谷子HMA基因家族的全基因组表征及其功能预测

Genome-wide characterization and functional prediction of the heavy metal ATPase (HMA) gene family in foxtail millet

摘要

目的 Heavy metal ATPase（HMA）蛋白参与了植物对多种金属离子的吸收和转运。本研究通过对谷子HMA进行全基因组表征、表达及同源分析以解析其功能。 方法 通过蛋白同源比对和保守结构域筛选谷子HMA基因家族成员；采用生物信息学手段系统分析了谷子HMA的理化性质、家族扩张、保守基序、系统发育关系及蛋白质分子对接；基于不同浓度Cd、Fe胁迫下的转录组和荧光定量PCR分析了其对不同金属离子的响应；基于模式物种水稻的同源比对预测了部分SiHMA的功能。 结果 在谷子基因组中共鉴定到12个HMA基因，并将其分为2个亚组，有6个HMA基因参与到2次串联重复（4个基因，占比33.3%）和1次片段复制事件（2个基因，占比16.7%）中。SiHMA基因在不同组织中对Cd、Fe胁迫表现出不同的响应模式。预测了SiHMA可能的功能，SiHMA5参与细胞中Zn、Cu、Pb和Cd等金属离子的外排过程，SiHMA10可能参与植物体内Cu的装载和运输。 结论 重复事件和片段复制在谷子HMA基因家族扩张和SiHMA功能进化中发挥作用。植物激素、应激胁迫等多种顺式作用元件参与到SiHMA响应非生物胁迫途径中，我们根据同源比较、组织表达特征和前人研究，预测了SiHMA1、SiHMA5、SiHMA6和SiHMA10等基因可能的功能，以上结果可为进一步研究HMA基因家族及其在谷子中的生物学功能提供理论基础。

Abstract

Objective Heavy metal ATPase （HMA） proteins play critical roles in the absorption and transport of various metal ions in plants. This study aimed to characterize the HMA gene family in foxtail millet through genome characterization， expression profiling， and homology analysis to elucidate its functions. Method HMA gene family members in foxtail millet were identified using protein homology alignment and conserved domain screening. Bioinformatics analyses were performed to examine their physicochemical properties， gene family expansion， conserved motifs， phylogenetic relationships， and protein molecular docking. Transcriptomic and qRT-PCR analyses under Cd and Fe stress treatments were conducted to assess metal-responsive expression patterns. Functional predictions for selected SiHMA were inferred through homology with rice. Results Twelve HMA genes were identified and classified into two subgroups. Family expansion involved six HMA genes through two tandem duplication events （four genes，33.3%） and one segmental duplication event （two genes，16.7%）. SiHMA showed tissue-specific responses to Cd and Fe stress. The possible functions of SiHMA were predicted. Functional predictions suggested that SiHMA5 mediated Zn， Cu， Pb and Cd efflux， while SiHMA10 might be involved in the loading and transportation of Cu in plants. Conclusion Tandem and segmental duplication drove HMA family expansion and functional diversification in foxtail millet. Cis-acting elements related to plant hormones and stress responses were identified in SiHMA promoters. Based on homology， expression patterns， and previous evidence， we proposed roles for SiHMA1， SiHMA5， SiHMA6 and SiHMA10 in metal homeostasis. These results provide a theoretical basis for further study on HMA genes in foxtail millet.

Graphical abstract

关键词

谷子 / HMA基因家族 / 同源比较 / 表达特征 / 功能预测

Key words

Foxtail millet / HMA gene family / Homologous analysis / Expression profiling / Functional prediction

Cu、Zn和Fe等许多金属元素是植物生长发育的必需金属元素，广泛参与各种生化和生理过程，它们作为酶的辅助因子，在细胞氧化还原反应中发挥作用，也会影响蛋白质的空间结构、稳定性和信号转导^［1］。金属元素的含量通常需要维持在一定范围之内，缺Zn会导致植物生长缓慢、发育不良^［2-3］，缺Cu会通过影响花粉发育和受精过程降低植物生长速率、结实率和产量^［4］。而Zn和Cu过度积累会对植物造成毒害。Cu、Zn是与人体健康密切相关的必需微量营养元素^［5］。目前，全球超过20亿人患微量营养元素缺乏症^［6］，缺Zn可能会导致生长迟缓、免疫功能障碍和认知障碍^［7］，Cu缺乏会导致贫血和免疫缺陷^［8］，然而，过量摄入Cu和Zn又会对人体产生一定的危害。近年来由于采矿、污水排放、工业生产和农药施用，重金属Cd在土壤、水和空气中广泛污染，严重影响了自然环境和人体健康^［9］。由于Cd不是植物生长的必需元素，在植物体内的代谢通常需要借助Zn、Fe和Ca等二价阳离子的转运体系^［10］。因此，控制细胞中的必需金属离子和有害金属离子浓度以实现稳态调控网络，对植物生长发育和人体健康至关重要。

