‘玉露香梨’生长素烟酰胺合成酶基因GH3克隆及其生物信息特征研究

Cloning and bioinformatics analysis of the auxin nicotinamide synthase genes GH3in ‘Yuluxiangli’

摘要

目的 ‘玉露香梨’果实萼片宿存严重降低其商品价值，筛选并鉴定其果实萼片发育关键基因，可为从分子水平培育萼片脱落的梨果实提供参考基因。 方法 以棚架栽培的‘玉露香梨’为试材，结合前期BSA基因定位测序数据，对候选基因表达特征进行验证、克隆并分析2个生长素酰胺合成酶基因GH3家族生物信息特征。 结果 基因PbGH3.3（Pbr007550）和PbGH3.4（Pbr030571）在萼片的表达量排名第二；PbGH3.3和PbGH3.4 CDS长度均为1806 bp，编码601个氨基酸，其中二者存在7个氨基酸序列的差异，编码的蛋白PbGH3.3和PbGH3.4序列与苹果MdGH3.1的同源性最高；属于不稳定性蛋白，无信号肽的存在，定位于细胞质；利用NCBI网站CCD工具分析发现均具有GH3蛋白家族的GH3 superfamliy保守结构域，蛋白质三级建模后发现为GH3.1 AUXIN缀合酶，涉及生长素稳态，属于GH3蛋白家族。STRING互作网络蛋白成员GO和KEGG功能富集分析表明PbGH3.3参与植物激素尤其是生长素信号通路，推测PbGH3.3和PbGH3.4可能在‘玉露香梨’果实萼片脱落中通过IAA信号通路发挥生物学功能。

Abstract

Objective The persistent sepals of ‘Yuluxiangli’ pear fruits significantly reduces its commercial value. This study aimed to screen and identify key genes involved in sepal development to provide reference genes for molecular breeding of pear fruits with sepal abscission at the molecular level. Method ‘Yuluxiangli’ cultivated in vertical trellis was used as tested material.Based on previous BSA gene mapping and sequencing data， the expression characteristics of candidate genes were verified， and two auxin-amido synthetase genes， GH3 family， were cloned and analyzed for their bioinformatics characteristics. Result The genes PbGH3.3（Pbr007550）and PbGH3.4 （Pbr030571） ranked second in expression level in the sepals. The CDS lengths of PbGH3.3 and PbGH3.4 were both 1806 bp， encoding 601 amino acids. There were seven amino acid sequence differences between them， and the encoded protein PbGH3.3 and PbGH3.4 showed the highest homology with MdGH3.1 in apple. They were unstable proteins without signal peptides and were located in the cytoplasm；Analysis using the CCD tool on the NCBI website revealed that they both possessed the conserved domain GH3 superfamily of GH3 protein family. Protein tertiary structure modeling showed that they were GH3.1 Auxin amido synthetase involved in auxin homeostasis， belonging to the GH3 protein family. Functional enrichment analysis of GO and KEGG pathways of STRING protein interaction network members indicated that PbGH3.3 is involved in the plant hormones， especially auxin signaling pathway. Conclusion It was suggested that PbGH3.3 and PbGH3.4 might play a biological roles in the regulating of sepal in ‘Yuluxiangli’ fruits through the IAA signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

梨 / 萼片 / 生长素烟酰胺合成酶 / 基因克隆 / IAA

Key words

Pear / Sepals / Auxin nicotinamide synthase / Gene cloning / IAA

‘玉露香梨’传统分类上属白梨系统，是山西农业大学果树研究所培育而成的‘库尔勒香梨’型中熟红梨品种，分别继承其母本新疆‘库尔勒香梨’、父本‘雪花梨’汁多味甜、皮薄肉细及果个大等优点^［1-2］，同时部分克服了香梨果形不正等缺点，具有抗逆性强、丰产稳产、地域适应性强等优点^［3-5］。‘玉露香梨’2014年被国家农业部确定为梨果树发展主导品种，并于2019年入选中国农业品牌目录，隰县玉露香梨又被农业部选为2023年农业品牌精品培育名单。

