蒙古黄芪根腐病病原分离与鉴定

Isolation and characterization of root rot pathogens of Astragalus membranaceus var. mongholicus

摘要

目的 明确蒙古黄芪主产区根腐病病原菌类型及发病情况，为蒙古黄芪抗病品种培育及根腐病综合防治、提供理论依据。 方法 采用组织分离法对甘肃陇西县、甘肃岷县、山西五寨县、内蒙古固阳县4个蒙古黄芪主产区的病样进行病原真菌的分离纯化，建立致病性检测方法以测定病原菌的致病性并进行柯赫氏法则验证，结合形态学观察，采用分子生物学方法鉴定病原菌。 结果 从4个产地的病样中共分离得到61株真菌分离物，根据其菌落及孢子形态确定为16株菌株。当采用浓度为1×10⁶ 个/mL的孢子悬浮液点接离体根段，侵染时间为7 d时，病斑明显，侵染层次较为分明，结果易于观察和比较，故为致病性测定的最佳条件。根据致病性测定结果及柯赫氏法则验证，具有致病性的菌株有12株，经分子生物学鉴定明确引起蒙古黄芪根腐病的病原菌有4种，3种为来自镰刀菌属（Fusarium）的真菌，包括锐顶镰刀菌（F. acuminatum）、尖孢镰刀菌（F. oxysporum）、茄腐镰刀菌（F. solani），1种为螺旋聚孢霉属（Clonostachys）的真菌粉红粘帚霉（C. rosea）。 结论 蒙古黄芪根腐病主要的病原菌有锐顶镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌，其中锐顶镰刀菌在4个产地均有发现且致病性较强，为最主要的病原菌。而粉红粘帚霉仅在五寨县发现，相关报道较少，但其具有较强致病性，需引起关注。

Abstract

Objective This study aimed to identify the pathogen species and disease incidence of root rot in the main producing areas of Astragalus membranaceus var. mongholicus， and to provide a theoretical basis for breeding resistant varieties and developing integrated control strategies against root rot disease. Methods Pathogenic fungi were isolated and purified from diseased samples collected from four main production areas， Longxi County and Min County in Gansu Province， Wuzhai County in Shanxi Province， and Guyang County in Inner Mongolia， using the tissue isolation method. Pathogenicity of the isolates was assessed using an established assay， followed by verification with Koch's postulates. Fungal identification was performed by combining morphological observation with molecular biological methods. Results A total of 61 fungal isolates were obtained from diseased samples across the four regions. Based on colony and spore morphology， these were grouped into 16 representative strains. Optimal conditions for pathogenicity testing were determined as follows： inoculation of excised root segments with a spore suspension at 1×10⁶ spores/mL， and an infection period of 7 days. Under these conditions， lesions were clearly visible and infection severity could be readily compared. Pathogenicity tests and fulfillment of Koch's postulates confirmed 12 strains as pathogenic. Molecular identification revealed four species responsible for root rot disease in A. membranaceus var. mongholicus： three Fusarium species， including F. acuminatum， F. oxysporum， and F. solani， and one species of Clonostachys， C. rosea. Conclusion The main pathogens causing root rot in A. membranaceus var. mongholicus were F. acuminatum， F. oxysporum， and F. solan. Among these， F. acuminatum was found in all four production areas and showed strong pathogenicity，indicating that it was the primary pathogen. C. rosea was only found in Wuzhai County. Although rarely reported， it exhibited high pathogenicity and thus warrants further attention.

Graphical abstract

关键词

蒙古黄芪 / 根腐病 / 病原菌分离 / 致病性 / 分子鉴定

Key words

Astragalus membranaceus var. mongholicus / Root rot / Pathogens isolation / Pathogenicity / Molecular characterization

根腐病是作物栽培过程中常见的毁灭性土传病害，由水分、土壤等非生物因素以及线虫、真菌、细菌等生物因素共同造成，具有易传染、发病率高、危害严重、防治困难等特点，对于以根及根茎作为收获部位的药用植物如三七、白术、当归、蒙古黄芪等影响深重，可导致产量和品质大幅度下滑，造成重大的经济损失^［1-3］。

蒙古黄芪（Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge. var. mongholicus （Bge.） Hsiao）为豆科（Fabaceae）黄芪属（Astragalus）植物，其根可作黄芪入药，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血等功效^［4］。黄芪含有皂苷、多糖、黄酮等成分，抗炎、抗癌、抗氧化、免疫调节等生物活性作用突出，具有极高的药用价值^［5-8］。黄芪不仅是临床常用的大宗药材，有“十药八芪”的说法，而且在2023年被纳入食药物质目录之后^［9］，市场需求与日俱增。目前市场上流通的黄芪商品大多为人工栽培的蒙古黄芪^［10］，主产于山西、内蒙古、甘肃、宁夏、陕西等地^［11-13］。

