月季3种病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

Establishment and application of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of three viruses infecting Rosa chinensis

摘要

目的 月季是我国重要的观赏花卉，李属坏死环斑病毒（prunus necrotic ringspot virus，PNRSV）、苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus，ASGV）、月季潜隐病毒1（rose cryptic virus 1，RCV1）是侵染月季的主要病毒，与其它病毒复合侵染月季时，对其生长和发育可造成严重影响。本文旨在建立灵敏、便捷地检测月季中这3种病毒的RT-LAMP检测方法。 方法 本研究以病毒CP基因为靶序列设计特异性引物，建立侵染月季的PNRSV、ASGV和RCV1的RT-LAMP检测方法，并对反应体系中Mg²⁺浓度和dNTP使用浓度、反应温度和反应时间进行了优化，并对反应灵敏度和特异性进行了检测。 结果 该方法在恒温条件（61 ℃）下即可对目标病毒实现可视化特异性检测，检测体系中Mg²⁺和dNTP最佳使用浓度分别为5.0 mmol/L和1.2 mmol/L；本研究所建立的RT-LAMP检测方法，RCV1、PNRSV和ASGV可以检测到病毒的最低浓度分别为3.19×10⁵、6.44×10⁴和4.04×10⁴拷贝/µL，灵敏度是RT-PCR的100~1000倍，而且检测体系具有很好的反应特异性，与侵染月季的其它病毒之间不存在交叉反应；使用该RT-LAMP检测方法随机对田间19个样品进行检测，可通过颜色变化，能准确检测出样品中的目标病毒，而无需借助琼脂糖凝胶电泳或其它专门仪器。 结论 该方法可通过直接添加染料实现可视化，具有快速、便捷、特异性好特点，适用于侵染月季的PNRSV、ASGV和RCV1的快速诊断及田间监测。

Abstract

Objective Chinese rose is an important ornamental flower in China. Prunus necrotic ringspot virus （PNRSV）， apple stem grooving virus （ASGV） and rose cryptic virus 1 （RCV1） are important viruses infecting Chinese rose. When these three viruses co-infect roses alongside other viruses， they severely impact the growth and development of the plants. The purpose of this study was to establish a sensitive and convenient RT-LAMP method for detecting these three viruses in Chinese rose. Methods Specific primers targeting the viral CP gene sequence were designed to establish an RT-LAMP detection method for PNRSV， ASGV， and RCV1 infections. The reaction system's Mg²⁺ concentration， dNTP concentration， reaction temperature， and reaction time were optimized. Sensitivity and specificity were evaluated to ensure the reliability of the method. Results The optimized RT-LAMP method successfully detected the target viruses at a constant temperature of 61 ℃. The optimal concentrations were 5.0 mmol/L for Mg²⁺ and 1.2 mmol/L for dNTPs. This method exhibited high sensitivity， detecting RCV1 at a minimum concentration of 3.19×10⁵ copies/µL， PNRSV at 6.44×10⁴ copies/µL， and ASGV at 4.04×10⁴ copies/µL. These sensitivities were 100 to 1 000 times higher than those achieved by RT-PCR. Furthermore， the detection system exhibited excellent specificity， with no cross-reactions observed with other rose-infecting viruses. The RT-LAMP method was applied to nineteen field samples， enabling accurate viruses identification through visual color changes without the need for agarose gel electrophoresis or specialized instruments. Conclusion The RT-LAMP detection method developed in this study is a rapid， convenient， and highly specific tool for diagnosing and monitoring PNRSV， ASGV， and RCV1 infections in roses. Its visualization-based approach， allowing direct dye addition during testing， is particularly suitable for field applications and rapid diagnostics.

Graphical abstract

关键词

月季 / 病毒 / RT-LAMP / 检测方法

Key words

Chinese rose / Virus / RT-LAMP / Detection method

月季（Rosa chinensis Jacq.）广泛用于鲜切花、园林装饰及城市绿化。月季病毒病在世界各月季产区普遍发生。据报道侵染月季的病毒有30多种^［1-5］，常见的有等轴不稳定环斑病毒属的李属坏死环斑病毒（prunus necrotic ringspot virus，PNRSV）和苹果花叶病毒（apple mosaic virus，ApMV）^［6］、黄症病毒属的玫瑰春天坏死环斑病毒（rose spring dwarf-associated virus，RSDaV）^［7］、蔷薇DNA病毒属的蔷薇黄脉病毒（rose yellow vein virus，RYVV）^［8］、发形病毒属的苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus，ASGV）^［9］、Partitiviridae病毒科的月季潜隐病毒 1（rose cryptic virus 1，RCV1）^［10］等。其中，PNRSV、ASGV、RCV1分布广泛。病毒的侵染不仅可以显著降低植株的活力，而且多种病毒复合侵染时会严重影响植物的生长和发育，使月季丧失经济价值，造成经济损失。