根据梨果实成熟时萼片脱宿状态，可将其分为宿萼果和脱萼果^［6］。‘玉露香梨’虽优点众多，但果实萼片存在部分宿存现象。萼片位于花器官的最外层，主要包含上下表皮、维管束和叶肉细胞部分，进化上其为叶的变态器官。萼片发育初期可保护内部结构，减少生殖器官受到外界诸如雨水冲刷及机械损伤的影响^［7］。然而，‘玉露香梨’萼片宿存可致其果形不整齐、表面平整度下降、易生果锈等问题。

植物器官脱落与遗传生理特性、栽培调控技术、环境因子等有关^［8-11］。其中，植物激素生长素在器官脱落中发挥重要作用，如Meir等^［12］报道，当组织内游离生长素（IAA）含量下降到一定阈值后，离区组织（Abscission zone， AZ）对乙烯（ETH）存在的敏感性增加，进而诱导器官开始脱落。在模式植物番茄脱落的研究中，用IAA处理外植体后，生长素烟酰胺合成酶基因（Gretchen Hagen 3， GH3）表达上调，且能诱导外植体开始脱落。以上研究均表明基因GH3是IAA诱导花脱落延迟的有效负调控因子^［13］。本课题组前期利用‘玉露香梨’的双亲‘库尔勒香梨’与‘雪花梨’杂交获得F1萼片脱宿性状分离群体，将构建的萼片脱落与宿存的极端混池群体进行全基因组集群分离测序（Whole genome bulked segregation analysis， DNA-BSA），定位到与其果实萼片脱落宿存关联的基因GH3^［14］，在‘库尔勒香梨’数字表达图谱数据中发现GH3在脱落萼片内表达上调，进一步表明基因GH3可能参与梨果实萼片脱落过程^［15］。

基于此，本研究以棚架式栽培的‘玉露香梨’为研究材料，基于前期课题组萼片脱落宿存极端混池分析测序技术，成功定位到基因GH3，该基因参与梨果实萼片发育。为进一步研究此基因家族成员功能，对筛选的2个GH3家族成员的表达量进行验证。同时，对候选的2个家族成员基因进行克隆，并分析其生物信息学特征，为从分子水平研究‘玉露香梨’萼片脱落提供参考基因。

1 材料与方法

1.1　试验材料

材料来源于山西省晋中市太谷区的山西农业大学果树研究所（N37°21'17"，E112°30'12"）。‘玉露香梨’的栽培模式为双臂平行式。

主要试剂：克隆酶试剂盒Taq DNA、 DNA分子Marker-DL2000、反转录酶试剂盒PrimeScript™ RT reagent Kit购于TaKaRa（中国）公司，凝胶回收试剂盒Simgen、荧光定量PCR实验用品与卡那霉素分别选自新景生物试剂开发有限（杭州）公司，山西睿然科技有限公司和北京美亿美生物技术有限公司。qRT-PCR引物合成和DNA序列测序均由生物工程技术有限公司（上海）完成。

载体与菌株：大肠杆菌菌株（E.coli）DH5α、载体pMD-19T来自TaKaRa。

1.2　试验方法

试验处理：选取树势相近，树体健壮的‘玉露香梨’，于4月上旬盛花初期，上午9时，使用浓度为1000 mg·L^-1生长延缓剂PP₃₃₃和蒸馏水，一次性喷施至整朵花全湿、有药液滴落为止，用于诱导‘玉露香梨’果实萼片脱落。实验处理2周后选取3个长势一致的‘玉露香梨’的枝条，作为3次生物学重复，脱萼与宿存果的果皮、果肉、萼筒离区组织以及脱落幼果前的花瓣、萼片、叶片、叶芽的单个组织分别收集，作为RNA提取材料。

