油菜素内酯诱导黑果枸杞对桃蚜的抗性

24-Epibrassinolide induced biochemical response of Lycium ruthenicum and the resistance to Myzus persicae

摘要

目的 24-表油菜素内酯（24-Epibrassinolide，EBR）是一种多羟基植物甾醇类物质，不仅能促进植物生长发育，还可以提高植物抵御生物或非生物胁迫的能力。本研究旨在探究外源EBR诱导黑果枸杞Lycium ruthenicum对桃蚜Myzus persicae的抗虫性，为利用植物自身抗性进行害虫防治提供理论依据。 方法 在室内分别用不同浓度的EBR喷施黑果枸杞幼苗，以喷施蒸馏水作为对照，喷施1 d后接入桃蚜1龄若虫，分别在接虫后6、12及18 d观察记录桃蚜蜕皮次数、各龄若虫数量和繁殖情况，并采集黑果枸杞叶片测定其可溶性蛋白、可溶性糖、单宁、总酚以及黄酮含量的变化。 结果 （1）0.5和1.0 mg·L^-1的EBR诱导黑果枸杞苗木18 d后，使桃蚜M. persicae脱皮次数显著减少，分别为对照的45.5%和56.9%，高龄若虫数量减少，低龄若虫数量增加，日均增长率分别较对照降低51.8%和49.7%，表明喷施EBR后桃蚜若虫发育速度变慢。（2）3个浓度EBR诱导18 d后均使黑果枸杞叶片单宁、总酚以及黄酮含量较对照显著增加，可溶性蛋白和可溶性糖含量增加。（3）枸杞桃蚜的产仔量和脱皮次数与EBR诱导后黑果枸杞叶片总酚和单宁含量的增加呈负相关，与蛋白质含量的增加呈正相关。 结论 外源EBR诱导可以改变黑果枸杞自身代谢物质含量，影响桃蚜的生长发育，降低其繁殖力。

Abstract

Objective 24-epibrassinolide（EBR） is a polyhydroxy phytosterol that not only promotes plant growth and development but also enhances the plant’s ability to resist biotic or abiotic stress. The aim of this study was to investigate the induction of resistance in L. ruthenicum against M. persicae by exogenous EBR，providing a theoretical basis for pest control using plant’s inherent resistance. Methods L. ruthenicum seedlings were sprayed with different concentrations of EBR in an indoor setting，with distilled water as a control. One day after spraying， one-day-old nymphs of M. persicae were introduced. The molting frequency， number of nymphs at each instar， and reproduction of M. persicae were recorded at 6， 12， and 18 days post-infestation. Additionally， the changes in soluble protein， soluble sugar， tannin， total phenol， and total flavonoids content in L.ruthenicum leaves were measured. Results （1） EBR at concentrations of 0.5 and 1.0 mg·L^-1 significantly reduced the molting frequency of M. persicae，18 days after induction， to 45.5 % and 56.9 % of the control， respectively. The number of older nymphs decreased， while the number of younger nymphs increased， and the daily growth rate reduced by 51.8% and 49.7% compared to the control. It indicated that EBR treatment slowed down the development rate of M.persicae nymphs. （2） After 18 days of induction with all three concentrations of EBR， the contents of tannin， total phenols and flavonoids in L. ruthenicum leaves significantly increased compared to the control， along with increases soluble protein and soluble sugar content. （3） The fecundity and molting frequency of M. persicae were negatively correlated with the increase in total phenol and tannin content in L. ruthenicum leaves after EBR induction and positively correlated with the increase in protein content. Conclusion Exogenous EBR can induce changes in the metabolic substances of L. ruthenicum， affecting the growth and development of M. persicae and reducing its fecundity.

