对黄瓜专化型枯萎病拮抗菌株的筛选与鉴定

Screening and identification of antagonistic strains against cucumber Fusarium wilt

摘要

目的 筛选出对黄瓜枯萎病具有拮抗作用的细菌。 方法 从黄海海域的海泥中筛选出一株能抑制尖孢镰孢黄瓜专化型枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）的拮抗菌株，经形态学观察和分子生物鉴定菌株H5-9Z为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），并对其作为黄瓜枯萎病生防菌的潜力进行了研究。 结果 拮抗菌株H5-9Z抑菌效果最好，其发酵菌液抑菌率为82.67%，无菌滤液抑菌率为77.87%，抑菌效果明显。胞外活性物质在紫外线和金属离子的条件下抑菌直径均无明显改变；pH在5.0、7.0、9.0、11.0都有较好的抑菌活性，当pH越靠近中性条件下抑菌效果越好；当温度高于70 ℃时失去抑菌活性，表明该菌株不耐高温。盆栽试验结果表明，菌株H5-9Z的发酵液对黄瓜枯萎病有一定的拮抗作用（57.65%）。探究发现菌株H5-9Z的主要抑菌化合物分子质量范围在33~95 kDa之间。 结论 分离得到的短小芽孢杆菌H5-9Z具有作为生物防治剂的潜力，可以用于黄瓜枯萎病生物防治方面的研究。

Abstract

Objective This study was aimed to screen the bacterial strains with antagonistic effects against cucumber Fusarium wilt. Methods A strain capable of inhibiting F. oxysporum， the pathogen causing cucumber Fusarium wilt， was isolated from sea mud in the Yellow Sea. The strain H5-9Z was identified as Bacillus pumilus through morphological observation and molecular biology. The potential of this strain as a biocontrol agent against cucumber Fusarium wilt was further investigated. Results The antagonistic strain H5-9Z exhibited the best inhibitory effect，with an inhibition rate of 82.67% for its fermentation broth and 77.87% for its sterile filtrate， demonstrating significant antifungal activity. The extracellular active substances showed no significant change in inhibition diameter under UV light or in the presence of metal ions； The strain maintained good antibacterial activity at pH levels of 5.0， 7.0， 9.0，and 11.0，with optimal inhibition observed under neutral pH conditions. However， the strain lost its inhibitory activity at temperatures above 70 ℃， indicating its sensitivity to high temperatures. The results of pot experiment showed that the fermentation broth of strain H5-9Z exhibited a certain level of antagonistic activity against cucumber Fusarium wilt （57.65%）. Further investigation identified that the molecular weight range of the main antibacterial compounds produced by strain H5-9Z was between 33 and 95 kDa. Conclusion The isolated B. pumilus H5-9Z demonstrated potential as a biocontrol agent and can be further explored for its application in the biological control of cucumber Fusarium wilt.

Graphical abstract

关键词

拮抗菌 / 黄瓜枯萎病菌 / 分离鉴定 / 生物活性 / 生物防治

Key words

Antimicrobial activity / Cucumber wilt pathogen / Isolation and identification / Biological / Biological control

黄瓜在中国是一种非常重要的蔬菜作物，具有显著的经济和食用价值^［1］。在种植黄瓜的过程中，枯萎病、霜霉病和白粉菌是诱发黄瓜发病的3种最主要病原菌^［2］。在中国，黄瓜不同种植区域都有枯萎病发生。在连作模式下，黄瓜枯萎病发生率会变得更高，发生率一般在30%~90%，导致黄瓜产量的巨大损失^［3-4］。镰刀菌^［5］是一种感染黄瓜维管束的形式特化菌，其引起的枯萎病会导致茎基坏死病变、叶片枯萎，最终导致整株枯萎，甚至死亡^［6-7］。黄瓜枯萎病极难控制，同时可以在土壤中长期存在，因此很难通过使用杀虫剂来消除^［8］。现有的防治方法以化学防治为主，如青枯立克、多菌灵、恶霉灵等化学药剂^［9］。农业防治方法包括对种子进行消毒、施足底肥、合理的轮作、高垄栽培或者采用嫁接技术。虽然化学农药在防治上会有一定的效果，但会带来环境污染，使土壤板结化。而农业防治上所需要的技术手段又过于苛刻。使用生物防治是控制黄瓜枯萎病的另一种方法，定殖在根际的微生物可以通过抗生作用、竞争作用、溶菌作用及诱导抗病性等多种防病机制拮抗病原菌^［10］。这些微生物可以通过多种机制参与生物防治，包括脂肽的产生、水解酶（例如几丁质酶、纤维素酶、葡聚糖酶）产生、微生物挥发性有机化合物产生^［11］。