HMA（Heavy metal ATPase）属于P_1B-ATP酶，是P-ATP酶多个亚族中唯一参与重金属稳态的跨膜转运蛋白，利用植物中ATP水解释放的能量，可选择性吸收或转运植物生长发育必需的金属阳离子Cu和Zn等，也参与非必需金属离子Cd和Pb的运输分配，以维持生物体中过渡金属的内环境稳定^［11-12］。目前已有研究报道了拟南芥和水稻中的HMA基因家族成员的功能，根据转运的金属离子种类可分为2组：拟南芥中的AtHMA1至AtHMA4和水稻中的OsHMA1至OsHMA3属于Zn/Cd/Pb/Co转运蛋白，而AtHMA5至AtHMA8和OsHMA4至OsHMA9属于Cu/Ag转运蛋白^［13］。在拟南芥中AtHMA1和AtHMA6/PAA1定位于叶绿体包膜，是叶绿体中运输Cu的2个不同的途径^［14-15］，AtHMA8/PAA2负责将Cu转运到类囊体腔^［16］，AtHMA1还参与质体中过量Zn的解毒^［17］。AtHMA2和AtHMA4负责Zn/Cd在植物体内的长距离运输^［18］；AtHMA3属于液泡膜蛋白，在Cd胁迫处理下可以将Cd隔离到液泡中减轻细胞质毒性^［19］。水稻中鉴定出9个HMA基因，OsHMA2在Cd和Zn向木质部转运的过程中起作用，在缺Fe环境下可促进Zn由根到茎的运输^［20］；OsHMA3可以将细胞中的Cd运输到液泡中，影响Cd由水稻地下部向地上部的转移速率^［21］；OsHMA5参与将Cu装载到木质部进行根到茎的转运过程^［22］；OsHMA6是位于质膜上的Cu外排蛋白^［23］；OsHMA7基因下调表达导致水稻籽粒中的Fe和Zn含量下降，可能参与水稻中Fe和Zn的转运^［24］；OsHMA9主要在维管组织中表达，敲除后在茎中的Zn、Cu、Pb和Cd含量增多，表明它参与细胞中这些金属离子的外排过程^［23］。在大麦中敲除HvHMA1会使籽粒中的Zn和Cu含量增加，说明HvHMA1可以限制作物对Zn和Cu的总吸收^［1］；花生中的AhHMA1.1/1.2、AhHMA.1/.2可能参与Zn的转运，而AhHMA.2和AhHMA7.5可能参与Cd转运^［25］。因此，不同的HMA转运蛋白通过介导Cu、Zn、Cd和Fe等二价金属离子的吸收、运输和分布来影响植物生长发育以及谷物中微量元素的积累。

谷子（Setaria italica（L.）Beauv）是一种C4禾本科作物，起源于中国，具有悠久的栽培历史，在中国北方和其它亚洲国家广泛种植^［26-27］，谷子适宜在半干旱地区种植，具有水分利用效率高、抗旱、耐盐碱和产量稳定等特点^［28］。谷子脱壳后为小米，其含有多种营养物质如维生素、膳食纤维、氨基酸等^［29］，因此谷子已成为应对气候变化和粮食安全问题的关键作物^［30］。迄今为止，已有研究鉴定了谷子重金属转运相关的Nramps、ZIP基因家族^［31-32］，关于谷子HMA基因家族的研究及其在谷子中的功能尚不清楚。本研究基于最新的谷子基因组，系统鉴定了谷子HMA基因家族，并从染色体定位、基本理化性质、基因复制模式、选择压力、系统发育关系、保守基序和结构域等方面对其进行了表征。此外，还分析了谷子HMA基因在不同生长阶段不同组织中的表达模式，基于转录组分析了谷子HMA基因对不同浓度Cd和Fe处理的响应，结合水稻中的直系同源基因预测了SiHMA基因可能的功能。本研究为谷子HMA基因的进一步功能研究提供了基础理论框架，可为更深入地了解谷子中金属离子的转运和积累机制提供理论支持。