RNA的提取：采用实验室改良成熟的CTAB法分别提取梨不同组织部位样品的总RNA。

cDNA的合成：根据试剂盒说明操作手册，使用TaKaRa公司的PrimeScript™ RT reagent Kit合成cDNA，去除核基因组DNA反应。

qRT-PCR检测方法：基于Primer Premier 5.0软件，参考中国白梨基因组（http：//gigadb.org/search/new？keyword=Pyrus+bretschneideri+），设计GH3引物，内参基因为ACTIN（KT943411.1），对‘玉露香梨’萼筒的定量用cDNA校准，引物序列见表1。

基于ChamQTMSYBR®qPCR Master Mix的三步法扩增，同时采用Light Cycler 96进行实时荧光定量检测，3次重复，反应结束后分析溶解曲线并评估引物的特异性。反应体系为20.0 μL：包含2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，Forward Primer（10uM）0.6 μL，Forward Primer（10uM）0.6 μL，cDNA 2.0 μL，Nuclease-free Water 6.8 μL。

生长素酰胺合成酶基因PbGH3的克隆：引物见表2，按照试剂盒说明分别进行目的基因扩增、回收纯化片段、载体构建、转化并进行测序验证。

基因PbGH3.3与PbGH3.4的生物信息学分析：首先，在线分析GH3蛋白序列的理化性质（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.Htm）；其次，预测蛋白GH3结构（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/）；随后，分析GH3蛋白结构域（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），结合DNAMAN软件，进行多序列比对（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）；之后，利用SOPMA（http：//meta-database.org/wiki/SOPMA）和Interactive（http：//swissmodel.expasy.org/interactive）预测GH3蛋白质二、三级结构；然后，分别利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和PSORT Predition（http：//psort1.hgc.jp/form.html）进行跨膜结构、信号肽及亚细胞定位预测与分析；最后，基于STRING进行蛋白网络互作分析（https：//version-12-0.string-db.org/）

2 结果与分析

2.1　生长素烟酰胺合成酶基因GH3在‘玉露香梨’中的表达特性分析

‘玉露香梨’基因PbGH3.3和PbGH3.4染色体定位发现均位于Chr5（图1A）。基因表达分析结果发现在叶芽组织中的表达量显著高于其他组织内，在萼片中表达量次之，除‘玉露香梨’宿萼果果肉、宿萼果果皮和脱萼萼筒的基因表达量差异不显著外，其余组织表达差异均显著（图1B）。基因PbGH3.4在‘玉露香梨’各个组织部位表达由高到低的顺序依次为：脱萼果果肉>萼片>脱萼萼筒>宿萼果果皮>叶芽>花瓣>宿萼果果肉>脱萼果果皮>宿萼萼筒>叶片，其中在脱萼果果肉中表达最高。与此同时，与其它各组织比较，均存在显著差异（图1C）。此外，发现‘玉露香梨’基因PbGH3.3和PbGH3.4二者均在叶片组织中表达最低。对基因PbGH3.3在砀山酥梨组织表达分析发现，其在梨各个组织及果实发育不同时期中均有表达（图1D）。

2.2　‘玉露香梨’PbGH3家族成员cDNA全长序列的克隆分析

提取梨果实萼片离区组织（图2A）RNA，反转录后并基于T-A克隆技术（图2B），成功克隆出2个家族成员PbGH3.3和PbGH3.4。以‘玉露香梨’萼片离区组织为材料提取并反转录得到cDNA，经PCR扩增（图2C）检测测序，获得目的基因的全长CDS，长度均为1806 bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。编码蛋白分析发现存在7个氨基酸序列差异，如在1081 bp处存在G/A变异而导致编码的氨基酸不同（图2D和2E）。