目前，月季病毒的诊断方法主要有：电镜观察法、血清学检测法和分子生物学检测法，其中分子生物学检测法中的PCR及其衍生技术和高通量测序最为常用。朱良俊等^［11］通过RT-PCR技术在海宁月季中检测出PNRSV，2010年RSDaV通过RT-PCR在月季植株中检测出^［7］，郭俊等^［12］采用免疫捕捉RT-PCR（Immunocapture reverse transcription polymerase chain reaction， IC-RT-PCR）在月季上检测出PNRSV，张秀琪等^［1］采用高通量测序在北京月季中检测到ASGV、PNRSV和柑橘碎叶病毒（citrus tatter leaf virus，CTLV）等病毒。作为常用的分子生物学检测技术的RT-PCR有一些关键性限制因素，易导致假阳性和假阴性结果出现；高通量测序则由于费用较高，技术要求严格，严重限制了技术的普及利用。

近年来发展起来的环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由于操作简便、反应迅速、特异性强等特点能够快速明确侵染病毒的种类^［13］，该方法可以在恒温条件下对靶基因进行扩增，反应结束后加入荧光染料即可观察结果，在一定程度上得到了广泛的应用^［14-19］。

本研究依据PNRSV、ASGV和RCV1的CP基因序列，设计病毒RT-LAMP检测体系的特异性引物，评估其特异性及灵敏性，并进行田间样品检测应用，以期为侵染月季的PNRSV、ASGV和RCV1这3种病毒的早期诊断、预测预报及综合防控等提供检测技术支撑。

1 材料和方法

1.1　试验材料

本试验所用的月季样品为2020年9月-2021年12月，在河南、江西、上海、广东、湖南、浙江、江苏7个省市采集的表现疑似病毒症状的月季叶片，保存在-80 ℃超低温冰箱备用。

植物总RNA提取试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、2×Accurate Taq Master Mix（dye plus）、GL DNA Marker 2000、DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，TA零背景快速克隆试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，大肠杆菌DH5α感受态购自北京擎科生物科技有限公司，Bst DNA Polymerase购自NEB生物公司，SYBR Green Ⅰ 购自晶美生物公司。

1.2　试验方法

1.2.1　引物设计

以NCBI网站上PNRSV（NC_004364.1）、ASGV（LC671524.1）和RCV1（MK075827.1）3种病毒的CP基因为靶序列，设计RT-LAMP检测体系的特异性引物。RT-PCR检测引物利用Primer Premier 5.0软件设计；RT-LAMP检测引物利用网站http：//primerexplorer.jp/e/在线设计，每种病毒设计4条引物，即上游内部引物（FIP）、上游外部引物（F3）、下游内部引物（BIP）和下游外部引物（B3）。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物信息见表1和表2。

1.2.2　植物总RNA的提取及反转录

参照试剂盒说明书提取月季发病叶片总RNA，提取后进行琼脂糖凝胶电泳检测并使用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。合格的RNA参照第一链cDNA合成试剂盒说明书反转录获得cDNA，置于-20 ℃保存备用。同时取部分cDNA进行10倍梯度稀释，3种病毒稀释后的浓度分别为：PNRSV 6.44×10¹⁰~6.44×10⁴拷贝/µL，ASGV 4.04×10¹⁰~4.04×10⁴拷贝/µL，RCV1 3.19×10¹⁰~3.19×10⁴拷贝/µL，稀释后的cDNA作为后续试验RT-PCR和RT-LAMP灵敏度检测的共同模板。

1.2.3　RT-PCR反应及灵敏度检测

取上述3种病毒进行梯度稀释后的cDNA为模板，分别进行RT-PCR反应。10 µL检测体系包含：2×Accurate Taq Master Mix 5 µL，上游引物（10 µmol/L）和下游引物（10 µmol/L）各0.5 µL，cDNA 0.5 µL，ddH₂O 3.5 µL。反应条件为：94 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸2 min。取5 µL产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4　RT-LAMP反应质粒的构建