1 材料与方法

1.1　谷子HMA基因家族的全基因组鉴定与表征

从谷子多组学数据库中（MDSi，http：//foxtail-millet.biocloud.net/home）下载谷子（‘xiaomi’，通过EMS诱变得到的栽培品种‘晋谷21’的突变体）的最新参考基因组数据^［33］，包括蛋白质序列、基因组序列、CDS序列和基因注释文件。拟南芥、水稻和玉米的最新基因组参考信息来自Ensemble Plants数据库（http：//plants.ensembl.org/index.html），拟南芥、水稻和玉米的HMA蛋白序列从已发表的文章中获得^［34］。将拟南芥、水稻和玉米的HMA蛋白序列与谷子蛋白质数据库进行BLASTP比对，比对阈值为E-value<1×10^-5和相似性>50%。利用HMMER（版本3.3.2）工具搜索从Interpro数据库下载的HMA蛋白的保守结构域（PF00122、PF00702），检查由BLASTP鉴定的候选HMA蛋白，随后使用NCBI CDD数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）验证了包含保守结构域的序列。最后对谷子中的HMA基因家族成员进行人工筛选，去除不完整的结构域序列。根据HMA在染色体上的位置对基因进行重命名，例如SiHMA1、SiHMA2。从基因组注释文件中提取HMA基因及其编码蛋白的基本信息。蛋白质分子量和等电点、跨膜结构域、亚细胞定位等信息分别从ExPASy数据库（https：//web.expasy.org/compute_pi/）、TMHMM Server 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、Cell-PLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）获取。

1.2　谷子HMA基因的染色体定位、重复事件和选择压力

基于谷子基因组的基因结构注释文件，采用Ka/Ks_Calculator 2.0计算谷子重复基因之间非同义突变（Ka）与同义突变（Ks）的Ka/Ks比值，使用TBtools软件展示SiHMA基因在染色体上的分布及重复关系^［35-36］。

1.3　谷子HMA基因家族的系统发育分析和保守基序

为了解谷子HMA基因家族与其它物种的进化关系，利用双子叶植物拟南芥和单子叶植物（谷子、水稻和玉米）共4种植物的HMA蛋白序列构建系统发育树。使用MEGA 11进行多序列比对，采用最大似然法（Maximum likelihood Method）构建系统发育进化树（Bootstrap=1000，其它为默认参数），使用（evolview，https：//evolgenius.info/evolview-v2/#login）在线网址对进化树进行美化。利用基序序列分析服务器（MEME，http：//meme-suite.org）预测了谷子HMA蛋白的保守基序。设置从6到200的基序宽度，允许任意次数的重复，并将最大基序数设置为10作为阈值，使用TBtools可视化蛋白保守结构域和基因结构。

1.4　SiHMA10半柔性分子对接

通过AlaphFold2工具（https：//github.com/deepmind/alphafold）^［37］对SiHMA10蛋白进行三维建模，选择最佳建模结果用于后续的对接分析。在Pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载小分子配体的三维模型文件。使用OpenBabel 3.1.1软件完成模型文件的格式转换，利用Autodocktools 4.2.6软件^［38］完成对蛋白受体和小分子配体的加氢、合并非极性氢以及计算电荷等处理，Torsion tree的检测和可旋转键设置为默认，Grid Box设置为全局对接模式。完成蛋白受体与小分子配体的模型文件处理后，使用Autodock-vina 1.1.2软件^［39］进行半柔性分子对接。对接完成后，使用Pymol软件进行最佳对接构象的可视化。2D对接结果可视化及相互作用分析则通过LigPlot 2.2.4软件完成。

