月季3种病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

摘要

[目的]月季是我国重要的观赏花卉，李属坏死环斑病毒（prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）、苹果茎沟病毒（apple stem grooving virus,ASGV）、月季潜隐病毒1（rose cryptic virus 1,RCV1）是侵染月季的主要病毒，与其它病毒复合侵染月季时，对其生长和发育可造成严重影响。本文旨在建立灵敏、便捷地检测月季中这3种病毒的RT-LAMP检测方法。[方法]本研究以病毒CP基因为靶序列设计特异性引物，建立侵染月季的PNRSV、ASGV和RCV1的RT-LAMP检测方法，并对反应体系中Mg²⁺浓度和dNTP使用浓度、反应温度和反应时间进行了优化，并对反应灵敏度和特异性进行了检测。[结果]该方法在恒温条件（61℃）下即可对目标病毒实现可视化特异性检测，检测体系中Mg²⁺和dNTP最佳使用浓度分别为5.0 mmol/L和1.2 mmol/L；本研究所建立的RT-LAMP检测方法，RCV1、PNRSV和ASGV可以检测到病毒的最低浓度分别为3.19×10～5、6.44×10～4和4.04×10～4拷贝/μL，灵敏度是RT-PCR的100～1000倍，而且检测体系具有很好的反应特异性，与侵染月季的其它病毒之间不存在交叉反应；使用该RT-LAMP检测方法随机对田间19个样品进行检测，可通过颜色变化，能准确检测出样品中的目标病毒，而无需借助琼脂糖凝胶电泳或其它专门仪器。[结论]该方法可通过直接添加染料实现可视化，具有快速、便捷、特异性好特点，适用于侵染月季的PNRSV、ASGV和RCV1的快速诊断及田间监测。

关键词

月季 / 病毒 / RT-LAMP / 检测方法