2.3　‘玉露香梨’蛋白PbGH3.3和PbGH3.4进化树构建结果分析

PbGH3.3蛋白与苹果（XP_008373075.1）的同源性为97.84%，与甜樱桃（XP_021827312.1）的同源性为92.15%，与李（XP_008236406.1）的同源性为91.82%，与桃（XP_007199763.1）的同源性为91.82%，与杏（XP_034228093.1）的同源性为91.65%；PbGH3.4与苹果、甜樱桃、李、桃和月季的相似性分别为97.17%、92.49%、92.49%、92.49%和87.85%。利用MEGA 7.0，PbGH3.3和PbGH3.4蛋白与其他蔷薇科等15种物种的系统进化结果发现‘玉露香梨’PbGH3二者蛋白与苹果MdGH3.1的同源性最高（图3B）。

2.4　‘玉露香梨’PbGH3.3和PbGH3.4蛋白特性分析

PbGH3.3和PbGH3.4均编码601个氨基酸，蛋白分子式均为C₅₃₁₉H₈₈₃₄N₁₈₀₆O₂₁₇₈S₅₂₀，相对分子质量均是14.96 kDa，等电点相同为4.90，同时编码氨基酸内的负电荷残基（Asp+Glu）和正电荷的残基（Arg+Lys）均为0。此外，PbGH3.3和PbGH3.4蛋白的半衰期均为10 h，表现为不稳定，而蛋白质不稳定性指数（II）、脂肪指数和亲水性的平均值（GRAVY）分别为43.33与54.41、86.96与24.75、-0.237与0.916，其中前者蛋白为亲水性，后者则为疏水性。

PbGH3.3与PbGH3.4主要分别由37.10%与38.27%的α-螺旋、6.32%与5.16%的β-折叠、42.26%与41.93%的无规则卷曲以及14.31%与4.64%的延伸链组成（图4A和4B）。蛋白质结构功能域预测其保守结构域发现，二者蛋白结构域中均具有GH3蛋白家族的GH3 super family保守结构域（图4C和4D）。

蛋白PbGH3.3无信号肽（图4E），而蛋白PbGH3.4存在信号肽（Sec/SPI）的可能性为0.000 6（图4F）。PbGH3.3和PbGH3.4蛋白定位于细胞质、细胞核、线粒体、过氧化物酶体、内质网、溶酶体的可能性分别为47.8%与45.0%、26.1%与0%、13.0%与10.0%、8.7%与30.0%、4.3%与0%、0%与10.0%。因此，预测二者定位于细胞质的可能性最大。

选取结构相似性最高的VvGH3.1蛋白（吲哚-3-乙酸烟酰胺基合酶）晶体结构（GMQE为84.56%，QMEAN为-1.17）建模（图5A），PbGH3.3和PbGH3.4蛋白质三级建模后发现，两者蛋白均为GH3-1 AUXIN缀合酶（图5B和图5C），二者含有生长素稳态、无多聚体的形成，均具有1xV1N配体（图5D）与1x［（（2S，3R，4R，5R）-5-（6-氨基嘌呤-9-基）-3，4-（双氧化蒽基）氧杂戊基-2-基］2-（1H-吲哚-3-基）磷酸氢乙酯相同配体（图5E），其中前者的V1N.3包括4Å内的19个残基和16种PLIP交互（图5F），后者则有18种PLIP交互（图5G）。

2.5　‘玉露香梨’PbGH3.3蛋白网络互作分析

PbGH3.3全基因组的蛋白互作网络如图6A所示，节点数11，边数24，平均节点度4.36，平均局部聚类系数为0.762，PPI富集P值为1.37×10^-4。对互作基因GO功能分析发现，富集生物学过程前三的通路为激素介导的信号通路（GO：0009755， 4.26e^-5），细胞内信号转导（GO：0035556， 4.6e^-4）和细胞分裂素激活的信号通路（GO：0009736， 4.6e^-4）（图6B）；分子功能富集于酸性氨基酸连接酶活性（GO：0016881， 4.6e^-4）。基因网络互作成员KEGG功能分析富集于植物信号转导通路（map04075， 5.33e^-14）（图6C）。