1.5　谷子HMA的顺式作用元件和时空表达模式

利用谷子HMA基因起始密码子上游2000 bp区域预测启动子区顺式作用元件。使用TBtools从基因组序列中提取这些序列，并上传到PlantCare数据库（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行在线预测，对不同类型的顺式作用元件进行手动分类和可视化^［31］。从谷子多组学网站（MDSi）下载SiHMA基因在整个生育期不同组织中的时空表达数据，包括谷子品种‘xiaomi’从苗期到成熟期的各种组织的RNA-seq数据，之后通过FPKM值对谷子中SiHMA基因表达水平进行归一化，用TBtools进行可视化。

1.6　植物材料和Cd、Fe胁迫处理

为了研究谷子HMA基因对Cd胁迫的响应，在改良的Hoagland营养液中对谷子品种‘xiaomi’进行水培处理（0.72 mmol/L K₂SO₄，0.1 mmol/L KCl， 2 mmol/L Ca（NO₃）₂，0.65 mmol/L MgSO₄， 0.25 mmol/L KH₂PO₄，1 μmol/L MnSO₄，1 μmol/L ZnSO₄，0.1 μmol/L CuSO₄，5×10^-3 μmol/L Na₂MoO₄，1 μmol/L H₃BO，0.2 μmol/L FeNaEDTA）。供试材料种植于山西农业大学人工气候室中，设置温度为22 ℃，光照时间为16 h（12 000 lx）/8 h暗光周期。对四叶期幼苗用CdCl₂胁迫1周，设Cd胁迫浓度分别为Cd1（5 μmol/L）、Cd2（10 μmol/L）和Cd3（30 μmol/L）^［31］；在Fe胁迫方面，通过控制Hoagland营养液中Fe²⁺浓度，对三叶期幼苗用EDTA-Fe处理1周，设正常铁（CK）、铁缺乏（0 µmol/L， LFe）和高铁（600 µmol/L， HFe）共3个处理，种植材料和条件同CdCl₂处理。将不同Cd、Fe胁迫浓度下的根、茎、叶样品快速冷冻，送往派森诺公司进行转录组测序，设置3次生物学重复，在BGISEQ500测序平台上进行cDNA文库构建和转录组测序，并遵循该公司的标准测序和分析程序。

1.7　qRT-PCR的表达分析

谷子Cd处理后的根、茎、叶的RNA提取使用生工生物的UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（B511321），使用RNA提取液（G3013-100ML）代替氯仿，提取得到的RNA置于-80 ℃冰箱冷冻保存。基于‘xiaomi’基因组数据库得到基因全长CDS序列，在NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）设计目的基因的特异性引物。以Actin作为内参基因，对每个基因的表达情况进行实时荧光定量PCR检测，利用2^-∆∆Ct法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1　谷子HMA基因家族鉴定和局部特征

通过进行BLAST多序列比对和保守结构域分析，在谷子中鉴定出12个HMA基因，所有谷子HMA基因根据染色体位置重新命名，表1列出了谷子SiHMA基因的基因结构和蛋白理化性质的详细信息。这些SiHMA的mRNA长度从SiHMA11的2343 bp到SiHMA3的3980 bp，内含子数目为4~16。编码蛋白长度为722~1967 aa，编码蛋白质分子量为75 276.75~108 091.93 Da，等电点范围为5.33~8.58。作为典型的金属转运蛋白，所有SiHMA蛋白都含有数量不等的TM区域（3~8）；亚细胞定位结果显示，9个SiHMA蛋白定位于细胞膜上，2个定位于叶绿体上，1个定位于细胞膜和细胞核上。

2.2　SiHMA基因的染色体定位和基因重复

为了探究SiHMA基因家族扩张与基因重复事件之间的关系，将SiHMA映射到染色体上，分析家族成员间的重复事件和选择压力（图1）。12个SiHMA基因不均匀地分布在6条染色体上，4号染色体包含的基因数目最多为3个；而6号染色体上只有1个基因，其余基因分布在1、2、7和9号染色体上。SiHMA主要位于在染色体的两端，这与谷子基因在染色体上的分布特征一致。分析基因重复事件发现，在12个SiHMA基因中，有4个基因参与串联重复（Tandem duplication， TD），形成2个明显的串联重复组（SiHMA3和SiHMA4，TD1；SiHMA9和SiHMA10，TD2），2个基因参与片段复制（Segmental duplication， SD），形成1个片段重复基因对（SiHMA2和SiHMA5，SD1）。基因复制事件使SiHMA基因家族显著扩张，不同重复基因对承受不同的选择压力，Ka/Ks是表征基因选择压力的重要指标。分析发现TD1基因对中基因Ka/Ks值为0.34，TD2基因对中基因Ka/Ks值为0.1；SD1基因对中基因Ka/Ks值为0.11。所有重复基因对的Ka/Ks值均小于1，表明SiHMA总体上受到纯化选择。

