氟离子核糖开关调控行为的动力学研究

Kinetic Study for Regulation Behaviors of the Fluoride Riboswitch

摘要

核糖开关位于RNA（ribonucleic acid）的非编码区，参与调控很多重要的生物过程。本文利用已发展的RNA转录折叠预测方法，研究了位于Thermotoga petrophila中的氟离子核糖开关。计算结果表明，该核糖开关在转录过程中先折叠成一个包含假结并可以特异性结合配体的适体域结构。当氟离子浓度较低时，随着RNA序列的延长，转录终止子开始成核、延长，最终完全形成，引起转录提前终止；当氟离子浓度较高时，配体和适体域结构结合形成一个稳定的复合体结构，阻止了转录终止子的形成，从而使得下游基因可以正常表达。该核糖开关受转录速度和配体浓度的联合控制，体现出动力学调控特性。

Abstract

Riboswitches, resided within non-coding region of certain RNA, are involved in many important biological processes. By using the recently developed RNA co-transcription folding prediction methods, we studied the regulation of the fluoride riboswitch from Thermotoga petrophila. The results suggest that the riboswitch folds into the terminator (T) with a pseudoknot, which can specially bind fluoride ions during transcription. At a low fluoride concentration, with the elongation of the nascent RNA chain, the terminator is nucleated and formed, which leads to the transcription termination. At a high fluoride concentration, the aptamer structure binds the ligand to form a stable complex structure, which prevents the full formation of the terminator and promotes expression of downstream genes. The transcription speed and ligand concentration are coupled to control regulation activities of the riboswitch, which are consistent with a kinetic control model.

Graphical abstract

关键词

氟离子核糖开关 / 转录折叠 / 基因调控 / RNA结构 / 折叠动力学

Key words

fluoride riboswitch / co-transcription folding / gene regulation / RNA structure / folding kinetics

0　 引 言

核糖开关（riboswitch）是mRNA上通过与代谢产物或其他配体小分子相结合，引起构象变化从而调控目的基因表达的RNA结构元件。迄今为止，细菌、真菌和动植物中已发现有多种核糖开关参与多个重要的生命代谢过程^[1,2,3]。核糖开关将基因的表达与周围的环境建立起联系，具有特异性、开关自由、灵敏度高等特点，在基因表达与调控，人工筛选适配体，新型抗菌药物的研发等方面有着广泛的应用前景^[4,5]。核糖开关一般包含两个结构单元：适体域序列和表达单元。适体域序列具有高度保守性，负责特异性地识别并结合配体，而表达单元主要是根据构象变化在转录、翻译、剪接水平上对下游基因的表达进行调控^[2,6]。核糖开关通常可以形成两个功能结构，根据是否结合配体，可以分为结合态和未结合态；根据构象所执行的生物功能，又可以分为基因表达的打开态（ON）和基因表达的关闭态（OFF）^[2,6]。在细菌中广泛存在的氟离子核糖开关，可以根据周围环境中的氟离子浓度，在转录水平对下游编码氟化物转运蛋白和酶的基因的表达进行调控^[7,8]。前人已经通过不同的方法，在氟离子核糖开关与配体的特异性结合以及结合热力学参数等方面取得重大进展^[7,8,9]。然而，针对其功能结构，存在着不同的打开态结构模型^[7,9]。由于核糖开关是在转录过程中合成，故其功能结构与转录过程密切相关。有关核糖开关如何在转录过程中根据配体浓度折叠成不同的功能结构以及其调控特性这些关键问题，目前尚不清楚。为了解决这些关键问题，本文利用已发展的转录折叠预测方法^{[10,11,12,13]}，对细菌Thermotoga petrophila中的氟离子核糖开关（fluoride riboswitch）在细胞中的调控行为进行系统研究，期望能够为生物分子开关、生物传感器以及新型抗菌药物的设计等方面提供理论依据。

1　 研究方法

RNA所执行的生物功能一般由所折叠的结构决定。RNA折叠有两种不同的方式^[14,15]：1）整个RNA分子被完全合成以后再折叠（复性折叠），主要发生在体外；2）RNA边转录边折叠（转录折叠），主要发生在体内。RNA复性折叠行为可以通过先计算构象之间的跃迁速率，再求解主方程得到。将主方程法进行时序性推广就可以用来研究RNA转录折叠的动力学行为。

