青脆李褐腐病原菌鉴定及其防治药剂的筛选

Identification of pathogen causing brown rot of green crispy plum and screen of pesticide for protection

摘要

目的 明确青脆李褐腐病病原菌、分析病原菌致病力并筛选防治药剂，为青脆李褐腐病防控提供理论依据。 方法 按照柯赫氏法则分离纯化病原菌，通过形态学观察，多基因位点联合分析鉴定病原菌，通过致病性测定及聚类分析研究病原菌致病力差异。 结果 分离获得青脆李褐腐病原菌8株，形态学鉴定显示8株菌为Monilinia spp.，构建系统发育树鉴定8株菌均为Monilinia fructicola；致病力测定显示，病原菌株病斑直径统计学差异显著，接种LZ⁃7果实病斑直径最小（16.950 0±1.102 8 mm），接种LZ⁃13果实病斑直径最大（31.405 0±1.767 5 mm）；聚类分析将8株病原菌致病力分为3组：LZ⁃7为弱致病力菌株、LZ⁃2/8/3/16/14为中致病力菌株、LZ10/13为强致病力菌株。选取致病力最强菌株LZ⁃13进行化学防治药剂筛选，按照EC₅₀由低到高排依次为代森锰锌<戊唑醇<甲基硫菌灵<苯甲·中生<腐霉利。 结论 青脆李褐腐病病原菌为Monilinia fructicola，同种Monilinia fructicola病原菌不同菌株间存在致病力差异，代森锰锌及戊唑醇室内毒力EC₅₀均小于1 μg·mL^-1。

Abstract

Objective Identify and assess the virulence of pathogens causing brown rot of green crisp plum， screen pesticide for protection，so as to provide a theoretical basis for the fungicide control of brown rot of green crisp plum. Method The pathogens were isolated and purified according to Koch's rule. The pathogens were identified through morphological observation， combined multi-locus analysis，and their pathogenicity differences were studied using virulence determination and cluster analysis. Result Eight pathogens of green crisp plum brown rot were isolated. Morphological identification showed that eight strains were Monilinia spp. Phylogenetic tree showed that all the eight strains were Monilinia fructicola. Virulence analyze showed that there were significant differences in lesion size among pathogenic strains.The brown rot lesion diameter was smallest （16.950 0±1.102 8 mm） in fruits inoculated with strain LZ-7 and largest （31.405 0±1.767 5 mm） in fruits inoculated with strain LZ-13. Cluster analysis grouped the eight strains into three virulence categories： LZ-7 was classified as a weak virulence group， LZ-2/8/3/16/14 were classified as moderate virulence groups， and LZ-10/13 were classified as high virulence groups. The most pathogenic strain LZ-13 was selected for screening fungicide control agents. Based on EC₅₀ values， the efficacy order from highest to lowest was mancozeb<tebuconazole<thiabendazole<difenoconazole·zhongshengmycin<putrescine. Conclusion This study identified the pathogen causing brown rot in green crisp plums as Monilinia fructicola， and significant differences in virulence were observed among the strains. Laboratory toxicity tests showed that the EC₅₀ values for mancozeb and tebuconazole were less than 1 μg·mL^-1.

Graphical abstract

关键词

青脆李 / 褐腐病 / 病原菌 / 致病力

Key words

Green crisp plum / Brown rot / Pathogen / Virulence

青脆李为蔷薇科李属植物（Prunus salicina Lindl），大规模种植于四川、贵州和云南等西南高山地区^［1］，口感甜脆爽口，香味独特，富含多酚、多糖、氨基酸及维生素等多种营养物质^［2-3］，是广受西南区消费者欢迎的李果实品种。李果实采摘后呼吸作用强，生理代谢快，采后贮藏期褐腐病病害的发生广泛^［4］，果实感染褐腐病原菌后在果面上形成褐色圆形病斑，病斑处果肉软化，可扩及全果并在果面生出同心圆排列的白色霉层^［5］。

随着青脆李种植规模的扩大，果实褐腐病发病率日渐升高，严重影响青脆李的产量和品质，该病害已经成为制约青脆李产业发展的一大障碍。国内外研究显示不同地区不同品种李果实褐腐病原不尽相同。Monilinia fructicola，M. mumecola、M. polystroma、M. yunnanensis分别引起欧李、巫山脆李、桃形李、矮甜李等李果实褐腐病害^［6-10］，而青脆李褐腐病病原研究尚未见报道，仅2023年重庆报道青脆李果实膨大期产生不规则浅褐色凹陷病斑，鉴定病原菌为交链格孢菌Alternaria alternata^［1］，其病理形态与李褐腐病存在差异。