Graphical abstract

关键词

24-表油菜素内酯 / 桃蚜 / 生化反应 / 黑果枸杞 / 诱导抗性

Key words

24-Epibrassinolide / Myzus persicae / Biochemical response / Lycium ruthenicum / Induced resistance

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）属茄科（Solanaceae）多年生落叶灌木，果实中含有大量原花青素、多糖、维生素等生物活性物质^［1］，具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老、降血糖和血脂等多种生理功能^［2-3］。随着国内市场需求增加，黑果枸杞种植面积也随之增加。随着种植面积的增加，其害虫发生也不断增加，其中枸杞蚜（Aphis sp.）、枸杞木虱（Parantrioza sinica）、枸杞瘿螨（Aceria pallida）等害虫危害严重^［4］。枸杞蚜（包括棉蚜Aphis gossypii、桃蚜Myzus persicae及豆蚜A.craccivora）^［5］的危害日益严重，枸杞蚜世代短、繁殖快、数量大，防治难^［6］。桃蚜M.persicae是危害黑果枸杞的广食性害虫，是多种植物病毒的主要传播媒介^［7］。长久以来，为有效防治蚜虫，大量使用化学杀虫剂，造成了农药残留、抗药性、环境污染^［8］、天敌昆虫减少的问题，农药残留及环境污染日益严重，人类健康受到严重威胁^［9］。因此探寻一种绿色环保的防治方法，降低蚜虫对黑果枸杞的危害，提高其药用、食用质量和产量，非常重要。

植物诱导抗虫性指植物在遭受植食者取食而改变自身代谢物质，直接影响植食者取食行为、生长发育和生殖能力等的特性^［10-12］。烟粉虱（Bemisia tabaci）^［13］、西花蓟马（Frankliniella occidentalis）^［14］和蚜虫^［15］取食危害后，其寄主植物黄瓜（Cucumis sativus）、番茄（Solanum lycopersicum）和杭白菊（Chrysanthemum morifolium）的防御性酚类物质含量明显升高，从而降低了这些害虫的繁殖力。外源茉莉酸甲酯诱导可降低番茄（S.lycopersicum）^［16］和柳杉（Cryptomeria japonica）^［17］的可溶性糖和可溶性蛋白等营养物质含量，增加其单宁、黄酮等次生代谢物质含量，抵御烟粉虱（B.tabaci）和柳杉毛虫（Dendrolimus houi）的危害。利用茉莉酸^［18］和褪黑素^［6］诱导可以延缓枸杞蚜（Aphis sp）和苜蓿蚜（Aphis craccivora）的生长发育，降低其繁殖力，从而提高宁夏枸杞（L. barbarum）和蚕豆（Vicia faba）的抗虫性。水杨酸能提高绿豆体内总酚、黄酮和单宁含量从而提高其抗虫性^［19］，抑制枸杞瘿螨（A.pallida）虫瘿生长及种群数量^［20］。喷施0.1 mg·L^-1 24-表油菜素内酯后烟粉虱（B.tabaci）二龄若虫存活率显著降低^［21］，外源24-表油菜素内酯诱导黑果枸杞是否影响桃蚜，尚未有关报道。

油菜素内酯（Brassinolide，BR）是20世纪70年代初在油菜花粉中分离的一种多羟基植物甾醇类物质，不仅能提高植物适应非生物胁迫的能力^［22］，还可诱导植物抗虫性。喷施0.1 mg·L^-1 EBR后，黄瓜（C.sativus）中可溶性糖含量显著降低，酚类化合物含量增加^［21］；低浓度油菜素甾酮能降低褐飞虱（Nilaparvata lugens）雌成虫的取食和产卵量^［23］；取食喷施0.001和0.01 μg·mL^-1油菜素内酯的桑叶，延缓了家蚕（Bombyx mori）的生长发育，高浓度0.1和1.0 μg·mL^-1的油菜素内酯对家蚕有明显的致死作用^［24］。表油菜素内酯缩短了小菜蛾（Plutella xylostella）雄虫寿命，降低雌成虫繁殖力^［25］。目前24-表油菜素内酯（24-epibrassinolide）诱导黑果枸杞抗蚜能力的研究尚未有报道。本研究以黑果枸杞苗、桃蚜为材料，外源喷施不同浓度的EBR诱导黑果枸杞生化响应，分析诱导6 d、12 d及18 d黑果枸杞苗代谢物含量的变化，观测分析其对桃蚜生长发育、繁殖的影响，明确外源EBR是否诱导黑果枸杞抗蚜性，为利用EBR减少枸杞害虫防治化学农药的使用，保护人类健康和环境安全奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1　试验材料