1.1　计算跃迁速率

RNA折叠的基本过程是通过形成连续的碱基堆积折叠成一个螺旋。在形成碱基堆积的过程中，需要克服的主要是形成碱基堆积时熵的减少；而打开一个碱基堆积时，主要克服破坏碱基堆积形成氢键的焓变。因此，形成和打开一个碱基堆积的速率分别是^[16,17]

k_{\text{+}}\text{=}{k}_{\mathrm{0}}{\mathrm{e}}^{\text{-}T\mathrm{\Delta }S\text{/}{k}_{\mathrm{B}}T}(1)

k_{\text{-}}\text{=}{k}_{\mathrm{0}}{\mathrm{e}}^{\text{-}\mathrm{\Delta }H\text{/}{k}_{\mathrm{B}}T}(2)

其中，k_{\mathrm{B}}、T 分别是玻尔兹曼常数（J/K）和温度（K）；对于GC和AU碱基配对，k_{\mathrm{0}}分别是\mathrm{6.6}\text{×}{\mathrm{10}}^{\mathrm{13}}{\mathrm{s}}^{\text{-}\mathrm{1}}和\mathrm{6.6}\text{×}{\mathrm{10}}^{\mathrm{12}}{\mathrm{s}}^{\text{-}\mathrm{1}}；\mathrm{\Delta }S，\mathrm{\Delta }H是形成和破坏碱基堆积分别所克服的熵变和焓变。若形成一个碱基堆积的同时还伴随着环的改变，则\mathrm{\Delta }S\text{=}\mathrm{\Delta }{S}_{\mathrm{s}\mathrm{t}\mathrm{a}\mathrm{c}\mathrm{k}}\text{+}\mathrm{\Delta }{S}_{\mathrm{l}\mathrm{o}\mathrm{o}\mathrm{p}}；反之，\mathrm{\Delta }S\text{=}\mathrm{\Delta }{S}_{\mathrm{s}\mathrm{t}\mathrm{a}\mathrm{c}\mathrm{k}}。\mathrm{\Delta }{S}_{\mathrm{s}\mathrm{t}\mathrm{a}\mathrm{c}\mathrm{k}}、\mathrm{\Delta }{S}_{\mathrm{l}\mathrm{o}\mathrm{o}\mathrm{p}}、\mathrm{\Delta }{H}_{\mathrm{s}\mathrm{t}\mathrm{a}\mathrm{c}\mathrm{k}}分别表示形成碱基堆积和环时熵的减少和打开该碱基堆积需要克服的焓变。

由于单个碱基配对不稳定，RNA结构基本都是以螺旋为单元构建的，称之为基于螺旋的计算模型。在这个模型中^[17]，两个构象之间的转换速率是根据它们之间的结构关系（形成、打开一个螺旋或者两个交叠螺旋之间的交换），并结合势能曲面来求得。

在螺旋的形成过程中，一般形成一个碱基堆积之后，其他的碱基堆积都可以顺序生长，即拉链模型^[16,17]。连续3个碱基堆积可以稳定一个发夹环结构，因而形成前3个连续的碱基堆积之后势能曲面呈现出下降的趋势（图1（a））。因此，沿着某条路径形成一个螺旋结构的速率近似等于形成前3个碱基堆积的速率^[17]。图1（b）中沿\mathrm{1}\text{→}\mathrm{2}\text{→}\mathrm{3}路径的速率为

\begin{array}{l}{k}_f\text{=}{k}_{\mathrm{1}\text{→}\mathrm{2}}{K}_{\mathrm{1}}\text{(}\mathrm{1}\text{-}{K}_{\mathrm{2}}^{\mathrm{\text{'}}}{K}_{\mathrm{1}}^{\mathrm{\text{'}}}\stackrel{\mathrm{\infty }}{\text{∑}_{n\text{=}\mathrm{0}}}\text{(}{K}_{\mathrm{2}}^{\mathrm{\text{'}}}{K}_{\mathrm{1}}{\text{)}}^n\text{)}\text{=}\\ k_{\mathrm{1}\text{→}\mathrm{2}}{K}_{\mathrm{1}}\text{(}\mathrm{1}\text{-}{K}_{\mathrm{2}}^{\mathrm{\text{'}}}{K}_{\mathrm{1}}^{\mathrm{\text{'}}}\frac{\mathrm{1}}{\mathrm{1}\text{-}{K}_{\mathrm{2}}^{\mathrm{\text{'}}}{K}_{\mathrm{1}}}\text{)}\end{array}(3)

