柴达木地区古毒蛾线粒体基因组结构分析

Analysis of the mitochondrial genome structure of Orgyia antiqua in the Qaidam Basin

摘要

目的 古毒蛾Orgyia antiqua为青海柴达木地区一种常见的草地灌丛害虫，主要危害盆地内维持荒漠草原生态平衡的重要灌木，本研究旨在探明柴达木地区古毒蛾线粒体基因组序列特征，以及在线粒体基因组学水平分析其与其它鳞翅目昆虫系统发育关系。 方法 采用Illumina HiSeq对柴达木地区古毒蛾的线粒体基因组进行测定，注释分析基因组序列特征，并利用最大似然法（ML）和邻接法（NJ）构建古毒蛾系统进化树，在线粒体基因组学水平分析古毒蛾与其它昆虫的系统发育关系。 结果 古毒蛾线粒体基因组全长15 457 bp，由37个基因以及1个非编码控制区（D-loop）组成，37个基因包含13个PCGs、22个tRNA基因和2个rRNA基因，线粒体基因之间存在重叠或基因间隔区；碱基组成表现出明显的AT偏好性；UUA相对密码子使用频率最多，其次为AUU、UUU；21个tRNA基因均形成典型的三叶草结构，而trnS1基因缺少DHU臂，未呈现三叶草形态；2个系统发育树分析结果均显示，古毒蛾与毒蛾科4种毒蛾聚在同一进化枝，其中与棉古毒蛾（Orgyia postica）和可茸毒蛾（Olene inclusa）亲缘关系最近。 结论 本研究获得了柴达木地区古毒蛾线粒体基因组，明确其基因组特征，并在线粒体基因组学水平探讨古毒蛾的系统发育关系，为后续研究毒蛾科昆虫系统进化关系及柴达木地区害虫绿色防控提供参考。

Abstract

Objective The Vapourer moth， Orgyia antiqua， is a common pest of grassland shrubs in the Qaidam region of Qinghai Province， primarily damaging important shrubs that maintain the ecological balance of the desert steppe in the basin. This study aimed to elucidate the characteristics of the mitochondrial genome sequence of O. antiqua from the Qaidam region and analyzed its phylogenetic relationships with other Lepidoptera insects at the mitochondrial genomic level. Methods The mitochondrial genome of O. antiqua from the Qaidam region was sequenced using Illumina NovaSeq. The characteristics of the genome sequence were annotated and analyzed. Phylogenetic evolutionary tree of O. antique were constructed using Neighbor⁃Joining （NJ） and Maximum⁃Likelihood （ML） method to analyze its phylogenetic relationships between O. antiqua and other insects at the mitochondrial genomics level. Results The complete mitochondrial genome of O. antiqua was 15 457 bp in length， consisting of 37 genes（including 13 PCGs， 22 tRNA genes， 2 rRNA genes）and one non⁃coding control region （D-loop）. Overlapping regions or intergenic spacers were present between some mitochondrial genes. The base composition showed a distinct AT bias. The UUA codon was the most frequently used relative codon， followed by AUU （isoleucine， Ile） and UUU. Twenty-one tRNA genes all formed the typical cloverleaf secondary structure， whereas the trnS1 gene lacked the DHU arm and did not exhibit the cloverleaf morphology. Both phylogenetic tree analyses showed that O. antiqua clustered within the same clades as four other species from the family Lymantriidae， with the closest relationship being to Orgyia postica and Olene inclusa. Conclusion The mitochondrial genome of O. antiqua from the Qaidam region was obtained，its genomic characteristics were clarified， and its phylogenetic relationships was discussed at the mitochondrial genomics level. These findings provided a reference for subsequent research on the phylogenetic relationships of Lymantriidae insects and for the green prevention and control of pests in the Qaidam region.