然而随着生产规模的扩大，蒙古黄芪根腐病病害普遍发生。上个世纪90年代，王立新等^［14］调查了内蒙古西部地区蒙古黄芪根腐病的发病情况，结果显示该地区一般地块发病率为30%，严重时可达80%；21世纪初，邓成贵^［15］调查发现甘肃定西市蒙古黄芪根腐病发病率可达35%~92%；2013至2014年，根据高芬等^［16］的调查，山西地区一般地块发病率为10%~30%，严重时可达60%。近十年，蒙古黄芪产地根腐病发病情况的详细报道较少。马瑞娟等^［17］于2023年在甘肃和政县开展的田间试验显示，未进行病虫害综合防治区域的蒙古黄芪根腐病发病率达24.98%。2023年，Xu等^［18］在甘肃渭源县一处1998平方米的蒙古黄芪种植田开展调查，发现根腐病发病率为10%，病斑占根表面积比例为5%~60%。蒙古黄芪根腐病是由病原菌和病原线虫共同作用引发^［19］，其中病原真菌的研究较为深入。与其它作物相同，镰刀菌属（Fusarium）的病原真菌也被认为是引起蒙古黄芪根腐病的主要致病菌^［16］。近两年报道的病原菌有立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）AG-5^［18］、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）、柔毛镰刀菌（F. flocciferum）^［20］等。随着气候的变化及产区的迁移，根腐病病原菌类型及致病能力也会发生变化，因此还需持续关注。

植物根腐病致病性测定方法根据植物材料可分为盆栽实验法^［15］、离体根部接种法^［21］、下胚轴鉴定法^［22］等，根据病原菌接种方式又可分为菌饼接种法^［23］、孢子悬浮液灌根接种法^［24］、孢子悬浮液点接法^［25］、孢子悬浮液喷施法^［26］等。其中离体根部接种法具有简便快捷、易操作、结果易进行观察比较等优点，在蒙古黄芪根腐病的研究中多采用菌饼进行离体根部接种^{［16，21］}，而孢子悬浮液点接法接种量易控制，准确性较高，但目前应用较少，具体的测定方法有待探究。

本研究采集了甘肃陇西县、甘肃岷县、山西五寨县、内蒙古固阳县4个蒙古黄芪主产区具有根腐病典型发病症状的病样，进行病原菌的多次分离纯化，建立致病性测定方法测定病原菌的致病性并进行柯赫氏法则验证，结合形态学观察，采用基因序列比对的分子生物学方法鉴定病原菌类型。在此基础上，明确蒙古黄芪根腐病的主要病原菌及发病情况，为蒙古黄芪抗病品种培育及根腐病综合防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1　试验材料

2023年2月至2024年5月于甘肃陇西县（34°50′~35°23′N，104°18′~104°54′E）、甘肃岷县（34°07′~34°45′N，103°41′~104°59′E）、山西五寨县（38°44′~39°15′N，111°28′~112°E）、内蒙古固阳县（40°42′~41°29′N，109°38′~110°45′E）的蒙古黄芪种植区采集具有典型发病症状的蒙古黄芪根腐病病样。2023年12月，将健康蒙古黄芪种子播种于装有灭菌土壤的花盆中培育，于2024年6月采挖，取粗细适宜的健康根段用于致病性测定。

1.2　病原菌的分离与纯化

将有典型症状的病根流水冲洗约12 h后，在病健交界处切取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的组织块，分为3份，用1.25%的NaClO溶液消毒1 min，无菌水清洗2次，在灭菌滤纸上吸干水分，转移至PDA培养基中，于25 ℃培养箱中培养3~7 d。待菌丝生长后切取菌落的尖端菌丝再转入PDA培养基上纯化，重复多次至仅观察到1种菌丝，用30%无菌甘油保存于-80 ℃冰箱，备用。

1.3　病原菌的形态观察

将菌株接种于PDA培养基上培养3~7 d，观察菌落形态、颜色等特征，切取菌落的尖端菌丝置于载玻片上，滴入1滴乳酸酚棉蓝染色液进行染色，于显微镜下观察其孢子形态，拍照记录。参照《真菌鉴定手册》^［27］，进行初步鉴定和分类。