供试黑果枸杞苗：将黑果枸杞（产地青海省玉树县，购于银川塞上西域商贸有限公司）浸泡、搓揉、漂洗去果肉，自然风干得种子。将种子播于高10 cm，直径11 cm盛有育苗基质的育苗杯中。在光照培养箱（E-36L2，Percival Scientific Inc）（温度（25±1） ℃，光周期L∶D=14 h∶10 h）中培养，待枸杞苗高6 cm左右间苗，每盆选留5株，然后移出放入养虫箱（长×宽×高=35 cm×35 cm×45 cm）培养。待苗高至20 cm左右时进行试验。

枸杞桃蚜：采集于内蒙古农业大学枸杞林，在室内油菜上扩繁。在接虫前一天，取带柄油菜叶片（生长20 d左右），叶背向上放入培养皿内（直径6.0 cm、高1.5 cm），叶柄外露，用毛笔接入成蚜15头，保鲜膜封口，刺孔通风。将培养皿竖立，外露叶柄浸入水杯（直径5.8 cm、高6.0 cm）保鲜，待成蚜产仔。24 h后取新产1龄若蚜用于试验。为保证有足够的1龄若蚜（新产24 h内），最少培养20皿。

1.2　方法

24-表油菜素内酯（购买于Sigma公司，含量≥ 95%）溶液：称取10 mg，溶于10 mL 100 %乙醇中，为1 mg·mL^-1母液，用蒸馏水稀释成1、0.5、0.1 mg·L^-1溶液各2 L。

1.2.1　外源EBR诱导对桃蚜生长发育的影响

将枸杞苗分为4组，每组60株，其中3组分别用手持喷雾器喷施0.1、0.5及1 mg·L^-1 EBR液（分别记为EBR1、EBR2、EBR3），至液滴下流为止，另1组喷施蒸馏水作为对照（CK）。1 d后接1龄若蚜进行抗虫性观测实验。接虫前先用24 cm竹筷将枸杞苗支撑固定（因黑果枸杞幼苗易倒伏），苗木顶端罩纱网养虫笼（7 cm×5 cm），每笼接1头若蚜，拉紧养虫笼下端的抽绳，防止蚜虫逃逸。分别于接蚜虫后6、12、18 d剪下接虫的枸杞苗，打开养虫笼，仔细观察记录蚜虫脱的蜕数、有翅和无翅成蚜数量、若虫（1、2、3、4龄）数量。每个时间段、每个处理观测20株，共计240株。

1.2.2　外源EBR诱导对黑果枸杞初生和次生代谢物的影响

将枸杞苗分为5组，每组12盆，每盆最少5株苗，其中3组分别用手持喷壶喷施0.1 、0.5及1 mg·L^-1 EBR（分别记为EBR1、EBR2、EBR3），至液滴下流为止，另2组喷施蒸馏水，记为CK0和CK1。1 d后处理组CK1、EBR1、EBR2和EBR3接桃蚜若蚜，每盆20头。CK0不接蚜为对照组。分别于接蚜虫后6、12、18 d采集各处理的叶片（各处理约2 g叶片），用于相关生化物质含量测定。

可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝G-250法测定；可溶性糖含量用蒽酮比色法^［26］测定；黄酮含量用硝酸铝-亚硝酸钠显色法^［27］测定；单宁和总酚含量参照张晓霞等^［28］的方法测定。

1.3　数据处理

通过Excel 2007整理数据，采用SPSS 23.0软件进行统计分析，蚜虫蜕数、产仔量及日均增长率用单因素（ANOVA）方差分析，Duncan新复极差法多重比较，用Origin 2022绘图。采用Pearson相关性分析蜕皮次数、产仔量与次生代谢物质关系。

