-stage juveniles （J2s） of the root-knot nematode were used as materials for toxicity determination and field control tests. Results After isolation and purification of the root-knot nematodes，indoor re-inoculation of sponge gourd resulted in the formation of typical root knots， consistent with the natural disease symptoms. The nematodes isolated post-reinoculation exhibited morphological characteristics consistent with the inoculated pathogenic nematodes. The morphological characteristics of the pathogenic nematode were essentially identical to those of Meloidogyne incognita. The rDNA-ITS and 28S rDNA D2D3 sequences showed over 99% similarity with M. incognita in Genbank. Phylogenetic tree construction revealed that the pathogenic nematode clustered with M. incognita. Toxicity testing showed that 5% abamectin EC exhibited the highest toxicity against M. incognita， with a 24-hour EC₅₀ of 1.106 5 mg·L^-1. The effectiveness of 41.7% fluopyram SC， 11% abamectin-fosthiazate GR， and 20% fosthiazate EW followed， with 24-hour and 72-hour EC₅₀ values of 1.891 9 mg·L^-1 and 0.355 2 mg·L^-1， 5.476 2 mg·L^-1 and 3.707 8 mg·L^-1， 39.861 6 mg·L^-1 and 32.149 8 mg·L^-1， respectively. Field efficacy trials demonstrated that the relative control efficacy of 5% abamectin EC and 41.7% fluopyram SC on root-knot nematodes in soil was 70.49% and 77.99%， respectively，while the root knot control efficiency on crops was 58.41% and 68.71%，both higher than other treatments. Conclusion The pathogen causing root-knot nematode disease in Gannan area is M. incognita.Both 5% abamectin EC and 41.7% fluopyram SC exhibit good indoor toxicity and field control efficacy against M. incognita.

Graphical abstract

关键词

赣南地区 / 设施丝瓜 / 根结线虫 / 病原鉴定 / 防效测定

Key words

Gannan area / Greenhouse-grown Luffa / Root-knot nematode / Pathogen identification / Control Effect

丝瓜是葫芦科（Cucurbitaceae）丝瓜属（Luffa Mill.）一年生攀缘性草本植物，是我国主要瓜类蔬菜之一^［1］。其肉质疏软多汁，蛋白质、氨基酸等营养物质丰富且具有清热解毒、化痰生津、美白美容等医药功效^［2-3］。截止2023年，赣南地区设施蔬菜产业建设面积超过1.95万hm²，且还在稳步增长中。近年来随着保护地设施蔬菜栽培面积逐年增加，根结线虫病越来呈逐年加重之势，所以明确赣南地区设施丝瓜根结线虫种类及筛选高效杀线剂对于精准防治根结线虫具有重要意义。根结线虫（Root-Knot Nematode）是一种世界性植物病原物^［4］，目前已经超过细菌和病毒，成为仅次于真菌的第二大病原^［5-6］，是致病性最强的植物寄生线虫之一^［7］。目前已经有超过100种根结线虫被报道，其中南方根结线虫、北方根结线虫（M. hapla）、爪哇根结线虫（M. javanica）、花生根结线虫（M. arenaria）是分布最广泛、危害最大的4种根结线虫，在全球均有发生^［8-9］。据统计，根结线虫可以侵染超过3000种植物，为害潜力极大^［10］，2013年全球因植物寄生线虫导致作物减产损失1570亿美元，其中超过50%是由根结线虫导致^［11-12］。目前防治根结线虫病以化学农药为主，噻唑膦、氟吡菌酰胺和阿维菌素是较为常用的3种杀线剂，据报道，它们对柑橘、番茄和黄瓜根结线虫具有较好的防治效果^［13-18］。该研究拟从田间采集具根结线虫典型发病特征的丝瓜样品，对其进行病原物分离，对分离得到的病原物进行致病性检测及形态学与分子生物学鉴定，明确根结线虫种类，进一步通过室内毒杀活性试验和田间防效试验明确各杀线剂对其活性程度。该研究拟明确赣南地区设施丝瓜根结线虫种类，并通过各杀线剂的室内毒杀活性测定和田间防效试验为赣南地区设施丝瓜根结线虫病的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　材料

1.1.1　供试线虫

2023年3月从江西赣南地区南康区龙华镇新文村（N： ；E ）通过五点取样法采集具有明显根结的丝瓜植株发病样品，用塑封袋装好完整根结和根际土，贴上标签后带回实验室进行显微镜观察、分离和鉴定。J2s：称取根际土5 g，通过漏斗法分离根际土中的J2s；受害根系洗干净后，挑取单个卵囊装有1.5 mL dd H₂O的2 mL离心管中，28 ℃恒温培养箱中孵化获取J2s。雌成虫：受害根系清洗干净后，体式显微镜下解剖根结，挑取雌成虫，观测形态特征和用于分子生物学鉴定。