其中，k_{i\text{→}j}表示结构i到j的转换速率，

K_{\mathrm{1}}\text{=}\frac{k_{\mathrm{2}\text{→}\mathrm{3}}}{k_{\mathrm{2}\text{→}\mathrm{3}}\text{+}{k}_{\mathrm{2}\text{→}\mathrm{1}}\text{+}{k}_{\mathrm{2}\text{→}\mathrm{4}}}(4)

K_{\mathrm{1}}^{\mathrm{\text{'}}}\text{=}\frac{k_{\mathrm{2}\text{→}\mathrm{1}}}{k_{\mathrm{2}\text{→}\mathrm{3}}\text{+}{k}_{\mathrm{2}\text{→}\mathrm{1}}\text{+}{k}_{\mathrm{2}\text{→}\mathrm{4}}}(5)

K_{\mathrm{2}}\text{=}\frac{k_{\mathrm{3}\text{→}\mathrm{5}}\text{+}{k}_{\mathrm{3}\text{→}\mathrm{6}}}{k_{\mathrm{3}\text{→}\mathrm{2}}\text{+}{k}_{\mathrm{3}\text{→}\mathrm{5}}\text{+}{k}_{\mathrm{3}\text{→}\mathrm{6}}}(6)

K_{\mathrm{2}}^{\mathrm{\text{'}}}\text{=}\frac{k_{\mathrm{3}\text{→}\mathrm{2}}}{k_{\mathrm{3}\text{→}\mathrm{2}}\text{+}{k}_{\mathrm{3}\text{→}\mathrm{5}}\text{+}{k}_{\mathrm{3}\text{→}\mathrm{6}}}(7)

对于一个螺旋结构，存在多条折叠路径（图1（b）），因此，形成一个螺旋结构的速率K_{\mathrm{F}}等于所有可能折叠路径的速率之和。若该螺旋结构的自由能是\mathrm{\Delta }G，则断开这个螺旋结构的速率为

k{}_{\mathrm{U}}{}^{}\text{=}{K}_{\mathrm{F}}{\mathrm{e}}^{\text{-}\mathrm{\Delta }G\text{/}{k}_{\mathrm{B}}T}(8)

如果螺旋A和螺旋B存在碱基交叠，那么A和B之间的交换主要通过隧道路径：首先断开螺旋A的一部分，螺旋B就可以开始成核，随后每断开螺旋A的一个碱基对，就形成螺旋 B的一个碱基对（碱基对交换，图1（c））。这种相互转换速率可以通过以下公式计算得到^[17]

k_{\mathrm{A}\text{→}\mathrm{B}}\text{=}\frac{\stackrel{n}{\text{∏}_i}{k}_i}{\stackrel{n\text{-}\mathrm{1}}{\text{∑}_{j\text{=}\mathrm{0}}}\text{(}\stackrel{j}{\text{∏}_{i\text{=}\mathrm{1}}}{k}_i^{\text{'}}\stackrel{n}{\text{∏}_{m\text{=}j\text{+}\mathrm{2}}}{k}_m^{}\text{)}}(9)

k_{\mathrm{B}\text{→}\mathrm{A}}\text{=}{k}_{\mathrm{A}\text{→}\mathrm{B}}{\mathrm{e}}^{\text{-}\mathrm{\Delta }{G}_{\mathrm{A}\mathrm{B}}\text{/}{k}_{B}T}(10)

其中，k_n和k_n^{\mathrm{\text{'}}}分别为形成/断开和断开/形成螺旋 A/B中相关碱基对的速率，\mathrm{\Delta }{G}_{\mathrm{A}\mathrm{B}}为结构A和结构B的自由能之差。

1.2　复性折叠动力学

对于一个给定的RNA分子，根据碱基配体原则，以螺旋为基本单位，通过枚举得到该序列可以形成的所有可能构象（二级结构和包含假结的结构）组成的构象空间。其中二级结构的自由能，可以由最近邻模型计算得到^[18,19]；对于包含假结结构的自由能，可以根据基于Eddy模型的经验公式求得^[20,21,22]