2 结果与分析

2.1　EBR诱导对桃蚜生长发育及繁殖的影响

2.1.1　EBR诱导对桃蚜生长发育的影响

EBR诱导黑果枸杞对桃蚜生长发育有影响（表1），脱皮次数的变化比较明显。诱导18 d时，0.5和1.0 mg·L^-1EBR诱导使桃蚜脱皮次数显著减少，分别为对照的45.5 %和56.9 %，但12 d时脱皮次数较对照增加。脱皮次数的减少说明了其发育历期延长。分析不同诱导时间段不同龄期蚜虫数量，也可看出EBR诱导对蚜虫发育的影响。诱导6 d时，对照组4龄若虫数显著多于1.0 mg·L^-1 EBR的，而2龄若虫显著少于1.0 mg·L^-1 EBR的，说明对照组蚜虫发育快。诱导18 d时，对照组的成蚜个数和各龄若蚜个数均显著多于1.0 mg·L^-1 EBR的，说明1.0 mg·L^-1 EBR诱导黑果枸杞抑制了枸杞桃蚜的生长发育速度。

2.1.2　EBR诱导黑果枸杞对桃蚜种群繁殖力的影响

外源EBR诱导黑果枸杞使桃蚜繁殖力降低（表2）。18 d时，EBR诱导黑果枸杞使桃蚜产仔较对照显著减少，日均增长率较对照降低，0.5和1.0 mg·L^-1 EBR诱导使桃蚜日均增长率分别较对照显著降低51.8%和49.7%。诱导12 d，仅有0.5 mg·L^-1 EBR使桃蚜产仔量减少，但未达到统计分析的显著性。6 d时，1.0 mg·L^-1 EBR诱导桃蚜日均增长率与对照无显著差异。表明EBR诱导可以使桃蚜繁殖力降低，其中0.5和1.0 mg·L^-1 EBR效果较好。

2.2　EBR诱导对黑果枸杞生化物质含量的影响

2.2.1　可溶性蛋白和可溶性糖含量

外源EBR诱导及蚜虫取食对黑果枸杞可溶性蛋白和可溶性糖含量有明显影响（图1）。蚜虫取食及EBR诱导均使黑果枸杞可溶性蛋白含量增加，但仅在18 d时达到显著水平（P<0.05），可溶性蛋白含量从对照组的26.9 mg·g^-1升至70 mg·g^-1以上。蚜虫取食6和12 d时对黑果枸杞可溶性蛋白含量没有影响，但18 d时显著增加。3个浓度的外源EBR诱导均提高了黑果枸杞可溶性糖含量。蚜虫取食6 d和12 d时，导致黑果枸杞可溶性糖含量降低，但18 d时较对照组显著升高，呈先下降后升高趋势。

2.2.2　单宁、总酚和黄酮含量

外源EBR诱导和蚜虫取食均影响黑果枸杞的单宁、总酚及黄酮等次生代谢物含量（图2）。3种浓度EBR诱导均不同程度地提高了黑果枸杞单宁、总酚和黄酮含量，其中单宁含量的增加幅度在诱导第6及12 d更大，18 d时增加幅度降低。总酚含量在不同时间段的变化幅度较小，且0.5 mg·L^-1 EBR诱导总酚含量增加最多。蚜虫的取食危害导致黑果枸杞的单宁含量在诱导12 d和18 d时降低，总酚含量在诱导第18 d降低，但与CK0相比均未达到统计分析的显著性。蚜虫取食危害导致黄酮含量显著变化，12和18 d时含量较对照组显著增加，但增加的程度小于EBR诱导的，3种浓度EBR诱导12 d时黄酮含量增幅最大。

2.3　EBR诱导黑果枸杞生化反应与抗蚜性的相关分析

诱导12 d，蜕皮次数与可溶性蛋白、可溶性糖含量增加呈正相关，与黄酮含量增加呈负相关；产仔量与可溶性糖含量增加呈正相关，与总酚含量呈负相关。诱导18 d时，蜕皮次数和产仔量均与总酚含量、单宁含量增加呈负相关，与黄酮含量增加呈正相关。

