羟丙基壳聚糖接枝丝素肽的合成及其性能

Synthesis and Properties of Hydroxypropyl Chitosan-Silk Fibroin Peptide

摘要

以转谷氨酰胺酶为催化剂，在水相条件下将丝素肽（SFP）接枝到羟丙基壳聚糖（HPCS）分子链上制备了一系列不同取代度的羟丙基壳聚糖-丝素肽（HPCS-SFP），采用Fourier变换红外光谱(FT-IR)表征其结构，通过单因素实验法分别探究反应温度、反应时间、反应底物质量比对HPCS-SFP取代度的影响，并考察了不同取代度HPCS-SFP的性能。实验结果表明，随着取代度的增加，HPCS-SFP清除DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基和羟基自由基的能力增强，说明丝素肽的引入提高了抗氧化性能；吸湿保湿性能也随着取代度的增加而提高；同时，HPCS-SFP还具有良好的细胞相容性。

Abstract

In this paper, silk fibroin peptide (SFP) was grafted onto hydroxypropyl chitosan (HPCS) molecular chain under the catalysis of transglutaminase in aqueous conditions to obtain a series of hydroxypropyl chitosan-silk fibroin peptide（HPCS-SFP）with different degree of substitution（DS）. The structure of HPCS-SFP was characterized by Fourier transform infrared (FT-IR) spectrometer. The effects of reaction temperature, reaction time and mass ratio on DS of HPCS-SFP were investigated by single-factor experiments. The antioxidant property, moisture absorption property, moisture retention property and biocompatibility were explored. The results show that with the increase of DS, the ability of HPCS-SFP to scavenge DPPH radicals and hydroxyl radicals increases, indicating that the addition of silk fibroin peptides improvs its antioxidant performance. At the same time, it is found that the moisture absorption and retention properties of HPCS-SFP are enhanced with the increase of DS. In addition, HPCS-SFP has good biocompatibility.

Graphical abstract

关键词

羟丙基壳聚糖 / 丝素肽 / 转谷氨酰胺酶 / 抗氧化性

Key words

hydroxypropyl chitosan / silk fibroin peptide / transglutaminase / antioxidant property

0　 引 言

伤口愈合是一个复杂的动态过程，包括4个阶段：止血期、炎症期、增殖期和重塑期，这其中涉及多种生长因子、细胞和细胞外基质的协同作用^[1，2]。活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)可以作为细胞信使，起到激活转录因子、促进细胞增殖、分化和抵御细菌入侵的作用^[3]。在伤口愈合的初期，活性氧自由基能够促进血小板聚集，刺激白细胞穿过血管壁从而杀死伤口部位的细菌。此外，活性氧自由基还能促进成纤维细胞的增殖和迁移，调控转化生长因子-β1（TGF-β1），从而促进纤维连接蛋白的产生和生长因子的表达^[4]。但是，过高浓度的活性氧自由基会损害细胞膜、DNA、蛋白质和脂质，导致细胞凋亡^[5]。通常情况下，人体内的活性氧自由基能够维持在一个平衡状态下，但是一旦机体受损，这种平衡就会被破坏。有研究表明，在伤口愈合过程中，适当地使用具有抗氧化性能的药物可以有效促进伤口的愈合^[6]。

丝素蛋白（silk fibroin）是一种从蚕茧中提取得到的天然高分子纤维蛋白，含有丰富的氨基酸，具有良好的生物相容性、可降解性和力学性能^[7，8],已被广泛应用于组织支架^[9]、药物载体^[10]等生物医药领域。丝素肽（silk fibroin peptide，SFP）是丝素蛋白经水解得到的小分子多肽，具有优异的保湿性能，良好的成膜性能、抗菌性能和抗氧化性能等^[11]。丝素肽分子量较小，且其分子链上含有丰富的氨基、羧基，易于改性。近年来，越来越多的研究着眼于将丝素肽与高分子材料复合提升材料的性能。Min等^[12]利用丝素肽对壳聚糖季铵盐进行改性，发现改性后产物具有良好的抗氧化性和生物相容性。Luo等^[13]利用纳米丝素肽和聚乙烯醇共混制备出SFP/PVA复合膜，发现该复合膜具有良好的热稳定性和较强的力学性能，同时还能促进细胞的增殖。

壳聚糖（chitosan，CS）是一种阳离子多糖，可以由自然界中广泛存在的甲壳素脱乙酰化得到^[14，15]。壳聚糖分子链上含有丰富的氨基和羟基，具有独特的生物相容性、可降解性，无毒，因此广泛应用于生物工程和医药领域^[16~18]。但壳聚糖几乎不溶于水中，这一特性极大地限制了它的应用^[19]。羟丙基壳聚糖（hydroxypropyl chitosan，HPCS）是壳聚糖的衍生物之一，是壳聚糖与环氧丙烷发生醚化反应的产物^[20]，其水溶性较壳聚糖得到极大改善，同时还具有良好的吸湿保湿性、发泡性、抗氧化性、抗菌性等特性^[21，22]。

本文以转谷氨酰胺酶作为催化剂，将丝素肽接枝到羟丙基壳聚糖上，制备羟丙基壳聚糖-丝素肽（HPCS-SFP），采用单因素实验法讨论反应时间、反应温度及反应底物质量比对产物取代度的影响，并探讨了不同取代度的HPCS-SFP的抗氧化性能、吸湿保湿性能以及生物相容性。