海洋是生命的发源地，其生物多样性远远大于陆地生态系统^［12］。海洋环境具有高盐、高压、低温等特点，海洋微生物因能产生具有特殊效果的生物活性物质而独树一帜，是药物、保健食品和生物材料的巨大宝库。近年来，研究人员发现了许多海洋微生物可以产生具有各种影响的天然活性物质^［13-14］。例如，新型杀菌剂可以抑制革兰氏阴性铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌；蒽醌和肉桂酸可以用来对抗人类癌症细胞^［15-16］。研究表明，海洋中存在着大量的对黄瓜枯萎病具有抑制作用的细菌。陈香等^［17］从连云港海域分离出对黄瓜枯萎病具有良好防治效果的海洋源芽孢杆菌Y3F。李伟等^［18］分离出来的枯草芽孢杆菌3512A对黄瓜枯萎病的田间防效达到70%以上。

近年来研究发现，假单胞菌属和芽孢杆菌属是黄瓜枯萎病的主要生物防治细菌。木霉属（Trichoderma spp.）主要是生物防治真菌^［19］。在对黄瓜枯萎病的防治研究中发现，菌株具有拮抗作用的原因之一是能分泌代谢活性物质，如蛋白质，环脂肽等^［20］。而拮抗菌的作用强弱主要跟其分泌的代谢产物的量有关，特别是其中含活性抑菌物质的含量；其发酵条件，培养基成分也是重要的影响条件。生防菌在抑菌过程中一般通过竞争底物来发挥作用^［21］。同时拮抗菌株产生的代谢物，可使致病菌细胞破裂内容物流出^［22］。

本研究以尖孢镰孢黄瓜专化型枯萎病菌作为致病菌，从黄海滩涂的海泥中筛选出来的细菌为供试菌，分离筛选出具有较好拮抗作用的菌株，并通过建立系统发育树，鉴定其种属，分析其抑菌结果。

1 材料与方法

1.1　材料

1.1.1　致病菌株

尖孢镰孢黄瓜专化型黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. Cucumerinum）编号为：CICC 2532购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2　菌株筛选来源

海泥采自连云港黄海海域滩涂，经过梯度稀释可得。

1.1.3　培养基

LB培养基和2216E培养基用于拮抗菌株的分离与筛选；PDA培养基用于病原真菌的活化及培养^［23］。

1.2　目标菌株的分离筛选

用移液管吸取2 mL海泥样品放入50 mL的2216E液体培养基中，28 ℃振荡培养2 h。将菌悬液到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，分别吸取60 μL进行LB平板涂布，28 ℃培养24 h，挑取表面光滑的菌落划线保存在4 ℃冰箱。采用平板对峙法^［24］，将尖孢镰刀菌接入PDA中央，将拮抗菌接入距平板中心2.5 cm处，以接种2216E培养液作为对照组，28 ℃培养箱培养3、5和7 d。试验重复3次，分别记录抑菌直径，计算抑菌率。抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-5）×100%^［25］。根据抑菌率筛选出最好的菌株。

1.3　拮抗菌株的鉴定

1.3.1　形态学和生理生化鉴定

在2216E平板上将筛选菌株划线，在28 ℃隔水式培养箱内培养24 h，观察所筛选菌株的形状、大小、颜色等形态特点，并进行革兰氏染色，采用试剂盒（常德比克曼生物科技有限公司）。

1.3.2　16S rRNA序列分析

将菌株送至通用生物（安徽）公司进行测序。16S rRNA的PCR扩增。将纯化得到的菌株在2216E液体培养基中，28 ℃、180 r/min恒温恒湿培养摇床中培养20 h后，取200 μL菌液在100 ℃沸水中煮10 min，1200 r/min离心10 min，得到上清液为RNA。以此RNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系：模板RNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH₂O 40 μL、2×Taq PCR MasterMix 25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性180 s、94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，循环30次；72 ℃终延伸300 s。PCR引物为细菌16SrRNA通用引物，反向引物为1492R（5'-TACGGCTACCTTGTT-ACGACTT-3'），正向引物27F（5'-AGAGTTT-GATCCTGGCTCAG-3'）。测序结果通过NCBI网站的BLAST检索系统对测序结果进行同源系列比对分析，对高度相似的序列进行分析。使用MEGA-X软件运用邻近法构建系统发育树并分析。