1.1.2　供试植株

供试植株为丝瓜，品种为‘兴蔬短棒’。

1.1.3　供试试剂和农药

试剂盒：Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）。

杀线剂：20%噻唑膦水乳剂，山东绿德地生物科技有限公司生产；41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂，拜耳作物科学（中国）有限公司生产；5%阿维菌素乳油，河北兴柏农业科技有限公司生产；11%阿维·噻唑膦颗粒剂，华北制药集团爱诺有限公司生产。

1.2　方法

1.2.1　致病性测定

自然土121 ℃高温高压灭菌30 min后装于40 cm×60 cm盆钵，丝瓜幼苗两叶一心时移栽，缓苗7 d后，用移液枪吸取含约3000头J2s 5 mL ddH₂O接种于丝瓜苗根际，28 ℃、相对湿度65%恒温培养箱进行培养，35 d后观察丝瓜苗地上部和地下部发病情况；5 mL ddH₂O接种于丝瓜苗根际作为空白对照，每个处理3次重复，每个重复3株植株。

1.2.2　形态学鉴定

J2s和雌成虫：在光学显微镜下进行形态观察，测量并记录数据。线虫的杀死和固定按照《植病研究方法》^［19］进行操作，通过光学显微镜进行形态特征观察及直接测量J2s和雌成虫的最大体长。

1.2.3　分子生物学测定

DNA提取与PCR扩增：挑取受害根系雌成虫约20头，利用Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取雌成虫的基因组DNA，采用引物rDNA-ITS （F194：5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′，PXB481：5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′）^［20］和28S rDNA D2D3 （D2A：5′-ACAAGTACCGTG-AGGGAAAGT-3′，D3B：5′-TCGGAAGGAA-CCAGCTACTA-3′）^［21］进行PCR扩增，PCR扩增总体积 25 μL，包括上下游引物各 1 μL，模板 DNA 1 μL，10×Taq Master Mix 2.5 μL，Taq酶0.2 μL，ddH₂O 19.3 μL。PCR扩增程序：预变性95 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，30个循环，72 ℃延伸10 min，扩增产物4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI中BLAST比对分析；通过MEGA X软件中的邻位加入法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，结合病原线虫形态学特征明确待鉴定线虫的种类。

1.2.4　室内毒杀活性测定

挑取根结线虫单卵置于10 mL无菌水中28 ℃培养3 d，获取J2s；化学农药按有效成分用无菌水稀释成8个质量浓度梯度的药液（表1），用移液枪混匀后吸取2 mL药液加入直径35 mm培养皿中制作含药梯度平板，每个梯度挑取30条左右活跃的根结线虫2龄幼虫，置于28 ℃恒温培养箱中培养24 h和72 h取出，在体视显微镜下观察并记录线虫死亡数。同时，将处理24 h和72 h的线虫用清水复苏24 h，再次于体式显微镜下检查并记录线虫活虫数和死虫数，2 mL无菌水培养作为空白对照，每个处理3次重复，计算线虫的毒力回归方程、EC₅₀值和相关系数。

\mathrm{校正}\mathrm{死亡}\mathrm{率}=\frac{\mathrm{处理}\mathrm{组死}\mathrm{亡率}-\mathrm{对照}\mathrm{组死}\mathrm{亡率}}{\mathrm{1}-\mathrm{对照}\mathrm{组死}\mathrm{亡率}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

1.2.5　田间防效测定

选取根结线虫病发生程度中等的设施大棚进行田间试验，试验设置5个处理，分别为41.7%氟吡菌酰胺SC、11%阿维·噻唑膦GR、5%阿维菌素EC、20%噻唑膦EW以及空白对照，每个处理3个小区，共计15个小区，每个小区70.2 m²，小区随机排列。杀线剂按照厂家推荐剂量（41.7%氟吡菌酰胺SC 0.03 mL·株^-1，5%阿维菌素EC 225 mL·hm^-2，11%阿维·噻唑膦GR 22 500 g·hm^-2，20%噻唑膦EW 12 000 mL·hm^-2）和使用方法施用，41.7%氟吡菌酰胺SC于丝瓜定植后20 d施用1次；11%阿维·噻唑膦GR定植前施用于土壤中；5%阿维菌素EC于丝瓜定植后20 d施用1次，之后每隔45 d施用1次，连用3次；20%噻唑膦EW于丝瓜定植后20 d施用1次，之后每隔45 d施用1次，连用3次；其他田间管理一致，于丝瓜拉秧时进行J2s和根结指数的测定并计算防效。丝瓜定植时间为2023年3月14日，拉秧时间为2023年9月28日。