G_{\mathrm{p}\mathrm{s}}\text{=}\left\{\begin{array}{l}\mathrm{0.83}{G}_{\mathrm{s}\mathrm{s}}\text{+}\mathrm{0.2}{n}_{\mathrm{f}}\text{+}\mathrm{0.1}{n}_{\mathrm{p}}\text{(}{n}_{\mathrm{f}}\text{≤}\mathrm{9}\text{)}\\ \mathrm{0.83}{G}_{\mathrm{s}\mathrm{s}}\text{+}\mathrm{0.2}\text{[}\mathrm{9}\text{+}log\text{(}{n}_{\mathrm{f}}\text{/}\mathrm{9}\text{)}\text{]}\text{+}\mathrm{0.1}{n}_{\mathrm{p}}\text{(}{n}_{\mathrm{f}}\text{>}\mathrm{9}\text{)}\end{array}\right.(11)

其中，G_{\mathrm{p}\mathrm{s}}是假结的自由能；G_{\mathrm{s}\mathrm{s}}是形成假结之前环的自由能；n_{\mathrm{f}}和n_{\mathrm{p}}是未配对和配对碱基的数目。每个构象出现的占据比例时间变化可以用主方程来描述^[17]

\mathrm{d}{p}_i\text{(}t\text{)}\text{/}\mathrm{d}t\text{=}\text{∑}_{j\text{≠}i}\text{[}{k}_{j\text{→}i}{p}_j\text{(}t\text{)}\text{-}{k}_{i\text{→}i}{p}_i\text{(}t\text{)}\text{]}(12)

其中，p_i\text{(}t\text{)}，p_j\text{(}t\text{)}分别表示构象i和构象j在时刻t的占据比例。主方程可以写成矩阵形式：\mathrm{d}\mathit{p}\text{(}t\text{)}\text{/}\mathrm{d}t\text{=}\mathit{M}\text{⋅}\mathit{p}\text{(}t\text{)}，其中\mathit{p}\text{(}t\text{)}是由所有构象的占据比例组成的列矩阵，\mathit{M}是由构象之间的跃迁速率组成的矩阵（M_{ii}\text{=}\text{-}\text{∑}{k}_{i\text{→}j}，M_{ij}\text{=}{k}_{i\text{→}j}（i\text{≠}j）），通过求解主方程可以得到RNA 构象空间中每一个态的占据比例随时间的演化

\mathit{p}\text{(}t\text{)}\text{=}\stackrel{n}{\text{∑}_{m\text{=}\mathrm{1}}}{C}_m{\mathit{n}}_m{\mathrm{e}}^{\text{-}{\lambda }_{m}t}(13)

其中，{\lambda }_m和{\mathit{n}}_m分别是第m个本征值和本征矢，系数C_m是由初始条件p\text{(}\mathrm{0}\text{)}和{\lambda }_m决定的常数。

1.3　转录折叠动力学研究

为了研究转录过程中RNA的折叠过程，时序性推广的主方程方法被成功地发展并应于研究mRNA的转录折叠^[10]。在该模型方法中，将合成一段L-nt (nucleotide)的RNA链分为L个转录步，每一步合成或释放一个新的核苷酸。假设RNA聚合酶以一个恒定的速率v（nt/s）合成核苷酸，则每一步的折叠时间窗口是合成下一个相应核苷酸所需要的时间，即\mathrm{1}\text{/}v。第二个转录步的初始结构是链长为1的自由链结构。随后根据RNA链延长一个新的核苷酸，RNA结构所有可能发生的变化，可以将连续两个转录步之间的RNA结构关系分为4种（a, b, c, d，见图2）。对于结构没有发生明显改变的a, b, c类，p_{\mathrm{a}\text{,}\mathrm{b}\text{,}\mathrm{c}}{\text{(}N\text{+}\mathrm{1}\text{)}}_{\mathrm{b}\mathrm{e}\mathrm{g}\mathrm{i}\mathrm{n}}\text{=}{p}_{\mathrm{a}\text{,}\mathrm{b}\text{,}\mathrm{c}}{\text{(}N\text{)}}_{\mathrm{e}\mathrm{n}\mathrm{d}}。若新释放的核苷酸参与形成一个新的螺旋结构（d类），则p_{\mathrm{d}}{\text{(}N\text{+}\mathrm{1}\text{)}}_{\mathrm{b}\mathrm{e}\mathrm{g}\mathrm{i}\mathrm{n}}\text{=}\mathrm{0}。