1.4　致病性测定方法建立

接种浓度：根据预实验结果选择2株致病性较强的菌株，分别配制浓度梯度为1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷ 个/mL的孢子悬浮液，取健康蒙古黄芪的根部洗净，切成3 cm小段，消毒后刺伤表皮至轻微破损，将3组不同浓度菌液点于创口处10 μL，无菌水为对照，每个处理设置3个重复。将根段置于垫有无菌滤纸的培养皿中，无菌水喷洒滤纸保湿，黑暗条件下25 ℃密封保存，7 d后切开根段观察。接种方式：确定适宜接种浓度后，参照上述方法，根段处理采用3 cm根段，刺伤表皮后将菌液点于创口处10 μL；切片处理采用1 cm横切片，将菌液点于切片中心10 μL，每个处理设置3个重复。侵染时间：确定适宜接种浓度及方式后，参照上述方法，测定侵染时间为3、7、10 d的侵染效果，每个处理设置3个重复。最终确定，采用浓度为1×10⁶ 个/mL的孢子悬浮液点接离体根段，侵染时间为7 d，为致病性测定的最佳方法。

1.5　病原菌的致病性测定

根据建立的致病性测定方法测定各菌株的致病性，以发病率和侵染面积作为衡量致病性强弱的标准。发病后进行病原菌的再分离与分子生物学鉴定，比较序列是否与原接种菌株相同，进行柯赫氏法则验证。

1.6　病原菌的分子鉴定

DNA提取：挑取少量菌丝放入已加入50 mmol/L NaOH溶液50 μL的1.5 mL离心管，涡旋打散菌丝。将离心管放入沸水浴中浸泡10 min。取出后，加入1 mol/L Tris-HCl （pH8.0） 缓冲液5 μL，12 000 r/min离心10 min。取上清液，即为模板DNA，于-20 ℃保存备用。

PCR扩增：引物为通用真菌鉴定引物ITS1 （5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'） 和ITS4 （5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。PCR反应体系：模板DNA 2 μL，10×Taq buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，正反向引物各0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，ddH₂O补足至20 μL。PCR反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 8 min。将所得PCR产物进行电泳检测。

序列分析：将PCR产物测得的序列与NCBI数据库 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov） 已有序列进行BLAST同源性比对。将测序结果上传至Gen Bank，申请登录号。利用MEGA-X软件对测得的序列连同从GenBank下载的基因序列进行多重对位排列并人工校正，采用NJ法构建系统发育树，自展检验1000次。

2 结果与分析

2.1　病原菌的分离与形态特征

从各个产地的蒙古黄芪病样中共分离得到61株真菌分离物，每株病样基本上可分离得到2~3株菌株。由表1可见，在陇西县收集到的病样数较多，因此分离得到的菌株数量最多，平均每株病样可分离到2.79株菌株。岷县及五寨县虽然病样数较少，但平均分离菌株数也较多，固阳县每株病样仅分离得到1株菌株，种类较单一。

根据菌落及孢子形态分析，61株真菌分离物来自16株菌株。有9株仅在陇西县发现；菌株A01在4个产地均有发现；菌株LMW在固阳县未有发现，而在另外3个产地普遍存在；菌株LWG未在岷县发现，在另外3个产地占比也较低；菌株LG1仅在陇西县和固阳县发现；菌株LM1在陇西县和岷县普遍存在；菌株M01仅在岷县发现；菌株W01仅在五寨县发现。

代表菌株的菌落及孢子形态见图1。菌株LMW的菌落呈白色丝状，圆形，边缘整齐，孢子细长两端较尖，有隔；菌株L04、L09、LWG可归为一类，菌落呈白色、浅黄色或黄绿色绒状，圆形，边缘整齐，孢子中间略弯曲，有隔；菌株L01、L08、M01、LG1可归为一类，菌落呈黄白色或浅绿色，圆形，边缘略不整齐，孢子略弯曲，有隔；菌株L06、LM1、A01可归为一类，菌落呈红色或粉色绒状，边缘较整齐，孢子多呈镰刀形，有隔；菌株L03的菌落呈浅紫色绒状，具丝状纹理，圆形，边缘略不整齐，孢子呈椭圆状且略弯曲；菌株L02、L05可归为一类，菌落呈棕色或暗粉色，表面光滑，边缘整齐，孢子呈球形；菌株L07、W01可归为一类，菌落呈灰白色，圆形，边缘整齐，L07未观察到孢子形态，W01孢子呈椭圆状。初步推测菌株L02、L03、L05、L07、W01不属于镰刀菌属，其余菌株均来自镰刀菌属。