J2s测定：在丝瓜定植前和丝瓜拉秧时，每个小区采用随机五点取样法分别收集土壤和丝瓜根际土1 kg，通过贝曼式漏斗法分离土壤线虫并进行镜检。

根结指数测定及分级标准：丝瓜拉秧时，每个小区随机测定6株丝瓜根结指数。

0级：无根结；1级：仅有少量根结，占全根系的11%以下；3级：根结明显，占全根系的11%~25%；5级：根结特别明显，占全根系的26%~50%；7级：根结数量很多，占全根系的51%~75%；9级：根结数量特多，占全根系的75%以上^［22］。

J2s相对防效＝1－（处理前清水对照线虫密度×处理后小区线虫密度）/（处理后清水对照线虫密度×处理前小区线虫密度）×100%

根结指数防治效果＝（清水对照根结指数－处理后根结指数）/清水对照根结指数×100%

1.3　数据与分析

采用 Microsoft Excel 2021和DPS7.05 进行数据统计和分析，将线虫校正死亡率转换为机率值（y），浓度换算成浓度对数（x），利用 DPS 软件建立毒力回归方程 y＝ax＋b，计算各药剂的 EC₅₀。使用邓肯氏新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1　设施丝瓜根结线虫病田间症状

丝瓜根结线虫病发病初期地上部症状不明显，地下部丝瓜根系出现轻微根结，随着病情发展，地上部主要表现为生长缓慢，叶片黄化，与其它病害或生理性损伤不好区分；地下部症状明显，受害根系产生明显根结（虫瘿），发病严重时一条根系上长满根结，发病后期受害根系腐烂中空。

2.2　致病性测定

处理组丝瓜苗发病率达100%，根结症状明显（图2 b），且与设施丝瓜自然发病症状一致；空白对照不发病，丝瓜苗长势良好（图2 a）。对处理组发病植株根部进行病原物再分离，得到与接种线虫形态特征一致的病原线虫。

2.3　病原物形态特征和胚胎发育不同阶段特征

J2s虫体细小，约312.85~410.71 μm，蠕虫形，头冠前端平宽，头部无突出与缢缩，有不完整环纹；口针纤细，锥部与杆部中等宽，基部缢缩且向后倾斜；尾有透明区，透明区短或不显著（图3 a-c）。雌成虫乳白色（图3 e），虫体膨大呈梨圆形，652.08~926.63 μm，具突出颈，头架弱，口针纤细，口针基部球球形或椭圆形，中食道球和食道腺发达（图3 f-g）；雌成虫会阴花纹呈圆形，背弓高，线纹波浪形，在侧面分叉，侧线不明显，顶部平滑，线纹弯向阴门，尾端区无刻点（图3 d）。

2.4　分子生物学鉴定

以供试线虫基因组DNA为模板，利用引物rDNA-ITS和28S rDNA D2D3扩增，均能扩增到相应目的片段，分别为629 bp和766 bp。将获得的2段序列与NCBI数据库中已有序列作同源性比对，结果显示均与南方根结线虫M. incognita同源性达99%以上；将该2段序列上传至NCBI Genebank，得到序列号分别为OQ780280和OQ780281；利用MEGA X Neighbor-Joining构建其系统发育树，结果表明这2段序列均与M. incognita聚为一支（图4-图5）经形态学和分子生物学鉴定，明确赣南地区设施丝瓜根结线虫种为M. incognita。

2.5　室内毒杀活性测定

试验24 h后（表2），CK处理J2s无死亡现象，4种杀线剂对J2s均有一定程度的毒杀效果。5%阿维菌素乳油毒杀活性最强，EC₅₀值为1.106 5 mg·L^-1，前3个浓度梯度校正死亡率平均值达100%；其次为41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂，EC₅₀值为1.891 9 mg·L^-1。试验72 h后（表3），CK处理J2s平均死亡率为10%，5%阿维菌素乳油毒杀活性最强，前7个浓度梯度校正死亡率平均值达100%；41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂 EC₅₀值为0.355 2 mg·L^-1。

