石榕树中补骨脂素分离鉴定及其抗真菌活性

Isolation and identification of psoralen from Ficus abelii and its antifungal activity

摘要

目的 分离出石榕树中能够有效抑制植物病原真菌的活性单体化合物并探索其抗真菌活性。 方法 采用生物活性追踪和化学分离相结合的方法对石榕树甲醇提取物进行分离，运用质谱、核磁共振氢谱和碳谱并结合相关文献数据鉴定活性单体化合物。采用菌丝生长速率法测定活性单体化合物对7种植物病原真菌的抑菌活性。 结果 石榕树（叶）甲醇提取物对甘蔗凤梨病菌具有良好抑菌活性，在10 mg·mL^-1浓度下，抑菌率为100%。在浓度为1.5 mg·mL^-1时，石榕树（叶）石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物和水层萃余物对甘蔗凤梨病菌的抑菌率分别为58.73%、100.00%、39.49%和6.63%。表明石榕树（叶）乙酸乙酯层萃取物对甘蔗凤梨病菌的抑制作用最高，其EC₅₀值为0.430 7 mg·mL^-1。石榕树（叶）乙酸乙酯层萃取物进行柱色谱分离后得到对甘蔗凤梨病菌有较高抑菌活性的是LMNO1bc1a活性组分，0.1 mg·mL^-1的LMNO1bc1a活性组分对甘蔗凤梨病菌的抑菌率为100.00%。LMNO1bc1a组分经结晶、重结晶纯化后命名为SRS-1，SRS-1经NMR和MS技术鉴定为补骨脂素（psoralen）。SRS-1对甘蔗凤梨病菌、甘蓝黑斑病菌、玉米大斑病菌、罗汉果白绢病菌、柑橘砂皮病菌、茶轮斑病菌、烟草黑胫病菌这7种植物病原真菌都有一定的抑菌活性，其EC₅₀值分别为0.018 2 、0.038 8、0.040 9、0.051 2、0.080 7、0.092 7、0.115 4 mg·mL^-1。 结论 从石榕树中分离出抑菌活性单体化合物SRS-1，鉴定为补骨脂素，其对甘蔗凤梨病菌、甘蓝黑斑病菌、玉米大斑病菌、罗汉果白绢病菌、柑橘砂皮病菌、茶轮斑病菌、烟草黑胫病菌这7种植物病原真菌都有一定的抑菌活性。

Abstract

Objective The current study aimed to isolate and identify the active monomeric compounds from Ficus abelii that can effectively inhibit plant pathogenic fungi and to explore their antifungal activities. Method A combination of bioactivity-guided isolation and chemical separation was used to isolate compounds from the methanol extracts of F. abelii . The active monomeric compounds were identified using mass spectrometry（MS）， proton nuclear magnetic resonance （¹H-NMR），carbon nuclear magnetic resonance （¹³C-NMR）， and related literature data. The antifungal activities of the isolated monomeric compounds from F. abelii against seven plant pathogenic fungi were determined using the mycelial growth rate method. Result The results showed that the methanol extract of F. abelii （leaves） had good antifungal activities against Thielaviopsis paradoxa， causal agent of pineapple disease in sugarcane， with an inhibition rate of 100% at the concentration of 10 mg·mL^-1. At a concentration of 1.5 mg·mL^-1， the petroleum ether， ethyl acetate， n-butanol， and aqueous extracts of F. abelii had inhibition rates of 58.73%，100.00%， 39.49%， and 6.63% against T. paradoxa， respectively， indicating that the ethyl acetate extract possessed the highest inhibitory activity with a median effective concentration （EC₅₀） value of 0.430 7 mg·mL^-1. After column chromatography of the ethyl acetate extract， the active fraction LMNO1bc1a showed a 100% inhibition rate against T. paradoxa at a concentration of 0.1 mg·mL^-1. The LMNO1bc1a fraction was crystallized and recrystallized， resulting in the pure compound named SRS-1， which was identified as psoralen using NMR and MS techniques. SRS-1 exhibited antifungal activity against seven plant pathogenic fungi， including T. paradoxa， Alternaria oleracea， Exserohilum turcicum， Athelia rolfsi， Citrus melanoses， Pesta-lotiopsis theae，and Phytophthora parasitica. with EC₅₀ values of 0.018 2， 0.038 8， 0.040 9， 0.051 2， 0.080 7， 0.092 7， 0.115 4 mg·mL^-1， respectively. Conclusion The antifungal active monomer SRS-1， identified as psoralen， was isolated from F. hirta. It showed certain antifungal activity against seven plant pathogenic fungi， including T. paradoxa， A. oleracea， E. turcicum， A. rolfsi， C. melanoses， P. theae，and P. parasitica.