在每一个转录步中，首先以螺旋为基本单元枚举出所有可能的结构并计算构象之间的转换速率（（8）、（9）、（10）式），然后根据占据比例继承关系得到当前转录步的初始条件，最后通过解主方程（（13）式）求得在转录步时间窗口内每个构象的占据比例变化关系。通过将转录过程划分若干个转录步，递推使用上述方法就可以得到整个mRNA转录折叠行为。

1.4　配体结合动力学研究

对于氟离子核糖开关来说，从第45个核苷酸可以自由形成配对时，结合氟离子的适体域结构就可以形成。这一结构包含螺旋P1，P2和P3，可以特异性地结合氟离子形成结合态^[7]。为了研究氟离子核糖开关的调控行为，从第45步就需要考虑配体与核糖开关的结合。在计算有配体结合时的动力学时，将结合态并入原有的构象空间，其自由能等于相应未结合态的自由能加上配体结合能：\mathrm{\Delta }{G}_{\mathrm{b}\mathrm{i}\mathrm{n}\mathrm{d}\mathrm{i}\mathrm{n}\mathrm{g}}\text{=}{k}_{\mathrm{B}}T\mathrm{l}\mathrm{n}\text{(}{k}_{\mathrm{O}\mathrm{N}}\text{[}\mathrm{L}\text{]}\text{/}{k}_{\mathrm{O}\mathrm{F}\mathrm{F}}\text{)}，其中k_{\mathrm{O}\mathrm{N}}和k_{\mathrm{O}\mathrm{F}\mathrm{F}}分别为配体结合速率和分离速率，\text{[}\mathrm{L}\text{]}为配体氟离子的浓度。由于在细胞中配体浓度远远大于核糖开关的浓度，故在本文的模型中，自由配体的浓度近似认为是一不变的数值。每一个可以结合配体的构象到其结合态的速率均是有效结合速率k_{\mathrm{O}\mathrm{F}\mathrm{F}}\text{=}{k}_{\mathrm{O}\mathrm{N}}\text{[}\mathrm{L}\text{]}，反方向转换的速率为k_{\mathrm{O}\mathrm{F}\mathrm{F}}。当结合态之间的转换不涉及适体域结构变化时，其速率可以由（8）、（9）、（10）式求得，当前转录步的折叠结果可由（13）式求得。本文中氟离子结合速率k_{\mathrm{O}\mathrm{N}}设为{\mathrm{10}}^{\mathrm{4}}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}\text{⋅}{\mathrm{s}}^{\text{-}\mathrm{1}}，配体分离速率可以根据实测的k_{\mathrm{d}}值计算得到^[8]。

2　 结 果

2.1　氟离子核糖开关的调控行为

利用转录折叠动力学计算方法，首先预测了转录速率为50 nt/s、无配体情况下，氟离子核糖开关的转录折叠行为。在转录过程中各主要构象的占据比例随着转录步的变化关系和结构分别在图3（a）、3（c）中给出，可知，当第14个核苷酸可以自由的形成结构时，RNA链由一个自由链S0折叠成一个发夹结构S1（\mathrm{\Delta }{G}_{\mathrm{S}\mathrm{1}}\text{=}\text{-}\mathrm{30.77}\mathrm{k}\mathrm{J}\text{/}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}）。在第27步，该发夹结构被更稳定的构象S2所代替（\mathrm{\Delta }{G}_{\mathrm{S}\mathrm{2}}\text{=}\text{-}\mathrm{70.51}\mathrm{k}\mathrm{J}\text{/}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}）。当适体域序列完全被RNA聚合酶释放出来时，RNA从构象S2转换到含有假结的构象S3。构象S3包含螺旋P1，P2和P3，是适体域序列所形成的最稳态（\mathrm{\Delta }{G}_{\mathrm{S}\mathrm{3}}\text{=}\text{-}\mathrm{124.23}\mathrm{k}\mathrm{J}\text{/}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}）。当第63个核苷酸可以形成碱基配对时，新释放的核苷酸序列折叠成发夹T的上部分结构。由于发夹结构形成速率比较快（k_{\mathrm{S}\mathrm{3}\text{→}\mathrm{O}\mathrm{N}}\text{=}\mathrm{9.67}\text{×}{\mathrm{10}}^{\mathrm{3}}{\mathrm{s}}^{\text{-}\mathrm{1}}，k_{\mathrm{O}\mathrm{N}\text{→}\mathrm{S}\mathrm{3}}\text{=}\mathrm{1.31}\text{×}{\mathrm{10}}^{\text{-}\mathrm{2}}{\mathrm{s}}^{\text{-}\mathrm{1}}），构象S3 和ON在一个转录步内就可以达到接近平衡态分布（\mathrm{\Delta }{G}_{\mathrm{O}\mathrm{N}}\text{=}\text{-}\mathrm{159.77}\mathrm{k}\mathrm{J}\text{/}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}）。随着表达单元不断被合成，发夹T的螺旋区域继续延伸。从第66步开始，发夹T开始入侵并破坏螺旋P1。到第71步附近时，螺旋P1完全断开，发夹T完全形成。大约有99.9%的RNAs形成了由螺旋P2和发夹T构成的OFF态。此时，RNA聚合酶正好位于U片段（转录终止区域），与发夹T构成了内源性终止信号^[23]，可以使转录复合体解离，造成转录提前终止。这表明在没有配体时，氟离子核糖开关关闭下游基因的表达，与实验观测到的结果一致^[9]。