2.3　系统发育树、基因结构和保守结构域分析

本研究构建了来自3种单子叶植物（水稻、玉米和谷子）和1种双子叶植物（拟南芥）的38个HMA蛋白序列的系统发育树（图2）。结果显示，所有HMA蛋白都被分为2个不同的进化分支，每个进化分支都含有来自不同物种的HMA蛋白，这表明HMA基因家族在单子叶和双子叶植物分化之前就形成了。拟南芥和水稻中分别有8个和9个P_1B-ATPase成员，拟南芥中的AtHMA1至AtHMA4和水稻中的OsHMA1至OsHMA3为Zn/Cd/Pb/Co亚组，而AtHMA5至AtHMA8和OsHMA4至OsHMA9属于Cu/Ag亚组。根据拟南芥和水稻HMA的分类，将SiHMA3、SiHMA4、SiHMA6、SiHMA7和SiHMA11这5个成员归为Zn/Cd/Pb/Co亚组，SiHMA1、SiHMA2、SiHMA5、SiHMA8、SiHMA9、SiHMA10和SiHMA12共7个成员归为Cu/Ag亚组。

为比较不同SiHMA的特征，本文分析了它们的保守基序和蛋白质保守结构域（图3）。总体而言，属于同一亚组的SiHMA在保守基序上表现出相对保守性，Cu/Ag亚组中的7个HMA（SiHMA1、SiHMA2、SiHMA5、SiHMA8、SiHMA9、SiHMA10和SiHMA12）有相同的10个保守基序，Zn/Cd/Pb/Co亚组中的4个HMA（SiHMA3、SiHMA4、SiHMA6和SiHMA7）有相同的7个保守基序，SiHMA11除了缺少Motif10以外其它的6个保守基序均相同，Motif5和Motif7是Cu/Ag亚组中特有的保守基序。分析蛋白质保守结构域发现，E1-E2_ATPase superfamily在HMA的12个成员中都含有；SiHMA1、SiHMA2、SiHMA5、SiHMA8、SiHMA9、SiHMA10和SiHMA12中含有copA superfamily结构域，zntA superfamily是SiHMA3、SiHMA4、SiHMA6、SiHMA7和SiHMA11特有的结构域。

2.4　SiHMA10蛋白质分子对接分析

为了理解SiHMA与金属在分子动力学上的结合模式，进行SiHMA10与CdCO₃配体的半柔性分子对接，结果表明CdCO₃配体与SiHMA10的对接得分为-3.8 kcal/mol。值得注意的是，较低的对接分数表明配体与蛋白质的结合更稳定。红色代表Cation_ATPase结构域，青蓝色代表E1-E2_ATPase结构域，这2个结构域属于HMA基因家族特有的结构域（图4）。

2.5　SiHMA顺式调控元件及时空表达模式

在PlantCare数据库中预测并分析12个SiHMA启动子区域中的顺式作用元件，共鉴定了4类顺式作用元件，包括参与光响应、植物激素响应、植物生长发育和应激响应（图5）。植物激素响应包含脱落酸响应元件（ABRE）、茉莉酸甲酯（MeJA）响应元件（TGACG-motif和CGTCA-motif）、生长素响应元件（TGA-box）以及乙烯、赤霉素等11种响应元件，其中ABRE响应元件的数量最多（66个），其次是TGACG-motif和CGTCA-motif，数量均为36个，表明SiHMA可能受到各种植物生长调节剂的影响。此外，响应损伤（WRE3）、高温（STRE）和干旱（MBS和MYC）诱导等的元件可能在SiHMA对各种应激响应中起关键作用，其中功能为应激和胁迫的MYB元件数量有75个。与光响应相关的元件种类最多有15种，包含G-Box、Sp1、TCT-Motif等；与植物生长发育相关的元件包含玉米醇溶蛋白代谢（O2-Site）、昼夜节律（Circadian）、调控类黄酮生物合成（MBSI）和胚乳表达（GCN4_motif）等。