Graphical abstract

关键词

石榕树 / 补骨脂素 / 分离 / 鉴定 / 植物病原真菌 / 抑菌活性

Key words

Ficus abelii Miq. / Psoralen / Isolation / Identification / Plant phytopathogenic fungi / Antibacterial activity

补骨脂素（psoralen）是存在于豆科植物补骨脂（Cullen corylifolium L. Medikus）^［1-2］、桑科植物无花果（Ficus carica Linn.）、粗叶榕（Ficus hirta Vahl）^［3-4］，芸香科植物芸香（Ruta graveolens L.）^［5］，伞形科植物重齿毛当归（Angelica pubescens Maxim.f. biserrata Shan et Yuan）、珊瑚菜（Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.）^［6-7］等植物中，属于呋喃香豆素类。目前补骨脂素的研究主要在医学方面，有抗肿瘤、抗炎、抗骨质疏松、治疗白血病的作用。在抗肿瘤方面，补骨脂素对乳腺癌^［8］、鼻咽癌^［9］肿瘤细胞、肺癌A549细胞^［10］、结肠癌HCT116和HT29细胞^［11］、肝癌HepG2细胞^［12］、黏液表皮样癌细胞MEC-1^［13］的增殖、迁移有较好的抑制作用。补骨脂素还可作为调节成骨细胞分化的有效药物，其诱导成骨细胞分化但不会影响细胞生长^［14］。在抗炎方面，促进成骨细分化治疗大鼠类风湿关节炎关节损伤^［15］、牙周炎骨缺损^［16］。在抗骨质疏松方面，可促进小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化^［17］，抑制软骨病理性钙化^［18］。补骨脂素可能通过内皮依赖性的NO途径以及促进内皮细胞中eNOS蛋白表达来发挥血管舒张作用^［19］。补骨脂素通过ER/MAPK信号通路下调MITF和TYR，TRP-1，TRP-2的表达量，从而减少黑素合成^［20］。补骨脂素具有植物雌激素作用，并且其作用是通过ER途径介导的^［21］。补骨脂素对Aβ损伤的PC12细胞具有保护作用^［22］。在杀虫方面，补骨脂素对草地贪夜蛾^［23］、松材线虫^［24］等有一定的杀虫活性。在抑菌活性方面，补骨脂素对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）^［25］、苹果腐烂病菌（Cytospora sp.）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）和棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum）^［26］、黄瓜白粉病病原菌（Sphaerotheca fuliginea （Schlecht） Poll.）^［27］有较好的抑菌活性。由此可见，补骨脂素作为抑菌剂在农药领域有一定的发展空间。