2.2　病原菌的致病性测定方法

由图2可见，在孢子悬浮液浓度为1×10⁵ 个/mL时，蒙古黄芪根段未表现出明显发病症状；在浓度为1×10⁶ 个/mL时，出现了明显发病症状，侵染层次较为分明；在浓度为1×10⁷ 个/mL时，全部发病，部分根段发生严重腐烂，层次不明显，因此采用1×10⁶ 个/mL作为接种浓度。对于接种方式，根段处理的侵染结果较为明显，可见轮廓清晰的黑色斑点，易于观察和比较致病性强弱；而切片处理侵染结果呈浸润状，侵染轮廓不清晰，不易比较，且同一菌株侵染效果存在差异，可能会对结果造成干扰，因此采用根段处理作为接种方式。对于侵染时间，当侵染时间为3 d时，基本不表现出发病症状；当侵染时间为7 d时，侵染层次较为分明，可见轮廓较清晰的黑色斑点；当侵染时间为10 d时，全部发病，部分根段发生严重腐烂，层次不明显，因此采用7 d作为侵染时间。

2.3　病原菌的致病性测定

根据侵染情况可将16株菌株分为4类，见图3。第Ⅰ类包括菌株L02、L03、L05、L07，侵染后未出现变色或腐烂，无明显发病症状，推测其不具有致病性。第Ⅱ类包括菌株L04、L08、L09、M01，侵染后根段颜色泛红，其中大部分根段接种位置出现明显黑褐色或黑色斑点，推测其具有致病性。第Ⅲ类包括菌株L06、LMW、LM1、LWG，根段接种位置出现颜色较深的黑色斑点，伴有腐烂现象，个别根段发病程度较轻，推测其具有较强致病性。第Ⅳ类包括W01、L01、A01、LG1，根段接种位置出现颜色较深且面积较大的黑色斑点，伴有腐烂现象，推测其致病性最强，其中W01发病症状最为显著。对发病后的根段进行病原菌的再分离及鉴定，所得菌株均与原接种菌株相同，符合柯赫氏法则，故后3类菌株均属于蒙古黄芪根腐病致病菌。

2.4　病原菌的分子鉴定

利用真菌rDNA-ITS通用引物对具有致病性的12个菌株进行PCR扩增，获得大小为550 bp左右片段，测得序列与GenBank中已有的序列进行BLAST分析并建立系统发育树。由图4可见，菌株可聚类为4组，归属于4个种。第1组包含菌株LG1、M01、LM1、A01、L08、L06、L01，与GenBank登录号为KJ728693、OK338521、OM964482等的F. acuminatum菌株聚在一起。菌株LMW与GenBank登录号为OL348244、EU263916的F. solani菌株聚为第2组。菌株L04、L09、LWG与GenBank登录号为JN650598、PP843915、MH911393的F. oxysporum菌株聚为一类。菌株W01与GenBank登录号为PQ900717、OM965336的Clonostachys rosea菌株聚为第4组。

结合形态特征和分子鉴定结果，菌株LMW鉴定为茄腐镰刀菌（F. solani）；菌株L04、L09、LWG鉴定为尖孢镰刀菌（F. oxysporum）；菌株L01、L06、L08、LG1、LM1、A01、M01鉴定为锐顶镰刀菌（F. acuminatum）；菌株W01鉴定为粉红粘帚霉（C. rosea）。各菌株的形态观察及分子鉴定结果基本一致。

2.5　病原菌的分离频率及发病情况

由表2可见，蒙古黄芪各个产地的根腐病病原菌类型和分离频率存在较大差异。锐顶镰刀菌在各个产地均有分布，是陇西县、岷县、五寨县的主要致病菌，在陇西县的分离频率高达46.15%；茄腐镰刀菌虽在固阳县未发现，但在其它3个地区分离频率均相对较高；尖孢镰刀菌在甘肃岷县未发现。粉红粘帚霉仅在五寨县发现，分离频率相对较高。从产地来看，甘肃地区陇西县和岷县以锐顶镰刀菌和茄腐镰刀菌为主；山西五寨县4种病原菌均有分布；内蒙古固阳县病原菌为锐顶镰刀菌及尖孢镰刀菌，其中锐顶镰刀菌占优。

