芪松楂散对Wistar大鼠的毒性试验

Toxicity test of Qisongzha powder in Wistar rats

摘要

目的 研究芪松楂散长期添加对动物是否具有毒性作用。 方法 将80只4周龄Wistar大鼠（雌雄各半）随机分为4组，分别为高（A）、中（B）、低（C）和空白对照（D），每组20只（雌雄各半），采用拌料方式给药。A组为添加芪松楂散90 g/kg饲料，B组为添加芪松楂散45 g/kg饲料，C组为添加芪松楂散15 g/kg饲料，D组为空白对照组。按照上述添加剂量，饲喂Wistar大鼠90 d。每日对大鼠的饮水、进食情况、粪便性状、行为活动、体表特征、精神状态和死亡等情况进行观察；喂药前对大鼠进行称重，之后每30 d称重，计算总增质量；第90天各组眼眶后静脉丛采血检测血液学指标和生化指标，对以下脏器称重并计算脏器系数（脏/体比）：肝、肾、脾、胸腺、睾丸、肺、心和卵巢，并对肝、肾、肺、小肠、大肠、心和脾脏器管进行病理组织学检查。 结果 与空白对照组相比，各用药组Wistar大鼠饮水、采食、粪便、运动、体表特征、精神状态和死亡均未见异常；各用药组体质量增加都极显著高于空白对照组（P<0.01）；血常规指标结果显示，各用药组的雄鼠血液指标与空白对照组差异不显著（P>0.05），雌鼠90 g/kg饲料组的白细胞数显著高于空白对照组（P<0.05），雌鼠的血液指标在各用药组与空白对照组无显著差异（P>0.05）；血液生化指标结果显示雄鼠和雌鼠A、B和C组的总胆固醇含量都显著（P<0.05）或极显著低于D组。其余血液生化指标均保持在正常范围内，且雌性或雄性大鼠的各组间均未发现显著差异（P>0.05）；各用药组的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、胸腺、睾丸和卵巢指数与空白对照组相比无显著差异（P>0.05）；剖检和组织学HE染色观察结果显示，各用药组肾脏、肺脏、小肠、大肠、肝脏、心脏和脾脏眼观和显微镜观察都未见异常变化。 结论 在90天长期毒性试验中未观察到芪松楂散对大鼠有害作用，未观察到有害作用的剂量为90 g/kg。

Abstract

Object The current study aimed to study whether the long-term dietary supplementation of Qisongzha powder has toxic effects on Wistar rats. Method Eighty 4-week-old Wistar rats （half male， half female） were randomly divided into four groups： high-dose （A）， medium-dose （B）， low-dose （C）， and blank control （D） with 20 rats per group （half male， half female）. The drug was administered by mixing it into feed. Group A received Qisongzha powder at 90 g/kg feed， group B at 45g/kg feed， group C at 15g/kg feed， and group D served as the blank control group. The rats were fed accordingly for 90 days. Daily observations included water intake， food consumption， fecal characteristics， behavioral activity，coat condition， mental state， and mortality. Body weight was measured before administration and every 30 days thereafter， with total weight gain calculated. On day 90， blood samples were collected from the retroorbital venous plexus of each group for hematological and biochemical analyses. The following organs were weighed to calculate organ coefficients （organ-to-body weight ration）： liver， kidney， spleen， thymus， testis， lung， heart， and ovaries. Histopathological examinations were performed on the liver， kidney， spleen， intestine， lung， heart， and spleen. Results Compared with the control group，no abnormalities were observed in water intake， feeding， feces，movement， coat condition， mental state， or mortality in any treatment group. Body weight gain in all treatment groups was significantly higher than in the control group（P<0.01）. Hematological results showed no significant differences in male rats between control and treatment groups （P>0.05），while female rats in the 90g/kg group had statistically significant higher white blood cell counts than the control group （P<0.05）. Other blood parameters in females showed no significant differences（P>0.05）. Biochemical analysis revealed that total cholesterol levels in both male and female rats in group A， B， and C were significantly lower than in Group D （P<0.05）. Other biochemical indicators remained within normal ranges， with no significant differences between groups. Organ indices （heart， liver， spleen， kidney， lung， thymus， testes， and ovaries） showed no significant differences compared with control group （P>0.05）. Gross and histopathological （HE staining） observation showed no abnormal changes in the kidney，lungs， small intestine， large intestine， liver， heart， or spleen in any treatment group. Conclusion Long-term feeding of Qisongzha powder at doses up to 90 g/kg is safe to rats.