石榕树（Ficus abelii Miq.），桑科（Moraceae Gaudich.）榕属（Ficus L.）灌木，常作为盆景，在中国多分布于江西、福建、广东、广西、云南、贵州、四川、湖南等地区。尼泊尔、印度东北部、孟加拉国、缅甸、越南也有分布。石榕树生长于海拔200~2000 m的地区，一般生于灌丛中、山坡溪边灌丛及溪边。石榕树高1~2.5 m；枝密被灰白色粗毛，叶纸质，花期为5~7月，果为瘦果，单生叶腋，近梨形，直径1.5~2 cm^［28］。目前，国内外对桑科榕属植物的化学成分和药理作用方面的研究比较多^［29-32］。但还未见石榕树的化学成分及其关于杀虫、抑菌活性方面的报道，也没有从石榕树中分离纯化获得补骨脂素的相关文献报道。本研究以甘蔗凤梨病菌（Thielaviopsis paradoxa）作为指示菌，采用生物活性追踪和化学分离相结合的方法对石榕树甲醇提取物进行分离，运用质谱、核磁共振氢谱和碳谱并结合相关文献数据鉴定活性单体化合物，然后采用菌丝生长速率法测定了活性单体化合物对7种植物病原真菌的抑菌活性。旨在探究石榕树的抑菌活性及其抑菌活性成分，以期为植物源抑菌剂的开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1　材料

1.1.1　植物材料

石榕树（Ficus abelii Miq.）叶、果、枝采自广西壮族自治区桂林市临桂区会仙镇（25°3′18″N，110°8′34″E），将采集的植物材料室内阴干、置于烘箱内60 ℃烘干至发脆，粉碎过40目（0.425 mm）筛，室温密封保存。

1.1.2　植物病原真菌

甘蔗凤梨病菌（Thielaviopsis paradoxa），茶轮斑病菌（Pesta-lotiopsis theae），罗汉果白绢病菌（Athelia rolfsi），柑橘砂皮病菌（Citrus melanose），甘蓝黑斑病菌（Alternaria oleracea），玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum），烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica）由广西师范大学生命科学学院生物学实验教学中心提供。

1.1.3　仪器与试剂

Agilent 6545Q-TOF LC/MS液质联用仪，安捷伦科技有限公司；德国AVANCE NEO 600MHz核磁共振波谱仪，布鲁克科技有限公司。

柱层析硅胶、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（广东汕头市西陇化工厂）均为分析纯。

1.2　方法

1.2.1　植物成分提取

石榕树甲醇冷浸提取^［33］，分别于48、96 h后抽滤合并滤液。旋转蒸发仪减压蒸干，获得甲醇提取物，用石油醚、氯仿、水饱和的正丁醇对石榕树甲醇提取物进行连续3次等量萃取，减压浓缩得石油醚萃取物、氯仿萃取物、正丁醇萃取物和水层萃余物浸膏。

1.2.2　对甘蔗凤梨病菌的抑制作用测定

采用菌丝生长速率法^［34］。菌种活化：在PDA平板培养基上接种甘蔗凤梨病菌培养3 d，备用。含药培养基的配制：配制丙酮∶无菌水=1∶1的丙酮水溶液，用丙酮水溶液溶解样品并制备成一定浓度的药液。在直径9 cm或（6 cm）的培养皿中，加入1 mL药液（对照组用1 mL的丙水溶液代替药液）与9 mL或（4 mL）热熔PDA培养基，放平混合均匀。接种：在活化的甘蔗凤梨病菌外圈菌丝分布区域用无菌打孔器切取直径为4 mm菌饼，用无菌接种针将菌饼挑出，菌丝面朝下，接种到含药培养基中央，每皿接1个菌饼，每个处理设3个重复。培养：将接种后的培养皿置于（28±0.5） ℃的恒温培养箱中培养72 h，用十字交叉法测量菌落直径，参照以下公式算出抑菌率：

菌落直径（mm）=测量菌落直径平均值－4

抑菌率=\frac{\mathrm{对照}\mathrm{菌落}\mathrm{直径}-\mathrm{处理}\mathrm{菌落}\mathrm{直径}}{\mathrm{对照}\mathrm{菌落}\mathrm{直径}}×100%