Graphical abstract

关键词

古毒蛾 / 毒蛾科 / 鳞翅目 / 线粒体基因组 / 系统发育分析

Key words

Orgyia antiqua / Lymantriidae / Lepidoptera / Mitochondrial genome / Phylogenetic analysis

昆虫的线粒体基因组作为一种分子遗传标记被广泛应用于昆虫种类鉴定、系统发育和种群遗传结构等昆虫系统学研究^［1-2］，其具有基因重组率低、突变率高，母系遗传，进化速率较快，易于进行PCR扩增以及相对保守的基因组组织结构等特点^［3-4］。鳞翅目昆虫线粒体基因组长度介于15~16 kb之间，通常为共价闭合的1个环状双链DNA分子，其AT含量为77.8%~82.7%，其组成包含37个相对保守的基因和1个非编码控制区（non-coding control region），37个相对保守的基因即13个蛋白质编码基因（PCGs）（atp6、atp8、cob、nad1~nad6、nad4L和cox1~cox3）、2个核糖体RNA（rrnL和rrnS）和22个转运RNA（tRNAs）。迄今为止，NADH脱氢酶亚基nad5、细胞色素C氧化酶亚基cox1、cox2等已被广泛研究并用于鳞翅目物种的分类与鉴定。起初，线粒体基因在鳞翅目昆虫的研究中主要用于物种鉴定，随后，其作用从传统特征描述转变为主要探究物种系统发育关系^［5-7］。现如今大量鳞翅目昆虫的线粒体基因组被报道，据前人研究鳞翅目首个被测定和报道线粒体基因组的昆虫为家蚕（Bombyx mori），后续为明确家蚕是否是由野蚕（Bombyx mandarina）经人工驯化而来，大量的野蚕及家蚕线粒体基因组被研究^［8］，此外，也有大量蛾、蝶类昆虫线粒体基因组被研究，如扁刺蛾（Thosea sinensis）^［9］、光眉刺蛾（Narosa fulgens）^［10］、玉带凤蝶（Papilio polytes）^［11］以及棉铃虫（Helicoverpa armigera）^［12］等。

毒蛾科（Lymantriidae）在我国分为2个亚科（毒蛾亚科、古毒蛾亚科）、37属、343种，是农林业及牧业上的重要害虫^［13］。其危害发生时，常对果园、森林等造成严重的危害；为害严重时，幼虫因具有毒腺，造成区域流行性眼炎、皮炎的发生，影响人及家畜生产劳动及健康，严重时可造成中毒，以致死亡^［14］。物种系统发育关系有助于为更好地理解毒蛾科的系统演化提供线粒体系统发育基因组学数据，并为古毒蛾的谱系关系研究提供有力证据，以便发挥生物防治作用^{［10，15］}。迄今为止，仅对毒蛾科部分昆虫遗传信息及其与鳞翅目其它物种的系统发育进行了初步研究，如2000年Bogdanowicz对来自日本欧洲等不同地区舞毒蛾（Lymantria dispar）种群进行线粒体基因组序列变异分析，观察到舞毒蛾线粒体基因组的不同地理变异模式^［16］；在此基础上，周贤等^［17］后续对几个舞毒蛾地理种群体的分化、扩散和遗传变异作了进一步的研究和讨论，认为日本是舞毒蛾分化的中心，而北美舞毒蛾则形成独立的一支；棉古毒蛾（Orgyia postica）线粒体基因组研究发现其与（Laelia suffusa）系统发育关系最近^［18］；2019年基于线粒体基因组，Wu等^［19］重建了木毒蛾（Lymantria xylina（L. xylina +（L. dispar + Lymantria sp. AN-2017）））的姐妹群关系。目前缺乏对毒蛾科昆虫线粒体基因组的全面了解，亟需对该类群进行更全面的全基因组测序，从而为后续深入解析该类群的系统发育关系提供数据支撑。

古毒蛾（Orgyia antiqua）属鳞翅目（Lepidoptera）毒蛾科（Lymantriidae）古毒蛾属昆虫，在我国主要分布于甘肃、宁夏、青海、西藏等地区^［20］。该虫在青海柴达木地区为常见草地灌丛害虫，主要危害盆地内维持荒漠草原生态平衡的重要灌木白刺属植物^［21］，如唐古特白刺（Nitraria tangutorum）、大果白刺（N.roborowskii Kom）和小果白刺（N.sibirica Pall）^［22］，且对柴达木地区枸杞（Lycium chinense）、盐爪爪（Kalidium foliatum）和驼绒黎（Ceratoides latens）等其它具有防风固沙和改善土壤盐渍作用的荒漠经济植被也有一定危害，加速柴达木地区草地生态平衡的恶化，加剧了草地沙化^［22］。柴达木盆地位于青藏高原东北部，地处高原，气候极端干旱，因此植被种类单一，覆盖率低，且近年来虫害泛滥，因此对当地害虫的研究至关重要。研究物种系统发育关系有助于为更好地理解毒蛾科的系统演化提供线粒体系统发育基因组学数据，并为古毒蛾的谱系关系研究提供有力证据，以便发挥生物防治作用。目前对柴达木古毒蛾的研究涉及生物学研究及防治^［20-22］，关于古毒蛾线粒体基因组的研究还未见报道，本研究首次对柴达木地区古毒蛾进行全基因组测序，可丰富我国毒蛾科的线粒体基因组数据，将为后续毒蛾科类群遗传进化关系深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　标本采集与DNA提取