Graphical abstract

关键词

黄芪 / 山楂 / 松针 / Wistar大鼠

Key words

Astragalus membranaceus / Hawthorn fruit / Pine needle / Wistar rats

随着生活水平的日益提升，食品安全问题越来越受到消费者们的关注。健康的动物才能生产出健康的畜产品，因此最近几年公众对饲料添加剂安全性的关注也与日俱增。为了控制兽药残留以及动物源耐药细菌的危害，根据农业农村部发布的第194号公告，要求自2020年1月1日起，所有非中药类的促生长类药物饲料添加剂均被禁止使用^［1］，中药添加剂在畜牧养殖上的应用与重要性与日俱增。

本试验所用芪松楂散为黄芪、松针和山楂提取物所混合，所用原料均为天然植物，符合农业农村部对养殖添加剂的要求。很多研究发现日粮中添加黄芪^［2-4］、山楂^［5］、松针^［6-9］可以提高动物的生产性能、抗病能力和抗氧化能力。

芪松楂散在之前的试验中也表现出对蛋鸡^［10］、肉鸡^［11］生产性能和抗氧化能力的提升，适宜添加量分别为2和3 g/kg。但是尚未对使用芪松楂散的毒性进行试验。本试验采用Wistar大鼠作为试验动物，将芪松楂散分别按照90、45和15 g/kg的剂量饲喂大鼠，检验大剂量芪松楂散饲喂下对大鼠的毒性作用。

1 材料与方法

1.1　试验材料

1.1.1　试验药材

芪松楂散中试产品，中试批号2020901，由四川恒通动保生物科技有限公司生产提供。

1.1.2　试验试剂

无水乙醇由天津市致远化学试剂有限公司提供，甲醛由永华化学股份有限公司提供，二甲苯由天津市富宇精细化工有限公司提供，苏木素和伊红染色液均由湖北安立信医疗实业有限公司提供。

谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、肌酐、血糖、总蛋白、白蛋白、球蛋白、血浆尿素、总胆固醇和甘油三酯试剂盒均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

1.1.3　试验仪器

全自动血液分析仪（希森美康医用电子有限公司，XE-2100）；全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，BS180）；正置显微镜（奥林巴斯，BX51）。

1.1.4　实验动物

80只Wistar大鼠由山西医科大学实验动物中心提供，均为4周龄，雌雄各半，体质量140~160 g，合格证号：SCXK（晋）2020—0001。将购回的Wistar大鼠饲养观察1周后进行试验。

1.1.5　实验动物饲料

由江苏省协同医药生物工程有限责任公司（Jiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co.， Ltd.）生产提供生产许可证号为苏饲证（2014）01008的实验动物饲料。

1.2　试验方法

1.2.1　试验动物与分组

将精神状态良好，体重相近的Wistar大鼠雌、雄各40只随机分为高（A）、中（B）、低（C）和空白对照（D）4组，每组雌雄各10只，雌雄分开饲养。A组的芪松楂散添加量为90 g/kg饲料，B组为45 g/kg饲料，C组为15 g/kg饲料，D组为空白对照组。试验周期为90 d。

1.2.2　观察指标

（1）　临床观察

常规行为观察：观察并记录大鼠每日的饮水情况、进食情况、粪便性状、行为活动、体表特征、精神状态和死亡等情况。

体质量统计：喂药前对大鼠进行称重，之后每30 d称重，计算总增质量。

（2）　血常规和血液生化指标检测

在第90天，对大鼠称量，每组抽取10只大鼠（雌、雄各半）进行眼眶后静脉丛采血2 mL（加抗凝剂），测定血液学指标，另采2 mL血液，分离血浆，检测血液生化指标。

血液学指标：红细胞计数、白细胞计数、血红蛋白含量及嗜中性、嗜酸性、嗜碱性、淋巴和单核细胞的分类计数。

生化指标：谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、肌酐、血糖、总蛋白、白蛋白、球蛋白、血浆尿素、总胆固醇和甘油三酯。

（3）　病理检查

大体解剖：在试验结束时，各组取10只大鼠（雌、雄各半）进行剖检，记录大体病理变化。

脏器称量：对大鼠进行剖检时，需同时对大鼠的体质量进行称量，且对大鼠主要脏器肝、肾、脾、胸腺、睾丸、肺、心和卵巢的质量进行称量，并对各脏器系数（脏/体比值）进行计算。

组织病理学检查：对大鼠的肝、肾、脾、肠、肺和心脏进行病理组织学检查。

1.2.3　数据分析

采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析，多重比较分析通过Tukey法进行。数据结果以“平均值±标准差”的形式呈现。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1　芪松楂散对大鼠一般行为、体质量的影响

在试验过程中，各组大鼠临床指标（包括饮食、饮水、行为、呼吸和粪便性状等）均保持正常，且各组大鼠皮毛整洁，并且用药组与对照组均无异常变化出现，且均未观察到中毒和死亡的情况出现。