为明确青脆李褐腐病病原菌，研究以西南地区褐腐青脆李为材料，进行病原菌分离、致病性鉴定、形态学特征观鉴定、多基因序列系统发育分析，病原菌致病力差异及防治药剂筛选；旨在为青脆李产区新发褐腐病防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　实验材料

供试材料：2021和2022年的8月~10月从贵州修文、贵州沿河，四川成都、四川彭州青脆李种植基地采集大小均一果实，选取褐腐病典型病症果实用于实验。

供试仪器：高速冷冻离心机（Microfuge 20R），美国贝克曼库尔特有限公司；光学显微镜（Olympus CX21），日本奥林巴斯有限公司；桌上式洁净工作台（VD-850），上海苏净实业有限公司；高压蒸汽灭菌锅（LDZM-60L），上海申安医疗器械厂；电热恒温培养箱（DH5000BII），天津市泰斯特仪器有限公司；综合稳定性实验箱（YP-150GSP），北京恒泰丰科实验设备有限公司；PCR仪（T100TMThermal Cycler），美国伯乐有限公司；

供试试剂：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar， PDA），上海博微生物科技有限公司；高效植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker-DL2000，生工生物工程（上海）股份有限公司；核酸染料，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2　试验方法

1.2.1　病原菌的分离、纯化、鉴定

青脆李果实依次放入1%次氯酸钠、75%乙醇中浸泡1分钟，无菌水洗净表面；置于超净工作台吹干，无菌手术刀切下果实病健交界处组织，放置于PDA培养基中，将培养基置于恒温培养箱28 ℃培养3 d，挑取菌落单菌丝传代，经单孢纯化后在PDA上进行培养和形态观察培养^［11］。

病原菌的致病性鉴定根据柯赫氏法则进行。依次用1%次氯酸钠、75%乙醇对健康青脆李果实表面消毒，无菌水清洗后置于超净工作台吹干，有伤/无伤接种5 mm×5 mm菌饼于果皮中央，5 mm×5 mm无菌PDA作为空白对照；实验果实恒温（28 ℃）恒湿（70%）培养，5 d后记录发病情况；果实出现典型病原后再次分离发病部位病原菌，并与接种病原菌进行形态学比较；每处理3个平行样本^［11］。

1.2.2　病原菌鉴定

形态学鉴定：取5 mm×5 mm菌块，接种于PDA平板培养基中央，置于28 ℃培养箱中恒温培养3~5 d，观察菌落特征；28 ℃恒温培养7~14 d，光学显微镜下观察病原菌菌丝与分生孢子形态，根据形态学特征进行初步鉴定^［12］。

分子生物学鉴定：提取病原菌基因组DNA为模板，扩增ITS（ITS1F 5´-TCCGTAGGTGAAC-CTGCGG-3´/ITS4 5´-TCCTCCGCTTATTGA-TATGC-3´）、β-tubulin （BT2a 5’-GGTAACC-AAACGGTGCTGCTTTC-3/BT2b 5´- 5’-AC-CCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’）、EF-1α基因（EF1-728F 5´-CATCGAGAAGTTCGA-GAAGG-3´/EF1-986R 5´-TACTTGAAGGA-ACCCTTACC-3´），扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。通过NCBI（National Center for Biotechnology Information）多序列比对工具BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）获得与测序结果同源性90%以上的基因序列，使用MEGA 11进行序列比对^［13］，在PhyloSuite中串联不同基因序列文件，采用MrBayes多基因联合构建贝叶斯树^［14］。

1.2.3　病害菌致病性鉴定

依次用1%次氯酸钠、75%乙醇对健康青脆李果实表面消毒，无菌水清洗后置于超净工作台吹干，有伤接种5 mm×5 mm菌饼于果皮中央，5 mm×5 mm无菌PDA作为空白对照；实验果实恒温（28 ℃）恒湿（70%）培养5 d，十字交叉法测量病斑直径；每试验组3个平行样本^［11］。