1.3.3　菌株H5-9Z抑菌能力测定

以H5-9Z作为拮抗菌株，制备菌悬液。从平板中挑取一环菌株接种到10 mL的2216E培养液中，28 °C、180 r/min振荡培养24 h为一级培养种子液。将一级培养种子液吸取60 µL接种到100 mL的2216E培养液中培养，28 °C、180 r/min振荡培养24 h。菌株H5-9Z的无菌滤液制备：将H5-9Z的菌悬液于4 ℃、8000 r/min的条件下离心30 min，弃沉淀得上清液并用0.22 μm的滤膜过滤。吸取 100 µL H5-9Z的无菌滤液在已接种黄瓜枯萎病致病菌的PDA平板上。同时，以同样的操作H5-9Z的菌悬液，以无菌的2216E液体培养基为对照，重复3次。在28 °C的培养箱中培养24 h，采用十字交叉法^［26］测量3、5和7 d抑菌直径。

1.3.4　胞外活性物质稳定性测定

将菌株H5-9Z在2216E液体培养基中28 ℃培养24 h，将发酵液4 ℃、8000 r/min离心30 min得上清液，上清液0.22 µm滤膜过滤备用。等比例滤液分别在30、50、70和90 ℃条件下静置30 min，评估温度稳定性。用0.01 mol/minHCl和NaOH调节pH分别为3.0、5.0、7.0、9.0、11.0和13.0，评估pH稳定性。将0.01 mol/min的K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺等比例加入5份滤液中室温静置3 h，评估金属离子稳定性。同等4份滤液分别在紫外线下照射1、2、3和4 h，评估紫外线稳定性（紫外线强度为4 W/m²）。采用平板对峙法测定滤液的抑菌活性（方法同上），CK组为无菌滤液不做任何处理，培养时间均为5 d，以上每组操作重复3次。

1.3.5　菌株H5-9Z与致病菌菌丝体的互作关系

采用双培养法，在PDA平板两侧等距接种H5-9Z和致病菌，共培养5 d，CK组接种致病菌其他不做处理。取抑制带旁的菌丝与正常菌丝进行扫描电镜对比，观察菌丝体形状。

1.3.6　灌根法测定菌株H5-9Z发酵液对黄瓜枯萎病的生防效果

将菌株H5-9Z在2216E培养基中培养24 h，培养及处理条件同（1.3.4）。将20 μL尖孢镰刀菌接种在100 mL的PDB培养基中，28 ℃、180 r/min培养24 h。将三叶期的黄瓜幼苗移栽到无菌土壤盆中，待幼苗生长稳定后，试验分为4组，每组15盆：A组加30 mL清水作为对照；B组加30 mL无菌PDB培养基；C组加10 mL尖孢镰刀菌和20 mL无菌PDB培养基；D组加10 mL尖孢镰刀菌和20 mL的H5-9Z发酵液。培养至20 d后，观测茎粗、株高、鲜重、总根长、叶色、根色及病情指数^［27］。病情指数=100×∑（发病苗数×发病程度）/（总株数×最高发病程度）；发病率=发病株数/总株数×100%；防治有效性=（对照组发病率-处理组发病率）/对照组发病率×100%。

1.3.7　抗生素的分离

将装有300 mL的2216E培养基三角烧瓶（500 mL）灭菌处理，接种菌株H5-9Z，培养条件及离心条件同1.3.4，上清液过0.22 µm滤膜。在硫酸铵饱和度为40%、50%、60%、和70%（质量分数）的条件下，缓慢加入并搅拌30 min，从上清液中沉淀出抗生素。继续搅拌30 min，用12 000 r/min离心20 min，溶解在磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH 8.0）中，在同一缓冲液中透析24 h，更换4次，除去硫酸铵。试验中使用的透析袋的截留分子量（MWCO）分别3500和14 000 Da。透析后将抗生素溶液用聚乙二醇浓缩至原始体积。透析后的粗制抗生素过30 kDa的超滤管，用上述方法测定粗抗生素对尖孢镰刀菌的抗菌活性，并以未透析的粗抗生素为对照。