1.2.3　活性化合物SRS-1的分离

将石榕树（叶）乙酸乙酯层萃取物用硅胶柱（硅胶粒径为100~200目，75~150 μm）进一步分离，依次用体积比为石油醚∶乙酸乙酯=（10∶1，5∶1，2∶1，1∶5）的混合溶剂进行洗脱，最后利用甲醇进行冲柱。分别按等体积（150 mL）收集馏分，经薄层层析（TLC）检测（碘显色），合并相同馏分，得到17个极性组分（A~Q）。合并LMNO组分，依次用体积比为石油醚∶乙酸乙酯=（5∶2，2∶1）的混合溶剂进行洗脱，甲醇冲柱，分别按等体积（20 mL）收集馏分，经薄层层析（TLC）检测（碘显色），合并相同馏分，得到9个极性组分（LMNO1~LMNO9）。LMNO1组分用体积比为石油醚∶乙酸乙酯=5∶1的混合溶剂进行洗脱，甲醇冲柱，分别按等体积（10 mL）收集馏分，经薄层层析（TLC）检测（碘显色），合并相同馏分，得到5个极性组分（LMNO1a~LMNO1e）。合并LMNO1b、LMNO1c组分，得LMNO1bc组分依次用体积比为石油醚∶乙酸乙酯=5∶1的混合溶剂进行洗脱，甲醇冲柱，分别按等体积（10 mL）收集馏分，经薄层层析（TLC）检测（碘显色），合并相同馏分，得到5个极性组分（LMNO1bc1~LMNO1bc5）。LMNO1bc1组分用体积比为石油醚∶乙酸乙酯=2∶1的混合溶剂进行洗脱，甲醇冲柱，分别按等体积（10 mL）收集馏分，经薄层层析（TLC）检测（碘显色），合并相同馏分，得到2个极性组分LMNO1bc1a和LMNO1bc1b。LMNO1bc1a组分常温下有结晶析出，用丙酮冲洗反复重结晶，得化合物SRS-1。

2 结果与分析

2.1　石榕树甲醇提取物对甘蔗凤梨病菌的抑菌活性

测定石榕树（叶、果、枝）甲醇提取物分别在10 mg·mL^-1、1 mg·mL^-1浓度时对甘蔗凤梨病菌的抑制作用，结果见表1和图1。结果表明，在10 mg·mL^-1浓度时，石榕树（叶）、石榕树（果）、石榕树（枝）甲醇提取物对甘蔗凤梨病菌的抑菌率分别为100%，14.25%和21.91%，石榕树（叶）甲醇提取物对甘蔗凤梨病菌的抑菌率最好。在1 mg·mL^-1浓度时，石榕树（叶）、石榕树（果）、石榕树（枝）甲醇提取物对甘蔗凤梨病菌的抑菌率均在25%以下，抑菌活性比较低。由此可知，石榕树对甘蔗凤梨病菌的主要抑菌活性成分存在石榕树（叶）中，石榕树（叶）具有进一步分离研究其抑菌活性成分的研究价值。

2.2　石榕树叶萃取物对甘蔗凤梨病菌的抑菌活性

分别测定了石榕树叶石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物和水层萃余物在浓度为1.5 mg.mL^-1时对甘蔗凤梨病菌72 h的抑菌活性。结果见表2和图2。从表2中可以看出，石榕树叶乙酸乙酯萃取物对甘蔗凤梨病菌72 h的抑菌率为100%，完全抑制了甘蔗凤梨病菌的生长；石榕树叶石油醚萃取物对甘蔗凤梨病菌72 h的抑菌率为58.73%，抑菌活性次之；而石榕树叶正丁醇萃取物和水层萃余物对甘蔗凤梨病菌72 h的抑菌率均低于40%。实验结果表明，石榕树叶对甘蔗凤梨病菌抑菌活性的成分主要分布在乙酸乙酯萃取物中。