古毒蛾幼虫于2023年6月在青海省海西蒙古族藏族自治州（36°N，97°E，海拔3100米）采集，置于实验室适宜条件饲养至羽化出成虫，收集雌雄成虫并用液氮速冻储存于-80 ℃的冰箱供后续提取DNA。采用通用基因组DNA提取试剂盒（索莱宝有限公司，北京）提取古毒蛾雄成虫的总DNA，并利用超微量分光光度计（凯奥科技，北京）和琼脂糖凝胶电泳（1%）检测样本浓度及质量。

1.2　Illumina Novaseq高通量测序

用质检合格且浓度在20 ng/μL以上DNA样品进行高通量测序并构建350 bp的小片段文库（诺禾致源生物科技有限公司，南京）。后续进行PCR扩增，形成测序文库后利用Illumina NovaSeq平台进行PE150测序，最终获得原始数据。

1.3　序列拼装、注释及特征分析

对测序得到的原始数据整理、过滤得到Clean date，再进行拼接并构建contigs，对数据集进行组装及校正得到古毒蛾线粒体基因组全长序列，利用在线网站MITOS2（http：//mitos2.bioinf.uni-leipzig.de/index. py）对获得的基因组序列进行功能注释及验证^［23］。利用CGVIEW软件（default parameter）绘制出基因组圈形图；用MEGA11软件对古毒蛾线粒体基因组的碱基组成及其偏好性进行计算和统计。

1.4　古毒蛾系统发育分析

包括NCBI上下载已发表22种昆虫序列（20种鳞翅目昆虫序列作为内群，2种双翅目昆虫序列作为外群）（表1），以及古毒蛾1条序列，共23条线粒体基因组序列，采用共有CDS做进化树分析，用RAxML v8.2.10（https：//cme.h-its.org/exelixis/software.html）以及rapidnj v2.3.3（https：//github.com/somme89/rapidNJ）软件，采用GTRGAMMA模型，rapid Bootstrap分析（bootstrap=1000），分别构建ML树和NJ树。

1.5　Ka/Ks分析

使用软件mafft v7.427（https：//mafft.cbrc.jp/alignment/software）比对基因序列，并采用KaKs_Calculator v2.0（https：//sourceforge.net/projects/kakscalculator2/）软件计算基因的Ka/Ks值。

2 结果与分析

2.1　线粒体基因组序列分析

柴达木地区古毒蛾的线粒体基因组具有典型的闭合双链环状DNA分子结构（图1），全长15 457 bp，由13个PCGs（atp6、atp8、cob、nad1~6、nad4L和cox1~3）、2个rRNA（rrnS和rrnL）、22个RNA和1段非编码控制区（D-loop）组成。基因组存在间隔现象以及重叠区，最长间隔序列居于trnQ基因和nad2基因之间（46 bp）。其中2对基因相邻，包括trnV与rrnS以及trnK与trnD，3对基因存在重叠，重叠长度为1~7 bp，最长基因重叠位于trnW基因和trnC基因之间（7 bp）。13个PCGs的长度介于62（trnR）~1743 bp（nad5）之间，起始密码子均为ATN，9个PCGs终止密码子均为完整TAA，其余4个PCGs（cox1、cox2、nad4和cob）以不完整的T结尾。非编码控制区是古毒蛾线粒体基因组最短的区域，长494 bp，位于rrnS基因和trnM基因之间（图1及表2）。

2.2　碱基组成及偏向

古毒蛾线粒体全基因组碱基组成中A、T、C、G含量差异较大，含量处于9.89%~38.83%，AT含量较高为74.43%。在各基因及非控制区中AT含量占比为72.61%~95.14%。其中PCGs中AT含量最低为72.61%，D-loop区AT含量最高为95.14%，GC含量占比为4.86%~27.39%，且AT偏斜的AT-skews和GC偏斜的GC-skews分别为0.043和-0.227，显示出明显的AT偏好。不同区域的碱基偏好性存在明显差异，PCGs、rRNAs和Dloop更偏向T碱基，其AT-skew均为负值（-0.136、-0.015和-0.068）；而tRNAsAT-skew均为正值（0.025），则更偏好A碱基（表3）。