1.3.8　数据的处理

使用Excel 2019 进行数据统计，使用SPSS 25.0 进行分析，Origin 2018软件绘图，MAGA-X建立发育树。

2 结果与分析

2.1　拮抗菌株的筛选

经过初筛，得到8株（表1）对黄瓜专化型枯萎病菌具有明显抑制作用的拮抗菌。进行复筛后，其中，H5-9Z（图1A）和N1-21H（图1B）抑菌作用高于较其它菌株，在7 d时抑菌率分别为82.67%和60.22%（表1），故将H5-9Z作为目标菌株。

2.2　拮抗菌的鉴定

2.2.1　菌株H5-9Z生理生化及形态特征鉴定

H5-9Z其菌落近圆形，表面光滑湿润呈淡黄色，形状呈杆状（图2），革兰染色结果H5-9Z为革兰氏阳性细菌。结合菌株H5-9Z的生理生化测定（表2），初步鉴为芽孢杆菌属（Bacillus spp.）。

2.2.2　16S rRNA基因分子鉴定

在GenBank数据库对菌株H5-9Z进行BLAST相似性比对，并进行发育树分析。结果显示，菌株H5-9Z与Bacillus pumilus strain L14 （OR607844.1）为同一分支，进化距离最近（图3），结合其生理生化特性，菌株H5-9Z鉴定为短小芽孢杆菌。并将菌株H5-9Z序列提交至GenBank获得登录号是PQ060413。

2.2.3　菌株H5-9Z的发酵液与无菌滤液抑菌对比

菌株H5-9Z具有很好的抑菌效果，随着时间的增加抑菌效果越发明显，培养至7 d后发酵液抑菌效果达到82.67%（表1）。对于无菌滤液的抑菌率而言，随着时间的增加抑菌率也在增加，抑菌率达到77.87%（图4）。菌株H5-9Z的菌悬液及其胞外活性产物对黄瓜枯萎病致病菌都具有很好的抑制作用。

2.2.4　不同条件下对菌株H5-9Z胞外活性物质的影响

胞外活性物质的稳定性试验结果（图5）表明，温度在70 ℃的条件下抑菌直径发生改变，表明胞外活性物质不耐受高温条件。菌株H5-9Z原菌液pH为8.0，在pH为3.0和13.0的条件下失去抑菌活性，表明其在强酸强碱性条件下失去了生物活性，越靠近中性条件下活性越好。在不同金属和紫外线条件下对活性物质的稳定性没有明显的影响。这一结果有助于为后续能否上发酵罐做准备。因为K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺等为土壤常见金属离子，也为后续盆栽试验做好准备。

2.2.5　菌株H5-9Z对致病菌菌丝体影响

双培养试验结果显示，在菌株H5-9Z的抑菌作用下，致病菌在H5-9Z处停止生长，与CK组对比表明拮抗菌株对致病菌具有明显的抑菌作用。扫描电镜结果显示，与致病菌的正常菌丝形态相比（图6A），被H5-9Z抑制的致病菌菌丝变得松散（图6B）、扭曲和粘连（图6C），菌丝体发生内聚折叠（图6D）。

2.2.6　菌株H5-9Z发酵液灌根的生防效果

菌株H5-9Z发酵液对尖孢镰刀菌抑制作用，通过灌根试验可以得出。加入H5-9Z发酵液后，植株能正常生长（表3），发病率明显降低，防治效果为57.65%，同时病情指数达38.33（表4）。而未加入H5-9Z发酵液组植株出现明显的枯黄、萎蔫及烂根的现象（图7），发病率到达95.67%，病情指数为80.01（表4）。以上研究表明，菌株H5-9Z对黄瓜枯萎病具有良好的抑菌作用。

2.2.7　抗生素的分离

当硫酸铵饱和度为50%（质量分数）时，沉淀具有抑菌效果。抑菌效率随硫酸铵饱和度的升高而增加，在硫酸铵饱和度为70%（质量分数）时达到最大值（图8）。用MWCO/3500 Da和14 000 Da透析袋透析的抗生素粗液的抗菌活性与对照无显著差异（图9、图10）。结果表明，抗生素的相对分子质量在33 kDa以上。