2.6　田间防效

经杀线剂处理后土壤中J2s数量及根结指数如表4所示。所有杀线剂处理对土壤中线虫数量和根结数均有一定的抑制作用，就杀线剂对土壤中J2s减退效果来看，41.7%氟吡菌酰胺SC效果最好，相对防效为77.99%；其次是5%阿维菌素EC，相对防效为70.49%，这2种杀线剂均显著高于20%噻唑膦EW和11%阿维·噻唑膦颗粒剂效果。就杀线剂对作物根结指数影响及其防治效果来看，所有杀线剂处理根结指数均显著低于清水对照，41.7%氟吡菌酰胺SC效果最好，防治效果为68.41%，显著高于5%阿维菌素EC和11%阿维·噻唑膦GR，20%噻唑膦EW防治效果最差，为47.83%。

3 讨论

根结线虫种类的准确鉴定是防治作物根结线虫病的基础和关键，结合形态学和DNA分子生物学技术进行种类鉴定是比较科学有效的手段^［23］。传统形态学鉴定主要是根据线虫不同发育阶段如二龄幼虫、雌虫和成虫等的体态特征进行判断^［24］，其中会阴花纹是鉴定根结线虫属的一个重要形态特征^［25］，该研究观察到的雌虫会阴花纹呈圆形，线纹波浪形，背弓高，没有明显的侧线，顶部平滑，与已报道的南方根结线虫形态特征相似^［26-28］。但是有报道表明根结线虫雌虫会阴花纹存在种内变异现象和同种根结线虫会阴花纹差异较大现象^［29］，而且由于环境条件和寄主差异，同种根结线虫形态特征也可能会有较大变化，不同种间根结线虫形态测量值存在严重重叠现象，根结线虫相似性非常高，单纯靠传统形态学鉴定很可能出现判断错误情况^［30］，所以结合基于DNA分子生物学技术鉴定无疑能更精准鉴定根结线虫种类^［31］。

目前对于根结线虫的防治无论是物理防治、生物防治还是农业防治都存在见效慢、成本大、实施困难等问题，化学防治依然是第一选择^［14］。有研究报道41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂对根结线虫病田间防效在内蒙古和济宁分别为65.09%~81.88%和60.8%~64.4%；20%和30%噻唑膦颗粒剂在对根结线虫的田间防效分别为64.7%和80%，1.8%阿维菌素乳油对根结线虫的防效为64.09%^{［18，32］}，这些结论表明不同药剂或同种药剂在不同地域对根结线虫的防治效果有明显差异，这可能与地域、施药方式、人为因素以及线虫种类有关。该研究表明，5%阿维菌素乳油对M. incognita的室内毒杀活性最强，处理24 h和72 h后，7.81 mg·L^-1和3.91 mg·L^-1阿维菌素乳油对M. incognita的毒杀活性均达到100%，这个结论与林小漫等^［17］的研究结果一致，在大田试验中，其对根结线虫的防治效果要差于氟吡菌酰胺，推测可能与阿维菌素的理化性质、作用机制和工艺流程有关，具体原因需要进一步的试验研究探索，但林小漫等研究表明阿维菌素EC对柑橘根结线虫的田间防效一般，这可能与线虫种类以及施药次数有关；20%噻唑膦EC防效较差，这与林小漫等研究结果不同，推测可能是与人为因素、剂型及线虫种类有关；室内结果与田间防效结论有时相差较大，推测与席先梅等^［18］、王淑霞等^［32］结论相似，即可能与地域、施药方式、人为因素以及线虫种类有关，具体差异较大原因需要进一步的试验研究探索；41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂 25 mg·L^-1对M. incognita的24 h室内校正死亡率为96.67%，EC₅₀值为1.891 9 mg·L^-1，72 h后3.13 mg·L^-1 41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂的室内校正死亡率为100%，这与现有研究结论基本相符^［33］。

4 结论

该研究以形态学观察结合基于rDNA-ITS和28S rDNA D2D3序列分析的分子生物学鉴定，明确赣南地区设施丝瓜根结线虫为M. incognita；通过进一步的室内毒杀活性测定和田间防效试验明确5%阿维菌素EC和41.7%氟吡菌酰胺SC对其具有高毒力活性和较好的田间防效，为赣南地区设施丝瓜根结线虫病的防控奠定了理论依据。

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基金资助

江西南方地区设施蔬菜提质增效关键技术研究与示范(20212BBF61004)

赣南设施蔬菜土壤根结线虫鉴定及综合防治技术研究(赣市科发［2019］60号)

油菜饼粕对设施蔬菜根结线虫的防控应用研究(赣市科发［2023］44号)

赣南地方丝瓜主要农艺性状研究(赣市科院字［2022］20号)