2.3　氨基酸及密码子使用情况

古毒蛾线粒体的13个PGGs共编码3736个氨基酸，相对同义密码子使用频率（RSCU）显示，其在进化过程中存在明显偏好，其中UUA（Leu）使用432次，RSCU为4.73，相对密码子使用频率最多，AUU和UUU次之，分别使用404次和319次，RSCU分别为1.80和1.79，UAA作为终止密码子使用13次，而密码子使用次数最少为使用1次，包括ACG、CUG和GCG，RSCU分别为0.03、0.01和0.03（表4）。

2.4　tRNA二级结构

古毒蛾线粒体基因组21个tRNA基因均形成典型的三叶草结构，而trnS1基因因缺少DHU臂，未呈现出三叶草形态。tRNA出现16对非典型U-G错配，即在二氢尿嘧啶臂、氨基酸接受臂、反密码子臂和TΨC 臂仅分别存在7、5、3和1对。

2.5　基因组系统发育关系

本研究选取古毒蛾在内的21种鳞翅目昆虫序列作为内群，以双翅目果蝇科果蝇与黑腹果蝇为外群，采用2种方法构建系统发育树，ML树和NJ树结果均表明古毒蛾与4种毒蛾聚在同一进化枝，其中棉古毒蛾（Orgyia postica）、可茸毒蛾（Olene inclusa）和本文所研究古毒蛾（Orgyia antiqua）聚为一枝，置信值为100%，则说明古毒蛾与棉古毒蛾和可茸毒蛾亲缘关系最近，且两个树均显示毒蛾科5个物种聚在同一进化枝，且又与夜蛾科昆虫聚集在一进化大枝，外群果蝇科以及其余各亚科分别形成独立的分支。

2.6　Ka/Ks分析

将古毒蛾线粒体基因组与毒蛾科近缘物种肾毒蛾C. locuples线粒体基因组（登录号为NC_068591.1）以及可茸毒蛾O. inclusa线粒体基因组（登录号为NC_062102.1）的13个PGGs进行进化率分析，结果表明，古毒蛾与肾毒蛾蛋白质基因nad4l进化率最高，且Ka/Ks为1.088，则说明受正选择效应，其余基因均展现出负选择效应（Ka/Ks比值大于1，说明受正选择效应）；而古毒蛾与可茸毒蛾atp8基因Ka/Ks均小于1，则受负选择效应，且柴达木地区古毒蛾与2个近缘物种肾毒蛾和可茸毒蛾线粒体基因组的13个PGGs的Ka/Ks都最小为0.040，显示cox1基因的进化速率最慢（表5）。

3 讨论

线粒体基因组由于结构简单、具有较快进化速率，所含遗传进化信息丰富，目前被广泛应用于比较基因组学和进化生物学研究^［24］。本研究利用Illumina HiSeq技术首次获得了柴达木地区常见草地灌丛害虫古毒蛾线粒体基因组，其结构呈现典型的双链闭合环状，全长15 457 bp，这一点与大部分鳞翅目昆虫的基因组研究结果相吻合，如舞毒蛾（15 569 bp）、木毒蛾（15 488 bp）、棉古毒蛾（15 258 bp）、茶六斑褐锦斑蛾（Sorita pulchella）（15 216 bp）和玉带凤蝶（Papilio polytes）（15 267 bp）^{［11，18， 25-26］}。其基因组包含13个PCGs、22个tRNA基因、2个rRNA基因以及1个非编码控制区（D-loop），基因组存在基因间隔和重叠区，最大基因重叠区（7 bp）介于rrnW基因与rnC基因之间，该发现与草原毛虫研究结果相似^［27］。本研究发现，古毒蛾线粒体基因组全系列AT含量占比为74.43%，在各基因及非控制区中AT含量占比为72.61%~95.14%，呈现明显的AT偏好性。PCGs中，13个PCGs起始密码子均为ATN，这与昆虫纲大多数昆虫一致^［28］，9个PCGs均以完整的终止密码子TAA结尾，其余4个基因cox1、cox2、cob和nad4以T结尾，这与祖先昆虫果蝇和后生动物线粒体基因组研究相吻合^［28-29］。