取上述所得cDNA为模板，以表2中F3和B3为引物，进行PCR反应。30 µL反应体系包含：2×Accurate Taq Master Mix 15 µL；F3（10 µmol/L）1.5 µL；B3（10 µmol/L）1.5 µL；cDNA 1.2 µL；ddH₂O 10.8 µL。PCR反应条件为：94 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；最后72 ℃延伸2 min。反应结束，参照相应试剂盒的方法对上述PCR产物进行回收、克隆、转化及质粒DNA的提取，质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳检测后，用于后续RT-LAMP检测体系的建立和条件优化的反应模板。

1.2.5　RT-LAMP最初反应体系

分别取上述连接了PNRSV、ASGV和RCV1片段的质粒DNA为模板，根据Bst DNA Polymerase（Large Fragment，NEB生物公司）说明书推荐设计25 µL体系进行RT-LAMP检测：10×ThermopoL Buffer 2.5 µL，MgSO₄（100 mmol/L）1.5 µL，dNTP（10 mmol/L）3.5 µL，引物F3和B3（10 µmol/L）各0.5 µL，引物FIP和BIP（10 µmol/L）各3.5 µL，Bst DNA Polymerase（8 U/µL）1 µL，模板质粒DNA 1 µL，ddH₂O 7.5 µL。初始反应体系为60 ℃反应70 min，然后80 ℃反应10 min使酶丧失活性并终止反应。反应结束后，取5 µL产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，同时向RT-LAMP产物中加入2 µL SYBR Green I（稀释10倍），观察其颜色的变化情况，若染料变为荧光绿色则为阳性，若仍为橘红色则为阴性。

1.2.6　RT-LAMP检测体系的优化

RT-LAMP检测体系的优化所用模板为1.2.4所构建的携带病毒片段的质粒DNA。本试验尝试了7种Mg²⁺浓度（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mmol/L）和7种dNTP浓度（0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mmol/L）梯度的优化。首先优化了Mg²⁺浓度，同时保持其它组分的浓度不变。然后在最佳的Mg²⁺浓度下优化dNTP的浓度。此外，本试验将最适合的RT-LAMP反应体系分别置于58~65 ℃的温度梯度反应70 min以确定最佳反应温度。此后，在最佳反应温度下分别反应60、65、70、75、80 min，以确定最佳反应时间。

1.2.7　RT-LAMP反应灵敏度检测

取1.2.2中进行梯度稀释后的cDNA为模板，以优化后的最终反应体系和条件进行RT-LAMP反应灵敏度检测，结果与RT-PCR进行比较。

1.2.8　RT-LAMP反应特异性测定及田间样品检测

分别选取同一批采集的感染苹果花叶病毒（ApMV）、玫瑰黄脉病毒（RYVV）、玫瑰春天坏死环斑病毒（RSDaV）的样品，这些样品中所含病毒已通过高通量测序和RT-PCR检测确认过，无病健康植株为阴性对照，提取叶片总RNA，反转录成cDNA为模板，以优化后的反应体系和条件进行RT-LAMP反应特异性检测，用以判断该体系是否和其它病毒有交叉反应，并通过SYBR Green I染色对RT-LAMP产物进行可视化检测。

为了验证本研究建立的RT-LAMP检测体系的实用性，随机选取从田间采集的19个疑似感染病毒的月季样品进行RT-LAMP检测，通过SYBR Green I染色对RT-LAMP产物进行可视化观察，使用RT-PCR检测进行对比。

2 结果与分析

2.1　RT-LAMP反应体系Mg²⁺浓度和dNTP使用浓度优化

本试验首先对RT-LAMP反应体系中Mg²⁺浓度进行优化。结果发现，PNRSV在Mg²⁺浓度为5.0、6.0、7.0 mmol/L时均发生反应；ASGV和RCV1在Mg²⁺浓度为5.0、6.0 mmol/L时发生反应，且均在Mg²⁺浓度为5.0 mmol/L时出现LAMP典型梯状条带（图1），所以选取5.0 mmol/L作为3种病毒RT-LAMP检测体系后续试验中Mg²⁺最佳使用浓度。然后，在Mg²⁺最佳浓度5.0 mmol/L下优化体系中dNTP使用浓度，结果表明3种病毒在dNTP浓度达到1.2 mmol/L和1.4 mmol/L时出现典型梯状条带（图2），因此选择1.2 mmol/L作为3种病毒RT-LAMP检测体系后续试验中dNTP的最佳使用浓度。