3 讨论

生长素烟酰胺合成酶基因GH3在早期响应植物生长素信号通路发挥重要功能作用。曾文芳在对不同GH3基因协同控制桃果实各个发育阶段生长素动态平衡的研究中发现，PpGH3.3和PpGH3.4在果实成熟阶段明显表达上调，暗示它们可能参与了桃果实成熟衰老阶段的发育^［16］。根据周苹的研究，GH3.9基因过表达植株中，雄蕊个数比雌蕊少且雄蕊明显偏短，不利于拟南芥的自花授粉，进而影响花器官衰败^［17］。刘妮等研究指出低IAA水平有利于‘砀山酥梨’果实萼片脱落^［4］。本实验‘玉露香梨’基因PbGH3.3在萼片中存在高表达，由于本实验萼片取样处于盛花末期，为梨果实萼片脱落临界期。因此，该时期基因PbGH3.3的高表达，可能诱导其萼片衰老脱落。本实验克隆的‘玉露香梨’基因PbGH3尤其PbGH3.3可能通过负调控IAA通路诱导梨果实萼片脱落。

‘玉露香梨’PbGH3.3和PbGH3.4长度均为1806 bp，二者具有7个氨基酸序列的差异，编码601个氨基酸，进行同源性氨基酸序列对比后发现，与苹果、甜樱桃、李、桃、杏的同源性均在90%以上，表明PbGH3.3和PbGH3.4在进化上比较保守；对编码的蛋白结构域分析后发现PbGH3.3和PbGH3.4具有GH3 superfamily结构域，说明它们属于生长素烟酰胺合成酶类。不同物种基因GH3在序列长度、理化特性存在差异^［18］，但均具有保守的GH3结构域，与Ostrowski等人报道的结果一致，说明GH3蛋白家族在进化上存在保守结构域^［19］。

‘玉露香梨’蛋白PbGH3.3和PbGH3.4无信号肽，说明2个蛋白属于非分泌蛋白；对蛋白的一级结构进行理化性质分析，发现本实验克隆的基因编码蛋白不具稳定性。蛋白质三级建模后发现PbGH3.3和PbGH3.4蛋白为GH3-1 AUXIN缀合酶，与VvGH3的吲哚-3-乙酸酰胺基合酶的晶体结构相似性最高，涉及生长素稳态，与前人研究结果一致，具有生长素结合特性^［20］。

SignalP预测‘玉露香梨’PbGH3.3和PbGH3.4蛋白信号肽功能时，当预测分值大于阈值0.5时，默认为该蛋白含有信号肽；反之，分值小于阈值时，则不具信号肽^［21-22］。‘玉露香梨’的PbGH3.4的生长素烟酰胺蛋白合成酶的蛋白信号肽（Sec/SPI）的预测分值是0.000 6，表明‘玉露香梨’的PbGH3.4序列含有信号肽的可能性极低，不具备蛋白信号指引的功能。说明本实验克隆的‘玉露香梨’PbGH3.3和PbGH3.4基因属于编码生长素烟酰胺合成酶，但无信号肽功能。‘玉露香梨’PbGH3.3蛋白网络互作GO和KEGG功能富集分析表明其可能通过植物激素尤其是生长素信号通路参与梨果实组织的发育。

4 结论

基因PbGH3.3与PbGH3在‘玉露香梨’果实萼片等组织中存在差异表达，成功克隆出2个IAA信号通路关键生长素烟酰胺合成酶基因，明确了生长素酰胺合成酶基因GH3的2个关键基因生物信息特征，均含GH3 superfamily保守结构域，属GH3蛋白家族。本实验可为从生长素信号通路研究‘玉露香梨’萼片的脱落分子机理提供参考基因。基因GH3如何通过IAA通路影响萼片发育的机制有待进行更深入的功能验证。

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基金资助

国家自然科学基金青年基金项目(32102364)