1.2.4　杀菌剂室内毒力测定

参照曾晴等^［8］的方法，在对不同杀菌剂浓度筛选结果基础上，确定药剂室内毒力实验初始浓度，甲基硫菌灵和腐霉利初始PDA平板终浓度为7.2 μg·ml^-1，依次2倍稀释至终浓度为3.6 μg·ml^-1、1.8 μg·ml^-1、0.9 μg·ml^-1及0.45 μg·ml^-1； 戊唑醇初始PDA平板终浓度为9.0 μg·ml^-1、依次2倍稀释至终浓度为4.5 μg·ml^-1、2.25 μg·ml^-1、1.125 μg·ml^-1及0.562 5 μg·ml^-1；苯甲·中生初始PDA平板终浓度为7. μg·ml^-1、依次2倍稀释至终浓度为3.5 μg·ml^-1、1.75 μg·ml^-1、0.875 μg·ml^-1及0.437 5 μg·ml^-1；代森锰锌初始PDA平板终浓度为2.15 μg·ml^-1、依次5倍稀释至PDA终浓度为0.43 μg·ml^-1、0.086 μg·ml^-1、0.017 2 μg·ml^-1及0.003 44 μg·ml^-1；分别在PDA培养基中央加入病原菌菌饼（5 mm×5 mm），培养3 d后用十字交叉法测量空白培养基及含药培养基菌落直径，每实验重复3次，计算抑菌率。

\mathrm{抑菌}\mathrm{率}=\frac{\mathrm{空白}\mathrm{培养}\mathrm{基菌}\mathrm{落直}\mathrm{径}-\mathrm{含药}\mathrm{培养}\mathrm{基菌}\mathrm{落直}\mathrm{径}}{\mathrm{空白}\mathrm{培养}\mathrm{基菌}\mathrm{落直}\mathrm{径}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}

1.3　数据分析

试验数据使用IBM SPSS statistics 25软件（International Business Machiness Corporation）进行统计学分析，采用Ducan氏新复极差法进行多重比较^［15］，采用组间连接法进行系统聚类分析^［16］。

2 结果与分析

2.1　病原菌的分离鉴定

采用组织分离法从青脆李褐腐病果上共分离获得36株菌株，按照柯赫氏法则通过反接验证致病性，其中8株菌有伤接种5 d后实验果实出现典型李褐腐病症状（图1）：果实表面褐色伴有白色菌丝，可见水渍（图1A2-图1A9），果肉呈黄褐色（图1B2-图1B9），有腐败气味，继续培养褐斑可扩散至全果引起软烂；对接种后发病果实病健交界处组织进行病原菌再分离，获得与接种菌株菌落形态一致的真菌；菌株LZ-2，LZ-3，LZ-7，LZ-8，LZ-10，LZ-13，LZ-14，LZ-16鉴定为青脆李褐腐病病原菌。

形态学观察显示：LZ-2/10/13菌株菌落表面干燥，早期絮状灰白色菌丝，后期菌落中央表面菌丝呈浅黄绿色，并向周围扩展（图2A1）；LZ-3菌株菌落呈致密灰白色（图2A2），后期菌落表面可见黑灰色堆积孢子；LZ-7/8/16菌株早期菌落呈灰白色絮状，表面干燥，后期菌落表面可见灰黄色孢子堆积，堆积斑块湿润（图2A3）；LZ-14菌株菌落灰黄色，后期菌落表面可见孢子堆积同心轮纹圆环（图2A4）；镜下均可见黄褐色孢子梗，顶端串生分生孢子（图2C1-图2C4），单孢圆形或柠檬形（图2B1-图2B4），直径4~6 μm×4~10 μm。青脆李褐腐病8株病原菌初步鉴定为Monilinia spp.。

Monilinia spp.是引起褐腐病的重要病害，为准确鉴定青脆李褐腐病病原菌，提取菌株基因组DNA作为模板，扩增ITS，β-tubulin及EF-1α基因序列，以M. laxa CBS 29931、M. fructigena CBS101499作为外群，构建多基因联合系统发育树（图3）。8株病原菌株在发育树中100%与M. fructicola聚为一支，可认为8株病原菌均为M. fructicola。菌株LZ-16与其他菌株亲缘性较远，LZ-13与M. fructicola M141/IMK101/IMK277亲缘性近，LZ-2/3/7/8/10/14与M. fructicola 2014FC51亲缘性性近，但LZ-2/3/7/8/10/14为不同菌株。

2.2　病原菌致病性分析

为了解青脆李8株病原菌致病力是否存在差异，采用8株病原菌有伤接种健康青脆李果实，接种5 d后测量病斑直径，由试验结果可知，8株菌果实病斑直径在P<0.05水平存在统计学差异（表1）。