实验研究表明^[9]，较高氟离子浓度（10 mmol·L^－1）可以触发氟离子核糖开关发生翻转，诱导下游基因的表达。根据计算结果（图3（b））可知，在第45步以前，氟离子核糖开关的转录折叠行为与无配体时的折叠行为（图3（a））一致。从第45步开始，构象S3通过结合配体形成其结合态结构S3^b。从第62步开始，新释放的核苷酸折叠形成T发夹的上部分螺旋结构。构象S3^b通过形成这个小发夹快速转换成构象ON^b（k_{\mathrm{S}{\mathrm{3}}^{\mathrm{b}}\text{→}\mathrm{O}{\mathrm{N}}^{\mathrm{b}}}\text{=}\mathrm{9.67}\text{×}{\mathrm{10}}^{\mathrm{3}}{\mathrm{s}}^{\text{-}\mathrm{1}}）。这两个结构就是前人提出的两个不同的打开态模型^[7,9]。当RNA聚合酶移动到转录终止区域时，大约有99.7%的RNAs折叠成构象ON^b。这个构象仅包含发夹T的小半部分，不能造成转录终止。这表明，构象S3^b只是转录过程中的中间态结构，而真正执行打开基因表达的生物功能的结构是ON^b，与实验结果一致^[9]。

2.2　转录过程对氟离子核糖开关的影响

对于大多数核糖开关而言，结合配体的适体域结构一般都十分稳定，具有较小的解离速率，是转录过程中的势阱态。前面的结果同样也表明，在有配体时，尽管在转录过程中T发夹同样可以成核，但是并不能入侵和破坏结合配体的适体域结构。然而，配体与适体域的结合是一个动力学过程，受配体浓度和转录速率的影响。

为了研究配体浓度对氟离子核糖开关的转录终止效率的影响，我们预测了氟离子核糖开关在较低氟化物浓度下的转录折叠行为（图4（a））。结果表明，当周围环境中的配体浓度从10 mmol·L^－1（图3（b））减少到0.1 mmol·L^－1（图4（a））时，在第71步ON^b态的占据比例从99.7%下降到32.0%。也就是说，在不同配体浓度下，氟离子核糖开关执行两种完全相反的生物功能，这种现象已经在很多核糖开关系统中得到证实^{[11,12,13,23]}。