昆虫线粒体基因组中，D-loop区域各不相同，序列长度差异较大，AT含量较高，有研究表明其能够调节昆虫线粒体基因组的复制和转录水平。古毒蛾D-loop位于rrnS基因和trnM基因之间，是其线粒体基因组最短的区域，长度为494 bp，且该

区域AT含量在95%以上，这与光眉刺蛾、芬氏羚野螟（Pseudebulea fentoni）、扶桑大卷叶野螟（Notarcha quaternalis）研究结果一致^{［10， 30］}。

古毒蛾全基因组相对密码子使用频率最多的为AUU、UUA以及UUU；詹金钰^［30］对斑野螟亚科部分昆虫也有同样结论，如芬氏羚野螟（Pseudebuleafentoni）和黄杨绢野螟（Cydalima perspectalis）等。而使用次数最少的为ACG、GCG和CUG，这与菜粉蝶研究结果相似^［31］。

古毒蛾22个tRNA基因中，21个tRNA基因均形成典型的三叶草结构，而trnS1基因因缺少DHU臂，未呈现三叶草形态，这与鳞翅目昆虫光眉刺蛾和暗影饰皮夜蛾（Garella ruficirra）研究结构相类似（均为trnS1缺少DHU臂而不具有稳定的三叶草结构）^{［10， 32］}；碱基错配现象普遍存在于昆虫类群tRNA中，古毒蛾中发现16对U-G错配，这符合tRNA碱基摆动配对原则，或许可维持古毒蛾tRNA二级结构的稳定^［33］。

前人研究发现，几乎所有动物及大多数昆虫中，cox1基因由于经过了最高的纯化选择，其Ka/Ks最低，进化速率最慢^［34-35］。古毒蛾与毒蛾科近缘物种可茸毒蛾和肾毒蛾线粒体基因组13个PGGs进行进化率分析表明，cox1基因的进化速率最慢，即具有相对较低的变异率^［34］。

进化史通常基于进行1000次自举重复的最大似然法推断^［36］。本研究2种系统发育树结果均发现古毒蛾与毒蛾科4种毒蛾聚在同一进化枝，其中与棉古毒蛾和可茸毒蛾亲缘关系最近，且毒蛾科5个物种与夜蛾科昆虫聚集在同一进化大枝，则推测毒蛾科昆虫线粒体基因组遗传谱系可能不是单系，而与夜蛾科昆虫线粒体系统谱系较近，但目前毒蛾科昆虫线粒体基因组研究数据有限，具体遗传谱系还需后续深入研究。

本研究获得了古毒蛾的线粒体全基因组，分析了基因组序列特征及tRNA二级结构，并且计算了古毒蛾蛋白质编码基因和近缘物种进化率，最后基于13个PGGs采用最大似然法和邻近法构建了古毒蛾和鳞翅目其它昆虫ML树和NJ树，本研究补充了毒蛾科线粒体基因组数据，可为在柴达木盆地利用其进行生物防治提供理论参考，进而为后续深入研究毒蛾科的系统发育及种群遗传结构提供数据支撑。

4 结论

本文采用Illumina HiSeq技术，对柴达木地区古毒蛾成虫进行全基因组测列，进而对其线粒体基因组基因组成、碱基偏好、密码子使用频率及tRNA二级结构进行研究，并通过线粒体基因组学层面探讨古毒蛾与其它鳞翅目类群的亲缘关系。结果发现古毒蛾线粒体基因组全长为15 457 bp，包含13个PCGs、22个tRNA和2个rRNA（即37个基因）以及1个非编码控制区，碱基组成呈现为明显的AT偏好；基因组存在基因间隔和基因重叠区；起始密码子都为典型的ATN，其中9个PCGs以完整的终止密码子TAA结尾；相对密码子使用频率最多的为UUA；21个tRNA基因均形成典型的三叶草结构，trnS1基因因缺少DHU臂，未呈现三叶草形态；2个系统发育树分析结果均显示，古毒蛾与毒蛾科4种毒蛾聚在同一进化枝，其中与棉古毒蛾和可茸毒蛾亲缘关系最近。本研究首次测定并确定了柴达木地区古毒蛾的线粒体基因组特征，丰富了毒蛾科基因组数据，为后续毒蛾科分类和系统发育研究提供了参考依据。

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