SiHMA在谷子整个生育期的表达模式有明显时空特异性（图6）。总体而言，SiHMA的表达模式大致可分为3类：第1类是在拔节期的叶片中显著高表达，如SiHMA7、SiHMA8和SiHMA1；第2类是在灌浆期的根系中高表达，如SiHMA1、SiHMA3、SiHMA5、SiHMA6和SiHMA10；第3类是在授粉期的穗部显著高表达，如SiHMA2、SiHMA4和SiHMA11。此外，从同一重复基因对的2个基因表现出不同的组织表达模式，即SD1中的SiHMA2和SiHMA5、TD1中的SiHMA3和SiHMA4，TD2中的SiHMA9和SiHMA10所示。

2.6　SiHMA对Cd和Fe离子非生物胁迫的响应

转录组分析结果显示，SiHMA在不同组织和不同浓度的Cd、Fe胁迫下，表现出丰富的表达模式。除了SiHMA4和SiHMA11对Cd和Fe处理几乎无响应外，其余的SiHMA的表达受到不同金属离子的抑制或诱导。SiHMA1、SiHMA2、SiHMA6和SiHMA10在Cd处理后根系中下调表达，SiHMA12在Cd处理后茎和叶片中下调表达；SiHMA5分别在Cd处理后的叶片中上调表达；SiHMA3、SiHMA6、SiHMA7、SiHMA8和SiHMA12在Fe处理后根系中上调表达，SiHMA1在Fe处理后根系中表达水平降低（图7）。对Cd处理后差异表达的SiHMA1、SiHMA5、SiHMA6和SiHMA10做实时荧光定量PCR验证，qRT-PCR验证的基因相对表达水平与RNA-seq分析的mRNA丰度基本一致，证明RNA-Seq数据可靠（图8、表2）。

3 讨论

Zn和Cu等微量金属元素影响作物生长发育以及人类健康，Cd是土壤中常见的环境污染物，Cd污染不仅造成永久性和不可逆转的环境问题，而且还会大幅度削减作物产量，严重威胁食品安全和人类健康^{［31， 40］}。目前已有大量研究证实了重金属和微量金属在不同作物的不同组织中的相互作用关系^［41］，因此鉴定重要的金属转运蛋白，探究其与植物中金属吸收和迁移的内在关系，对于理解金属元素在植物中的生理功能和积累模式至关重要。HMA作为植物中重要的重金属转运蛋白家族，主要利用水解ATP产生的能量驱动一些重金属离子的跨膜转运，包括Zn、Cd、Cu和Ni等金属离子^［42］。HMA基因家族已在玉米和大豆等多个物种中得到鉴定和表征，分别鉴定到12个^［43］和20个^［44］成员，然而单子叶植物谷子中的HMA基因家族还未报道。本研究在谷子的基因组中鉴定出12个SiHMA基因，数量高于拟南芥（8个）^［45］等双子叶植物。系统发育分析结果显示，这些物种的HMA混合分布在2个亚组中，表明HMA基因家族的形成早于单子叶植物和双子叶植物的分化，总体来看单子叶植物中鉴定到的HMA基因家族数量高于双子叶植物，这表明HMA基因家族在单子叶植物中经历了显著的扩增，这与由HMA构建的系统发育树结果基本一致。