根据分析结果可知，LZ-2/14/16/与LZ-10，LZ-8/LZ-3差异均不显著，但LZ-10与LZ-8/LZ-3差异显著（表1），为进一步分析不同菌株致病力差异分化，通过组间连接法对样本进行系统聚类分析，将8株病原菌根据致病力强弱分为3组（图4）：弱致病力菌群1株（LZ-7）、中致病力菌群5株（LZ-2/8/3/16/14）、强致病力菌群2株（LZ-10/13）。

2.3　贵州青脆李褐腐病病原菌防治药剂筛选

选取致病力最强菌株LZ-13进行药剂筛选，5种杀菌剂处理LZ-13抑菌效果列于表2，按照EC₅₀由低到高排序依次为代森锰锌<戊唑醇<甲基硫菌灵<苯甲·中生<腐霉利，其中代森锰锌（EC₅₀=0.027 μg·ml^-1）及戊唑醇（EC₅₀=0.95 μg·ml^-1）EC₅₀均小于1 μg·ml^-1。

3 讨论

褐腐病是一种世界性的果实采后真菌病害，主要发生于核果类和仁果类果树。褐腐病可侵染花、叶及幼果，随果实的成熟度增加病害加重，具有潜伏性^［17-18］。采后在流通、储存条件有利于病害发生时，从果实损伤裂缝处侵入，在贮藏期间引起果实大量腐烂^［19］。

青脆李是西南地区广受欢迎的李果实品种，近年来在西南地区种植规模日益扩大，青脆李果实褐腐病已成为青脆李生产上的突出问题，研究通过致病菌分离获得8株病原菌，通过形态学鉴定及多基因联合分析，将病原菌鉴定至种，8株病原菌均为M. fructicola，过往文献报道M. fructicola，M. mumecola、M. polystroma、M. yunnanensis引起李果实褐腐病害^［6-10］，研究结果与前人相似。

链核盘菌Monilinia spp.的几种真菌是引起褐腐病的重要病害，松散链核盘菌M. laxa、果生链核盘菌M. fructigena和实生链核盘菌M. fructicola是全球范围内流行的三种最主要引起褐腐病的致病真菌^［20-22］，Monilinia spp.具有多种感染寄主植物的毒力机制：包括毒素、细胞死亡因子、及细胞壁降解酶等，其不同种间存在宿主选择及致病力差异^［23］；致病性测定显示，8株贵州地区青脆李褐腐病原菌株病斑直径差异显著，聚类分析将8株菌致病力强弱分为强中弱3组，研究中8株菌致病力差异与菌株亲缘性不存在相关性，其由何种机制介导，尚待进一步研究。

选取致病力最强菌株LZ-13进行化学防治药剂筛选，5种化学药剂按照EC₅₀由低到高排依次为代森锰锌<戊唑醇<甲基硫菌灵<苯甲·中生<腐霉利，其中代森锰锌（EC₅₀=0.027 μg·mL^-1）及戊唑醇（EC₅₀=0.95 μg·mL^-1）EC₅₀均小于1 μg·mL。周芳等^［24］2014年以10种杀菌剂为试材，以欧李褐腐病菌为研究对象，筛选出430g/L戊唑醇、70%甲基硫菌、50%腐霉利对欧李褐腐病菌菌丝生长的半致死浓度EC₅₀均低于0.700 μg·ml^-1，与研究结果基本一致。M. fructicola 除引起李褐腐病，还是桃褐腐病的主要病原菌，我国目前有效登记防治桃褐腐病的农药有效成分有腈苯唑、腈菌唑、戊菌唑、异菌脲、氟吡菌酰胺·肟菌酯、吡唑醚菌酯·啶酰菌胺、氯氟醚菌唑·吡唑醚菌酯、吡唑醚菌酯·甲基硫菌灵、吡唑醚菌酯·氟唑菌酰胺等，未来也可参考桃褐腐病防治登记药剂进行田间防控药剂筛选。

4 结论

研究鉴定青脆李褐腐病病原菌为M. fructicola；8株病原菌接种果实病斑直径统计学差异显著：LZ-7为弱致病力菌群、LZ-2/8/3/16/14为中致病力菌群5株、LZ10/13为强致病力菌群2株；化学防治药剂筛选结果显示，代森锰锌（EC₅₀=0.027 μg·mL^-1）及戊唑醇（EC₅₀=0.95 μg·mL^-1）EC₅₀均小于1 μg·mL^-1，或可用于田间防控。

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基金资助

贵州省科技计划项目(黔科中引地［2020］4018号)

贵阳学院研究生科研基金（GYU-YJS［2021］-44）