为明确石榕树叶乙酸乙酯萃取物对甘蔗凤梨病菌抑制活性的大小，对石榕树叶乙酸乙酯萃取物进行72 h的有效抑菌中浓度测定，结果表明石榕树叶乙酸乙酯萃取物对甘蔗凤梨病菌72 h的有效抑菌中浓度（EC₅₀）为0.430 7 mg·mL^-1，线性回归方程为：y=3.169 1x+6.156 1，相关系数（r）为：0.996 5（图3）。

2.3　石榕树叶乙酸乙酯萃取物硅胶柱层析流分的活性追踪

2.3.1 石榕树叶乙酸乙酯层萃取物第一次过柱所得17个极性组分（A~Q）的活性

测定了上述17个组分对甘蔗凤梨病菌72 h的抑菌活性，结果见表3和图4。由表3可知，L、M、N、O四个组分对甘蔗凤梨病菌的抑菌活性较高，均在80%以上，说明对甘蔗凤梨病菌有明显抑菌活性的成分集中在上述4个组分。因此后续实验将这4个组分L、M、N、O合并成一个组分LMNO进行下一步试验。

2.3.2　LMNO硅胶柱层析所得9个极性组分（LMNO1~LMNO 9）的活性

测定了上述9个组分对甘蔗凤梨病菌72 h的抑菌活性，结果见表4和图5。

由表4可知，LMNO1组分的抑菌活性为100%，说明对甘蔗凤梨病菌有明显抑菌活性的成分集中在该组分。LMNO2、LMNO3和LMNO73个组分的抑菌活性也可达到70%以上，说明这3个组分中也含有对甘蔗凤梨病菌有抑制作用的物质，但与LMNO1组分的抑制效果相差较大，因此后续试验采用LMNO1组分展开。

2.3.3　组分LMNO1硅胶柱层析所得5个极性组分（LMNO1a~LMNO1e）的活性。

测定了上述5个组分对甘蔗凤梨病菌72 h的抑菌活性。抑菌效果见表5和图6所示，LMNO1b、LMNO1c组分的抑菌活性均高于80%，说明对甘蔗凤梨病菌有抑菌活性的成分集中在这2个组分。因此将LMNO1b、LMNO1c合并成LMNO1bc组分展开后续试验。

2.3.4　组分LMNO1bc硅胶柱层析所得5个极性组分（LMNO1bc1~LMNO1bc5）的活性

测定了上述5个组分在0.3 mg·mL^-1浓度下对甘蔗凤梨病菌72 h的抑菌活性。抑菌效果见表6和图7所示，LMNO1bc1组分的抑菌活性为100%，说明对甘蔗凤梨病菌有明显抑菌活性的成分集中在该组分。因此后续试验围绕LMNO1bc1组分展开。

2.3.5　组分LMNO1bc1硅胶柱层析所得LMNO1bc1a（SRS-1）、 LMNO1bc1b的活性

LMNO1bc1a组分常温下有结晶析出，用丙酮冲洗反复重结晶，得化合物SRS-1。测定了化合物SRS-1和组分LMNO1bc1b对甘蔗凤梨病菌72 h的抑菌活性。抑菌活性见表7和图8所示，化合物SRS-1在0.1 mg·mL^-1浓度下，对甘蔗凤梨病菌的抑菌率为100%，LMNO1bc1b组分抑菌率为34.28%，因此化合物SRS-1对甘蔗凤梨病菌有较好的抑制活性。

2.4　活性化合物SRS-1结构鉴定

化合物SRS-1为无色针状结晶，mp 161~162 ℃，易溶于丙酮、甲醇、乙醇。

ESI-MS m/z： 187.039 ［M+H］⁺

¹H-NMR （600 MHz， acetone-d₆）δ：8.08（d， J=9.6 Hz， 1H）， 7.96（s， 1H）， 7.95 （d， J=1.0 Hz， 1H）， 7.53（s， 1H）， 7.03（dd， J=2.2， 1.0 Hz， 1H）， 6.36（d， J=9.6 Hz， 1H）。