在模式植物拟南芥中，AtHMA1、AtHMA6和AtHMA8位于叶绿体中^［45］。研究表明，只有SiHMA11和AtHMA1的直系同源基因SiHMA7定位在叶绿体中，大部分的HMA基因被预测定位于为细胞膜，与李成浩等^［46］结果类似。因此，同源基因可能在基因功能和信号转导上表现出差异。为了提高对环境的适应性，植物通常通过产生新基因的复制事件和功能分化来完成进化^［47-48］。SiHMA基因家族的12个成员中存在2对串联重复和1对片段复制。该结果证实了串联重复事件对SiHMA基因家族的扩张有重要贡献。重复事件为新基因的产生提供能量，功能分化为新基因的产生提供了催化剂^［49-50］。本研究计算所有重复基因对的Ka/Ks值来评估SiHMA的选择压力，结果均小于1，表明这些基因倾向于纯化选择以保持重要功能的稳定性^［51］，这与番茄SlHMA基因复制事件的研究结果类似^［52］。TD1的Ka/Ks值最高，表明TD1中的基因复制更有可能产生新的功能。此外，TD1和SD1的基因对之间的TM结构域存在差异，SD1基因对中的SiHMA2和SiHMA5分别有7个和8个TM区域，TD1基因对中的SiHMA3和SiHMA4分别有4个和6个TM区域。分析重复基因对的组织表达模式发现。SD1中SiHMA5在灌浆期的根部表现出特异性高表达，但SiHMA2在根部表达量过低；对于TD1中的SiHMA3在灌浆期的旗叶和根系中高表达，SiHMA4主要在授粉期的穗部表达。分析HMA蛋白保守结构域发现，所有的HMA蛋白中都包含E1-E2 ATPase结构域，这与芥菜HMA蛋白结构域的鉴定结果一致^［53］。总体而言，与其它物种的HMA基因家族类似，大量的重复事件、基因序列、蛋白结构和组织表达特征的变异是谷子HMA基因家族扩增和功能分化的主要原因^{［44，46］}。

此外，本研究在多个SiHMA的启动子区域中发现了响应植物激素、胁迫响应等多种顺式作用元件。参与防御和胁迫反应的顺式作用元件数量最多（276个），说明SiHMA中该类型的元件显著响应非生物胁迫^［54］。植物激素响应元件中包含的ABRE元件数量最多，研究证实水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）和脱落酸（ABA）等植物激素使植物能够适应非生物胁迫^［55-56］，SA可以诱导植物对Cd、Hg和Mn毒性的抗性^［57］，在毛果杨的7个基因中发现了参与MeJA反应的CGTCA-motif和TGACG-motif^［46］。此外，其它研究发现MYB等转录因子可通过调节金属转运基因的表达，影响生物和非生物胁迫反应^［58］。

基因的时空表达模式是认识重要功能基因的关键步骤^［47］。HMA基因通常在不同组织部位中表现出时空表达差异。本研究结合水稻中HMA基因的研究和谷子HMA基因的时空表达模式，基于直系同源基因的表达特性，预测了谷子中HMA基因的功能。多个SiHMA及其直系同源基因在谷子和水稻中表现出高度相似的表达模式。水稻OsHMA4在根部高表达，可以减少Cu由根系向地上部的转运^［59］，其直系同源基因SiHMA1在谷子的叶片和根系中高表达，表明SiHMA1可能具有类似的功能；SiHMA5及其直系同源基因OsHMA9已被证明在根和茎中特异性高表达^［13］，并且OsHMA9参与细胞中Zn、Cu、Pb和Cd等金属离子的外排过程^［60］，这表明SiHMA5/OsHMA9的功能可能保守；SiHMA10在谷子根中特异性高表达，研究发现敲除其直系同源基因OsHMA5后水稻根部的Cu含量增加，地上部的Cu含量则下降^［22］，说明SiHMA10可能参与Cu的在植物体内的运输；OsHMA2是定位于质膜上的Zn和Cd离子转运蛋白且在根系和胚乳中表达，其在谷子中的直系同源基因SiHMA6表现出相似的表达模式，表明它们可能具有相似的功能。我们发现至少有4个SiHMA基因与其水稻直系同源基因具有相似的表达模式，并且这些基因的功能可能在谷子和水稻之间高度保守，这与之前玉米和水稻中的报道类似^［61］。除了这些保守的基因外，部分基因和水稻的表达模式不同，说明这些基因可能在谷子中有特异性功能。

4 结论

本研究在谷子中鉴定出12个HMA基因，并将其划分为2个亚组。证明基因重复是谷子HMA基因家族扩增的主要原因，构建了SiHMA10与Cd配体的分子对接，评估了SiHMA在整个生长期内各种组织中的时空表达模式以及对不同浓度Cd和Fe的响应。预测了4个SiHMA基因的功能，SiHMA1和SiHMA10可能参与Cu的运输，SiHMA5和SiHMA6可能负责转运Zn和Cd等金属离子。

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基金资助

中央引导地方科技发展资金(YDZJSX2022B007)

国家自然科学基金项目(U21A20216)

山西省研究生科研创新项目(2023KY327)