3 讨论与结论

由于与生俱来的耐高盐、高压、高温及干旱的特性，芽孢杆菌属已成为理想的生防菌筛选对象。因其能够产生多种活性物质，得到广泛应用。在生防菌剂中，芽孢杆菌属最多，枯草芽孢杆菌（B.subtilis）^［29］、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）^［30］、多粘芽孢杆菌（B.polymyxa）和蜡样芽孢杆菌（B.cereus）^［31］等是报道最多的几种菌。唐彤彤等^［32］筛选的海洋源赤杆菌属YH-07对番茄枯萎病具有生防效果，其防治效果在50%以上。而虞凡枫等^［33］从敦煌盐碱地区中筛选的内生芽孢杆菌A7-3-14对黄瓜枯萎病具有很好的拮抗作用，其防治效果更是达到了69.77%。张美君等^［34］从蚯蚓粪中筛选出来的一株解淀粉酶芽孢杆菌WQ-5对黄瓜枯萎病具有抑制作用，通过优化培养条件其抑菌率提高了30.39%，种子萌发率提高了150%，发病率降低了20%。而本研究筛选的短小芽孢杆菌H5-9Z发酵液对黄瓜枯萎病抑菌率达82.67%，无菌滤液抑菌率达到77.87%，抑菌作用明显。研究表明，枯草芽孢杆菌可以分泌几种抗真菌代谢物，例如枯草菌素、表面活性素^［35］和蛋白质^［36］，在植物的定殖过程中可以很好的发挥效果，这是生防菌株能否在植物根际或根部有效定殖的关键一步^［37］，植物促生根际细菌的有效定殖有助于成功抑制植物病原体。在定殖后，生防菌产生的胞外活性物质是否稳定是至关重要的，这是生防菌与土著菌竞争的重要手段^［38］。在对短小芽孢杆菌SQR-N43研究过程中发现，菌株SQR-N43可以引起红曲霉菌丝变形、胞质空泡增大和胞质渗漏，同时在根表面上形成了生物膜，稳定了菌群并增加了拮抗剂的活性形式^［39］。枯草芽孢杆菌B29菌株产生一种相对分子质量为42.3 kDa的蛋白质，该蛋白质对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、串珠镰刀菌和核盘菌的菌丝生长具有抑制作用^［40］。伊利诺拟青霉KJA-424产生3种能抑制立枯丝核菌菌丝的几丁质酶，其相对分子质量分别为63、54和 38 kDa^［41］。Botton等^［42］报道了短小芽孢杆菌MSH产生的一种化合物对毛霉科和曲霉有抑制作用，该化合物的相对分子质量范围为500~3000 Da。短小芽孢杆菌HY1菌株产生的伊枯草菌素的相对分子质量为1 043.4 Da^［43］。

本试验室以抑制黄瓜枯萎病为目的，从海泥中分离筛选的菌株H5-9Z对黄瓜枯萎病的抑菌效果最好。为了进一步研究其潜在的应用价值，经生理生化特征分析，及16S rRNA序列分析，通过NCBI数据库比较，菌株H5-9Z为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。通过抑菌试验可得发酵液抑菌率达到82.67%，无菌滤液抑菌率达到77.87%，结果表明，菌株H5-9Z产生的胞外活性物质在抑制黄瓜枯萎病时起到重要的作用。同时对其胞外活性物质进行了探究试验，发现活性物质不耐受高温条件，且对紫外线和金属离子不敏感，在中性条件和碱性条件下都有较好的生物活性，这使得可以在碱性土壤中应用，并为后续的盆栽试验做了准备。在扫描电镜观察中发现，菌株H5-9Z对致病菌的抑菌机制可能与阻止菌丝生长有关，使致病菌菌丝体异常，从而形成抑制区，使其失去侵袭能力。同时，通过盆栽试验可得，在含有H5-9Z发酵液时的防治效果为57.65%，发病率为46.67%，病情指数为38.33，通过观察幼苗的生长状态可以看出具有较强的抗病能力。本研究进一步对抑菌化合物进行探究过程中发现，在初步使用超滤管及透析袋（3500 Da和14 000 Da）进行透析浓缩后，发现主要的抑菌化合物分子质量范围在33~95 kDa，在后续试验中将对该化合物进行纯化分离。通过以上试验探究，菌株H5-9Z对黄瓜枯萎病具有良好的生防作用，为后续的应用开发提供了可能性。

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基金资助

安徽省科技厅自然科学基金面上项目(2108085MC87)