从表1中可以看出，芪松楂散高（A）、中（B）、低（C）和空白对照组（D）各组雄鼠只体质量分别增加了464.25、464.18、460.47、451.14 g，雌鼠体质量分别增加了204.13、204.04、199.99、181.48 g，其中雄鼠增量总体大于雌鼠。在试验末期，雄鼠的体质量极显著高于其空白对照组（P<0.01），雌鼠的A、B组体质量极显著高于D组（P<0.01），C组显著高D组（P<0.05），各用药组的增量均极显著高于空白对照组（P<0.01）。

2.2　芪松楂散对大鼠血常规的影响

雄鼠和雌鼠的血常规8项指标（白细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、红细胞数、单核细胞、血红蛋白和淋巴细胞）均在正常范围内。雄鼠的8项指标在各组间均无显著差异（P>0.05）。雌鼠A组的白细胞数显著高于D组（P<0.05），其它4项指标在各组间无显著差异（P>0.05），详细结果见表2。

2.3　芪松楂散对大鼠血液生化的影响

从表3可以看出，雄鼠和雌鼠A、B和C组的总胆固醇含量都显著（P<0.05）或极显著低于D组。其余血液生化指标均在正常范围内，且雌鼠或雄鼠的各组间均无显著差异（P>0.05）。

2.4　芪松楂散对大鼠主要器官指数的影响

雄鼠和雌鼠的主要器官指数（包括心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、胸腺、睾丸和卵巢指数）各组间无显著差异（P>0.05），详细结果见表4。

2.5　芪松楂散对大鼠主要器官组织学观察及影响

Wistar大鼠各主要器官外形正常且色泽正常，各部位（胸腔、腹腔、心包和脏器）之间未见积液或粘连，未观察到充血、出血、肿胀和坏死等肉眼可见病变现象。

显微镜下观察各组脏器微观病理变化，各组脏器无眼观病理变化。各组肾脏肾小球、肾小管排列整齐，细胞形态正常（图1）；肺脏结构正常，肺泡腔内无渗出物（图2）；小肠和大肠绒毛整齐，无脱落现象（图3、图4）；肝索整齐排列，肝小叶完整（图5）；心肌纤维排列整齐，中心排列的细胞核及细胞之间没有分界线（图6）；脾组织结构正常（图7）。）

3 讨论

整个试验期间，对照组和各用药组大鼠精力充沛，呼吸正常，活泼好动；食欲旺盛，粪便性状正常；皮肤富有弹性，被毛光滑明亮，个体增量迅速。

在饲养90 d后，各用药组的平均增量均极显著高于对照组，而各用药组之间无显著差异。芪松楂散作为一种复方中药，它的成分对动物具有多种功效，如提升机体免疫力^［12-13］、消食健胃^［14］和抗氧化^［15］的作用，可以全面改善动物的健康状态，降低动物在亚健康和过氧化生理状态下消耗的能量和营养，提高生产性能^［16］。

在饲喂芪松楂散之后各用药组的血浆谷丙转氨酶和谷草转氨酶的浓度和对照组在方差分析上均没有显著差异，说明芪松楂散对大鼠的肝脏、心脏并没有造成损伤。崔小珍^［10］发现饲喂芪松楂散之后，可以提高动物血液中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，降低血液中过氧化物的含量。研究发现^［17-18］降低血液中的过氧化物可以保护细胞和线粒体完整性，有助于线粒体发挥生理功能，改善动物的能量代谢^［18］。这一系列研究证明芪松楂散可以通过降低动物体内的过氧化物，提高动物体内的能量储备，促进能量代谢，为机体的生长和运动提供足够的能量。

芪松楂散中含有的黄芪和山楂都具有降脂降胆固醇的作用^［19-21］。山楂中含有的黄酮类，如金丝桃苷、槲皮素、异槲皮素等可以提高胆固醇7α-羟化酶的表达水平，使胆固醇转化为胆汁酸^［22］排出体外。陈皓^［23］使用核磁共振（NMR）技术研究山楂对大鼠体内代谢的影响发现，饲喂山楂可以显著降低血液中与脂肪相关的物质的浓度，如胆固醇^［24］、多不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸等，以上研究都说明黄芪、山楂可以降低机体的胆固醇。本试验结果芪松楂散高中低组都可以极显著降低雄鼠的总胆固醇含量，显著降低雌鼠的总胆固醇含量，与先前的研究结果一致。

本试验中长期饲喂芪松楂散对大鼠脏器指数无显著影响，解剖病变和显微组织学病理学观察未见眼观病理变化，说明长期饲喂芪松楂散大鼠脏器无影响。

4 结论

在本次90天长期毒性试验中未观察到芪松楂散对大鼠有害作用，未观察到有害作用的剂量为90 g/kg。

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基金资助

吕梁市校地合作科技成果转化项目(2023XDHZ13)

山西农业大学横向科技项目(2024HX016)