2.2　RT-LAMP检测体系反应温度和反应时间优化

为保证扩增效果，本研究设置58~65 ℃的温度梯度，对RT-LAMP反应温度进行优化。结果表明，3种病毒在第3泳道均有明显梯状条带（图3），因此确定最接近第3泳道反应温度的61 ℃为最适反应温度。

在最佳反应温度61 ℃下，再分别设置60、65、70、75、80 min的反应时间梯度，以确定RT-LAMP检测体系的最佳反应时间。结果表明，3种病毒在反应70、75、80 min时均出现典型梯状条带，且在75、80 min反应较好（图4），因此确定75 min为后续试验RT-LAMP检测体系最佳反应时间。

2.3　RT-LAMP可视化检测

组合运用优化后的检测体系进行RT-LAMP可视化检测。25 µL体系包含10×Thermopol Buffer 2.5 µL，MgSO₄（100 mmol/L）1.25 µL（5 mmol/L），dNTP（10 mmol/L）3 µL（1.2 mmol/L），引物F3和B3（10 µmol/L）各0.5 µL，引物FIP和BIP（10 µmol/L）各3.5 µL，Bst DNA Polymerase（8 U/µL）1 µL，模板质粒DNA 1 µL，ddH₂O 8.25 µL。61 ℃反应75 min后，80 ℃反应10 min终止反应，加入2 µL SYBR Green I（稀释10倍），观察其颜色变化情况。结果显示，含有目标病毒的试管中加入SYBR Green I 染料后反应液颜色变为荧光绿，为阳性反应，而阴性对照不发生颜色变化，仍为橘红色（图5），说明该体系能实现目标病毒的可视化检测。

2.4　RT-PCR和RT-LAMP检测灵敏度比较

取PNRSV、ASGV和RCV1的cDNA依次进行10倍梯度稀释，分别进行RT-PCR反应和RT-LAMP反应灵敏度检测。结果显示，3种病毒RT-PCR可以检测到的病毒最低浓度分别为PNRSV 6.44×10⁷拷贝/µL，ASGV为4.04×10⁷拷贝/µL，RCV1为3.19×10⁷拷贝/µL（图6）。RT-LAMP反应中RCV1最低可以检测到3.19×10⁵拷贝/µL，灵敏度是RT-PCR的100倍；PNRSV和ASGV最低可以检测到6.44×10⁴拷贝/µL和4.04×10⁴拷贝/µL，灵敏度是RT-PCR的1000倍（图7）。

2.5　RT-LAMP反应特异性测定

分别选取同一批采集的感染其它病毒的月季样品进行RT-LAMP反应特异性检测。结果表明，只有含有目标病毒的样品，加入SYBR Green I染料后才能观察到荧光绿即阳性反应，其它未含有目标病毒的样品不发生颜色变化，仍为橘红色（图8）。结果说明，本研究所建立的检测侵染月季的PNRSV、ASGV和RCV1病毒的RT-LAMP检测体系具有较强的特异性，能特异检测出样品中是否含有目标病毒，而与其它侵染月季的病毒无交叉反应。

2.6　利用建立的RT-LAMP体系检测田间样品

为了验证建立的RT-LAMP体系检测效果，针对3种病毒分别随机选取田间采集的部分月季病毒样品，对样品中的PNRSV、ASGV和RCV1进行RT-LAMP可视化检测，同时使用表1中的引物进行RT-PCR检测结果进行对比。结果表明，待测样品试管中加入SYBR Green I 进行RT-LAMP可视化检测时PNRSV、ASGV和RCV1分别有10个、7个和10个样品颜色由橘红色变为荧光绿，即为阳性样品，其它样品无颜色变化，仍呈橘红色，即为阴性。进一步通过RT-PCR进行检测结果的验证，RT-LAMP检测中呈荧光绿的样品中均扩增出了相应的目的条带，表明有目标病毒的存在。RT-LAMP可视化检测反应与RT-PCR验证结果一致，且对于RT-PCR检测弱阳性的样品仍可观察到明显的荧光绿（图9）。说明本研究建立的3种月季病毒的RT-LAMP检测技术能准确检测出样品中的目标病毒，通过反应颜色变化即可判定阳性结果，且无需使用琼脂糖凝胶电泳或专门仪器，可有效用于田间月季样品中PNRSV、ASGV和RCV1病毒的特异性检测。