然而，同样在0.1 mmol·L^－1氟化物条件下，当转录速率从50 nt/s减少至20 nt/s时，ON^b态的占据比例32.0%（图4（a））上升至61.7%（图4（b））。相应地，下游基因的表达从“OFF”变为“ON”。在0.1 mmol·L^－1配体浓度下，即使考虑配体结合带来自由能的贡献（\mathrm{\Delta }{G}_{\mathrm{b}\mathrm{i}\mathrm{n}\mathrm{d}\mathrm{i}\mathrm{n}\mathrm{g}}\text{=}\text{-}\mathrm{11.47}\mathrm{k}\mathrm{J}\text{/}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}），结合态ON^b仍然没有OFF态稳定（\mathrm{\Delta }{G}_{\mathrm{O}{\mathrm{N}}^{\mathrm{b}}}\text{=}\text{-}\mathrm{171.25}\mathrm{k}\mathrm{J}\text{/}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}，\mathrm{\Delta }{G}_{\mathrm{O}\mathrm{F}\mathrm{F}}\text{=}\text{-}\mathrm{175.10}\mathrm{k}\mathrm{J}\text{/}\mathrm{m}\mathrm{o}\mathrm{l}）。对于这个核糖开关而言，其下游基因的表达并不是取决于功能结构的稳定性，而是由转录折叠动力学决定。较高的转录速率可以提高氟离子核糖开关的转录终止效率；相反，较高的配体浓度可以降低该核糖开关的终止效率。也就是说，在高转录速率的条件下，需要更高浓度的配体来触发氟离子核糖开关发生翻转，与动力学调控的PbuE核糖开关的调控行为极为相似^[11]。

2.3　氟离子核糖开关的调控特性

由于氟离子核糖开关包含一个内源性转录终止子，如果其下游基因要被表达出来，配体与核糖开关的结合必须发生在OFF态形成之前。相对ON态结构而言，OFF态仅包含两个环比较小的发夹结构，形成速度快。因而，在71-nt氟离子核糖开关的复性折叠过程中（如图5所示），大部分RNA分子都是迅速折叠成OFF态，表明了氟离子核糖开关的调控与转录过程密切相关，符合动力学调控特点。

功能结构之间的相互转换是决定核糖开关调控特性的重要因素。由于螺旋P1和发夹T共用碱基，ON态到OFF态的转换主要通过碱基交换来实现：每断开P1的一个碱基对随后就形成发夹T的一个碱基对，直到发夹T完全形成。根据两者之间转换速率（k_{\mathrm{O}\mathrm{N}\text{→}\mathrm{O}\mathrm{F}\mathrm{F}}\text{≈}\mathrm{2.5}\text{×}{\mathrm{10}}^{\mathrm{4}}{\mathrm{s}}^{\text{-}\mathrm{1}}），可以推测即使转录速率高达300 nt/s，几乎所有的RNA仍然可以依次通过构象S3、构象ON态转换形成OFF态。因此，在没有配体时，先形成的构象S3和ON态都不能阻止OFF态的形成。由此可知，整个转录过程中，允许配体结合并能有效地触发核糖开关发生翻转的时间是从S3结构开始形成到RNA聚合酶移动到U片段为止。此时间窗口受转录速度控制，RNA能否在这个时间窗口内结合配体，决定了下游基因能否表达，体现出动力学的调控特性。

3　 结 论

氟离子核糖开关是一类可以调控生物体内氟离子水平的RNA，其下游编码氟化物转运蛋白和相关酶的基因。利用已有的理论方法，本文得到了氟离子核糖开关的功能态结构，并且进一步揭示了氟离子核糖开关在生命体内完整的调控图像和调控特性。计算结果显示，在氟离子核糖开关的转录过程中，当适体域结构形成以后存在两条主要的折叠路径：1）当氟离子浓度较低时，转录终止子的形成破坏了适体域结构，使得转录过程提前终止，基因表达被关闭；2）当氟离子浓度较高时，适体域结构结合配体氟离子形成一个势阱态结构（ON^b），阻止转录终止子的形成，转录和翻译过程可以正常进行。这两条路径正好揭示了氟离子核糖开关在生物体中的解毒机制。即当周围配体较丰富时，氟离子核糖开关倾向于处于基因表达的打开态结构，通过合成氟化物转运蛋白降低体内配体浓度，避免高浓度氟离子中毒。反之，当配体浓度较低时，该核糖开关关闭下游基因的表达，由其他生物过程产生的氟离子会使体内配体浓度上升。

在复性折叠过程中，绝大多数氟离子核糖开关不经过适体域结构，快速折叠成自由能最低的OFF态结构。这表明该核糖开关对基因的调控依赖于转录过程，是属于动力学控制的核糖开关。这一类核糖开关可以根据体内环境，充当某些代谢物水平监视器，使得体内代谢物浓度维持在一个稳定水平，这种作用机制对于细胞维持正常的生命活动至关重要。

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基金资助

国家自然科学基金(31600592)

国家自然科学基金(31270761)

湖北省重点实验室开放基金(201932003)