3 讨论

本研究从蒙古黄芪的4个主产区甘肃陇西县、甘肃岷县、山西五寨县、内蒙古固阳县收集的蒙古黄芪根腐病病样中共分离到61个真菌分离物，菌落及孢子形态分析表明其来自16个菌株。建立致病性测定方法测定病原菌致病性强弱，结果表明其中12株菌株具有致病性，且符合柯赫氏法则，验证为蒙古黄芪根腐病病原菌。依据形态特征及分子生物学鉴定结果，明确蒙古黄芪根腐病病原菌共有4种，3种来自镰刀菌属，包括锐顶镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌，及1种来自螺旋聚孢霉属（Clonostachys）的粉红粘帚霉。

本研究发现蒙古黄芪根腐病病原菌主要来自镰刀菌属，锐顶镰刀菌、茄腐镰刀菌和尖孢镰刀菌为主要致病菌，与高芬等^［16］的研究结果一致。在地理分布上，甘肃产区的优势病原菌为锐顶镰刀菌及茄腐镰刀菌，尖孢镰刀菌占比较低，与已有报道不同^{［15， 21］}；山西五寨县的病原菌类型多样，4种病原菌均有发现，之前该地区的研究中未报道粉红粘帚霉^［16］；内蒙古固阳县病原菌相对单一，以锐顶镰刀菌占优。相较于2000至2018年间的研究，各产区的优势病原菌及病原菌类型有所变化。除研究年份、取样点差异外，还可能与土壤、气候、种质等因素有关^［28］。首先，部分老产区长期连作引发了土壤微生物群落的失衡，有研究发现在连作土壤中生长的蒙古黄芪植株根部镰刀菌属相对丰度有所提高^［29］，即连作可能诱导病原菌类型演变甚至新病原的出现。其次，在全球变暖背景下，暴雨、高温、干旱等极端气候频发，对病原菌的生长、繁殖和传播均有影响，不同病原菌的适应性存在差异^［30］。同时，蒙古黄芪种质混杂和退化的问题较严重^［31］，可能导致其抗病性的变化，且蒙古黄芪生产中存在跨地区调运种子种苗的现象^［31］，加剧了病原菌扩散的风险。

2022年，Qi等^［32］首次报道了于青海民和县发现的粉红粘帚霉引起的黄芪根腐病，此外该病原菌还可引发青稞^［33］、太白贝母^［34］等作物的根腐病。粉红粘帚霉在蒙古黄芪根腐病的研究中报道较少，本研究仅在山西五寨县发现，但其具有较强的致病性，需引起关注。值得注意的是，粉红粘帚霉还是一种分布广泛的重寄生菌，具有一定的生防促生、改善连作障碍作用^［35］，有研究表明其可防治由F. culmorum和Bipolaris sorokiniana引起的小麦病害^［36］。

根腐病是由多种生物和非生物因素综合作用引起的，在研究中发现大多数病样均可分离得到2种病原菌，在五寨县的1株病样上甚至分离出了4种病原菌，说明蒙古黄芪的根腐病可能是由多种病原菌复合侵染形成的，因此还需要进一步探究病原菌的致病机制、发生规律，进行综合考量。目前蒙古黄芪根腐病的防治多集中于化学药剂^［25］、微生物菌剂^［37］的筛选与研发。其中微生物菌剂不仅具有良好的防治效果且对环境友好。在明确蒙古黄芪根腐病的主要病原菌及发病情况的基础上，可以根据主要病原菌的特性筛选对其有防治效果的生防微生物，实现对症下药、精准防控。而培育抗病品种也是防治蒙古黄芪根腐病的重要途径，可针对病原菌类型建立蒙古黄芪根腐病的抗病群体，采用分子育种技术进行高效育种。董林林等^［38］曾采用DNA标记辅助育种结合系统选育的技术，选育了首个三七抗病新品种‘苗乡抗七1号’，其根腐病的发病率较常规栽培种下降了8.6%。此外，还需规范蒙古黄芪种子种苗的生产，减少跨区域调运，并注意田间管理，优化耕作制度^［3］。

4 结论

综上所述，蒙古黄芪根腐病的主要病原菌为锐顶镰刀菌、尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌，其中锐顶镰刀菌是最主要的病原菌且致病性较强。粉红粘帚霉仅在五寨县发现，相关报道较少，但其具有较强致病性，需引起关注。本研究建立了孢子悬浮液点接离体根段的致病性测定方法，当采用浓度为1×10⁶ 个/mL的孢子悬浮液点接离体根段，侵染时间为7 d时，病斑明显，侵染层次较分明，此方法可为蒙古黄芪及其它植物根腐病的病原菌致病性测定提供参考。

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基金资助

国家重点研发计划项目课题(2022YFC3501504)