3 讨论

植物油菜素甾醇类物质对植物抵御生物胁迫与非生物胁迫起到重要作用^［29］。前人研究表明，表油菜素内酯能够与蜕皮激素受体结合，从而干扰昆虫蜕皮，具有抗蜕皮激素的功能^［30］。本研究结果表明，EBR诱导18 d时，3种浓度EBR均显著减少桃蚜（M.persicae）蜕皮次数，高龄若虫数量减少，低龄若虫数量增加，说明了其发育历期延长。该结果与孙丽娟^［25］的研究结果类似，EBR延缓小菜蛾（P.xylostella）幼虫及蛹的发育，且延缓作用的后延性更强。

外源EBR诱导18 d，桃蚜产仔量和日均增长率均较对照降低，其中0.1 mg·L^-1 EBR诱导后桃蚜日均增长率与对照无显著差异，0.5和1.0 mg·L^-1 EBR显著降低桃蚜的日均增长率。该结果与用褪黑素^［31，6］和茉莉酸^［18］诱导抗蚜性的结果类似，苜蓿蚜（A.craccivora）、棉蚜（A. gossypii）和枸杞蚜（Aphis sp.）的日均产蚜量随褪黑素和茉莉酸诱导浓度的增加逐渐减少，均呈下降趋势。可见外源EBR与其它外源调节剂相同，可以延长蚜虫发育时间，降低其繁殖力。Nahar等^［32］证实了油菜素内酯参与水稻的先天免疫系统，发现低浓度EBR使水稻的抗线虫性能降低，而高浓度EBR能增强水稻对根结线虫的抗性^［32］。王佳妮等^［23］同样发现低浓度油菜素甾酮诱导后，使褐飞虱（N.lugens）的产卵量显著降低，而较高浓度的油菜素甾酮诱导则增加其产卵量^［23］，EBR浓度影响其对不同植物的诱导效果。

本研究结果表明，蚜虫短时间危害下对黑果枸杞叶片可溶性蛋白和黄酮含量没有影响，可溶性糖含量降低，长时间危害后可溶性糖、可溶性蛋白和黄酮含量显著增加，这一结果与李传明^［13］的研究结果类似：低密度烟粉虱（B.tabaci）危害后辣椒可溶性蛋白含量呈下降趋势，黄酮含量无显著差异，高密度烟粉虱（B.tabaci）危害后可溶性蛋白和黄酮含量则显著上升。史保争等^［21］发现烟粉虱（B.tabaci）取食危害4周后，黄瓜（C.sativus）可溶性糖含量是对照的近2倍，本研究结果与此类似。植物体内酚类、萜类、生物碱等抗性物质可以影响昆虫的寄主选择和生长发育，从而影响植物的抗虫性^［33］。有研究表明，外源植物激素能提高植物抗虫性，如烟粉虱（B.tabaci）^［16］、西花蓟马（F.occidentalis）^［14］、豆蚜（Aphis craccivora）^［19］危害下外源喷施茉莉酸甲酯、茉莉酸和水杨酸可有效提高番茄（S.lycopersicum）和绿豆（Vigna radiata）总酚和黄酮等次生代谢物含量，从而提高其抗虫性。本研究表明，外源EBR诱导显著增加了黑果枸杞单宁、总酚和黄酮含量，此结果与外源EBR提高黄瓜（C.sativus）抗烟粉虱（B.tabaci）能力的结果类似，0.1 mg·L^-1 EBR使黄瓜（C.sativus）酚类物质含量增加^［21］。说明外源EBR与外源茉莉酸、茉莉酸甲酯和水杨酸一样可以通过改变植物体内次生代谢物含量，起到提高植物抗虫性的作用。

4 结论

外源EBR诱导改变黑果枸杞自身代谢物质含量，延缓了桃蚜发育，降低其繁殖力。可利用EBR提高黑果枸杞抗虫性。

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基金资助

中央引导地方科技发展资金项目(2022ZY020)

博士科研创新基金(B20210166Z)