3 讨论

LAMP是Notomi等^［13］于2000年开发的一种新型核酸扩增方法，该方法基于其不需要昂贵仪器设备，在等温条件下即可特异、快速、高效、灵敏地扩增靶序列，随即便广泛应用于多种病原和转基因安全的检测中，在植物病毒检测中的应用尤为突出。Fukuta等^［20］首先应用该技术检测植物RNA病毒——日本山药花叶病毒（japanese yam mosaic virus，JYMV），可直接从受侵染的种子、叶片、根、茎中快速检测出JYMV。Nie^［21］以马铃薯Y病毒（potato virus Y， PVY）的CP基因作为靶标，分别利用一步RT-LAMP和两步RT-LAMP技术检测了240份马铃薯样品中的PVY，检出率均达到97.5%。我国的研究学者也建立了一些植物病毒的LAMP检测体系，如建兰花叶病毒（cymbidium mosaic virus，CyMV）^［22］、番茄不孕病毒（tomato aspermy virus，TAV）^［23］、菜豆荚斑驳病毒（bean pod mottle virus， BPMV）^［24］、玉米褪绿斑驳病毒（maize chlorotic mottle virus，MCMV）^［25］、马铃薯卷叶病毒（potato leafroll virus， PLRV）^［26］、桑脉带相关病毒（mulberry vein banding-associated virus， MVBaV）等^［27］，检测灵敏度比RT-PCR高10~1000倍，且反应时间比RT-PCR所需时间短。Zhao等以百合斑驳病毒（lily mottle virus， LMoV）^［28］和百合无症病毒（lily symptomless virus，LSV）^［29］的CP基因为靶序列，建立百合病毒的LAMP和RT-LAMP检测方法，具有高特异性和高灵敏性，与常见侵染百合的多种病毒无交叉，LMoV可在模板纯度只有10个拷贝数下进行扩增，LSV的检测灵敏度可达0.000 1 ng/L。鉴于LAMP技术的快速准确的检测特点，在口岸检疫中应用也很广泛。当前，国内外已针对12个属的20种植物检疫性病毒和1种植物检疫性类病毒开发了LAMP检测技术^［18］。

月季多采用扦插和嫁接等无性方式扩繁，在此过程中易引起病毒的富集和持续扩散，而且，月季病毒在自然条件下存在普遍的复合侵染现象。本研究建立的PNRSV、ASGV和RCV1 RT-LAMP检测技术，特异性强，只针对目标病毒呈阳性反应，与侵染月季的其它病毒之间不存在交叉反应，利于从复合侵染的样品中检测目标病毒；灵敏度高，检测同一批样品时，RT-LAMP检测方法灵敏度是常规RT-PCR的100~1000倍，更有利于低含量病毒和隐症病毒的检测。Latief等^［30］建立了玫瑰ApMV和PNRSV的一步法RT-LAMP检测技术，可在65 ℃等温条件反应30 min从印度玫瑰中检测出ApMV和PNRSV，检测灵敏度是RT-PCR的1000倍。灵敏度不同可能是由于PCR和LAMP扩增时引物结合位点不同，PCR引物只需与靶序列的上、下游位点结合且引物不完全匹配时，PCR仍能扩增出片段，但易出现非特异性片段，而LAMP 4条引物只有与靶序列的6个区域完全匹配，才能进行有效扩增。LAMP只需在等温条件下完成，无需配备昂贵的设备，用恒温水浴锅就可完成反应。但该技术也存在不足之处，如在操作过程中易产生气溶胶污染造成假阳性的问题，因此，有关专家也在研究过程中逐步完善该检测方法，试图通过减少开盖操作或在不同房间添加试剂，在反应体系内加入内部含有荧光染料的微晶石蜡或矿物油封闭反应体系，反应结束后再加入荧光染料实现结果判读等各种方法，实现降低甚至避免假阳性问题。

4 结论

本研究以PNRSV、ASGV和RCV1 CP基因为靶序列，设计特异性引物，建立了3种病毒的RT-LAMP检测技术。与常规PCR和RT-PCR相比，LAMP检测具有特异性和灵敏度更高、用时更短的特点。所建立的RT-LAMP检测技术可通过有无颜色变化判读是否含有目标病毒，特异强，灵敏度高，且借助恒温水浴锅在等温条件下即可完成检测，可以直接用于侵染月季的PNRSV、ASGV和RCV1病毒的快速诊断及检测。该方法适合在基层和现场快速检测，更适用于田间样本检测。

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基金资助

国家重点研发计划(2019YFD1001800)