¹³C-NMR （150 MHz， acetone-d6）δ：160.8（C-2）， 157.1（C-7）， 153.0（C-9）， 148.3（C-2’）， 145.2（C-4）， 125.7（C-6）， 121.4（C-5）， 116.5（C-10）， 115.2（C-3）， 107.4（C-3’）， 100.1（C-8）。

根据SRS-1的NMR和MS数据，对比贺钢民等^［35］对风芍六君子汤水煎液化学成分研究中报道的补骨脂素，发现SRS-1与补骨脂素的相关数据一致，因此确定该化合物SRS-1为补骨脂素，其化学结构式、ESI-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR分别见图9~12。

2.5　化合物SRS-1对7种植物病原真菌的毒力

采用菌丝生长速率法测定了化合物SRS-1对7种植物病原真菌的抑制活性，由表8可知，化合物SRS-1对7种植物病原真菌都有一定的生物活性，且对不同植物病原真菌的抑制作用存在一定的差异。其中化合物SRS-1对甘蔗凤梨病菌具有最强的毒力抑制效果，抑制有效中浓度EC₅₀值为0.018 2 mg·mL^-1，其次对甘蓝黑斑病菌、玉米大斑病菌、罗汉果白绢病菌有较强的毒力抑制效果，EC₅₀值分别为0.038 8、0.040 9、0.051 2 mg·mL^-1，对柑橘砂皮病菌、茶轮斑病菌、烟草黑胫病菌有较弱的毒力抑制效果，EC₅₀值分别为0.080 7、0.092 7、0.115 4 mg·mL^-1。以上表明，化合物SRS-1对烟草黑胫病菌抑制活性最小，对甘蔗凤梨病菌的抑制活性最大。

3 讨论与结论

本研究从石榕树（叶）乙酸乙酯层萃取物中分离出抑制甘蔗凤梨病菌的单体化合物SRS-1。运用质谱、核磁共振氢谱和碳谱并结合相关文献数据鉴定单体活性化合物为补骨脂素。采用菌丝生长速率法测定了补骨脂素对甘蔗凤梨病菌、甘蓝黑斑病菌、玉米大斑病菌、罗汉果白绢病菌、柑橘砂皮病菌、茶轮斑病菌、烟草黑胫病菌这7种植物病原真菌的抑菌活性。结果表明，补骨脂素对甘蔗凤梨病菌、甘蓝黑斑病菌、玉米大斑病菌、罗汉果白绢病菌、柑橘砂皮病菌、茶轮斑病菌、烟草黑胫病菌这7种植物病原真菌都具有一定的抑制活性。其EC₅₀值分别为0.018 2、0.038 8、0.040 9、0.051 2、0.080 7、0.092 7、0.115 4 mg·mL^-1。

本研究首次从桑科石榕树中分离得到补骨脂素。补骨脂素由呋喃环、苯环、α-吡喃酮组成的线性三环天然香豆素类化合物。无色针状结晶（乙醇），能溶于乙醇、氯仿，微溶于水、乙醚和石油醚^［36］。补骨脂素由于其化学性质上微溶于水，因此在应用上需要对其进行改造。目前，有利用补骨脂素制备成补骨脂素固体脂质纳米粒^［37］、补骨脂素纳米结构脂质载体凝胶^［38］等。同时也可对补骨脂素进行结构优化，可在3，4，5，8位通过生物电子等排体取代使其进行成盐修饰、引入极性基团、降低脂溶性、构象优化、前药修饰、孪药修饰等来增加水溶性。本研究明确了从桑科石榕树中分离得到补骨脂素，其对甘蔗凤梨病菌的抑菌效果最好，但其对甘蔗凤梨病菌的抑菌机理有待后续进行深入的研究。

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基金资助

广西重点研发计划项目(桂科AB1850025)