1　 实验部分

1.1　材料及仪器

材料：壳聚糖(脱乙酰度92%)购于浙江金壳药业有限公司；丝素肽、转谷氨酰胺酶、透明质酸（HA）、CCK-8试剂盒购于华顺生物科技有限公司；1,2-环氧丙烷、四甲基氢氧化铵、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、1,10-菲啰啉等试剂均购于国药化学试剂有限公司；人皮肤成纤维细胞购于北京北纳创联生物技术研究院；实验用水为去离子水，其他试剂均为分析纯。

仪器：6700型Fourier变换红外光谱仪（FT-IR，Nicolet公司）；UV-5500PC型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）；Thermo Scientific Multiskan FC酶标仪（Thermo公司）等。

1.2　实验方法

1.2.1　HPCS-SFP的制备

HPCS的制备：按文献方法^[20]制备羟丙基壳聚糖。称取10 g壳聚糖加入到20 g 质量分数50%的NaOH溶液中，搅拌均匀，冷却至室温后，于-18 ℃冰箱中放置24 h。将上述碱化后的壳聚糖加入到100 mL异丙醇中，机械搅拌至均匀分散，加入0.8 mL 25%的四甲基氢氧化铵，继续搅拌2 h，最后向其中加入100 mL 1,2-环氧丙烷，于45 ℃条件下反应10 h，抽滤，得到的反应产物重新溶于水中，分装于透析袋（M_w=8 000~14 000）中用水透析3 d，旋转蒸发透析后的溶液，冷冻干燥得到羟丙基壳聚糖。

转谷氨酰胺酶的纯化：将5 g转谷氨酰胺酶溶于300 mL 0.2 mol/L的磷酸缓冲溶液中（pH 6.0），4 000 r/min离心10 min。将上清液分装于透析袋中用去离子水透析3 d，透析后的溶液经旋转蒸发、冷冻干燥后得到纯化后的转谷氨酰胺酶，于4 ℃保存。

HPCS-SFP的制备：分别将1 g羟丙基壳聚糖和SFP溶于100 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲溶液（pH 6.0）中，将两溶液倒入烧瓶中，搅拌均匀，然后向其中加入0.2 g纯化后的转谷氨酰胺酶，将烧瓶置于油浴锅中，持续搅拌，在一定温度下反应一段时间。反应结束后，将油浴锅温度升至100 °C，使转谷氨酰胺酶失活，10 min后停止加热，待冷却至室温，抽滤，在水中透析3 d，透析后的溶液经旋转蒸发、冷冻干燥后得到HPCS-SFP。采用单因素实验法，即控制反应温度（30、40、50、60、70 ℃）、反应时间（1、2、3、4、5 h）、反应底物质量比（m_SFP：m_HPCS=0.6、0.8、1.0、1.2、1.4）3个变量，得到不同取代度的HPCS-SFP。

1.2.2　样品表征

采用Fourier变换红外光谱仪（FT-IR）对产物进行表征。分别将CS、HPCS、HPCS-SFP烘干后研磨成粉末，采用KBr压片法分别在4 000~400 cm^-1波长范围内扫描红外光谱。

1.2.3　HPCS-SFP取代度的测定

使用紫外分光光度法测定HPCS-SFP的取代度。首先，绘制SFP溶液的标准曲线：精确配制浓度分别为0.001、0.005、0.010、0.015、0.020 g/L的SFP溶液，于190 nm波长处测其吸光度，绘制标准曲线，拟合出的标准曲线方程见（1）式：

A=\mathrm{35.311}c+\mathrm{0.072}\mathrm{14}（R^{\mathrm{2}}=\mathrm{0.998}\mathrm{6}）（1）

将不同取代度的HPCS-SFP分别溶于水中配制成浓度（c）为0.020 g/L的溶液，于190 nm波长处测量吸光度A，根据（2）式计算HPCS-SFP的取代度DS：

\mathrm{D}\mathrm{S}=\frac{\mathrm{237}c}{\mathrm{13.68}-\mathrm{863}c}（2）

1.2.4　HPCS-SFP的抗氧化性能检测

HPCS-SFP的抗氧化性能用DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率来表示。分别将羟丙基壳聚糖、3种不同取代度的HPCS-SFP和SFP配制成一系列浓度（0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L）的待测溶液，测试其抗氧化性能。将3种不同取代度的HPCS-SFP（DS=0.228、0.377和0.569）分别记作HPCS-SFP1、HPCS-SFP2、HPCS-SFP3。

1.2.4.1 清除DPPH自由基能力测定

按文献方法测试HPCS-SFP清除DPPH自由基的能力^[23]。首先，将DPPH溶于乙醇中配制成浓度为0.1 mmol/L 的溶液。取2.0 mL待测溶液和2.0 mL DPPH溶液混合均匀，室温下避光反应30 min，于517 nm波长处测量混合液的吸光度A。对照组为2.0 mL蒸馏水与2.0 mL DPPH的混合液，其吸光度记为A_C。空白组为2.0 mL待测样品与2.0 mL乙醇的混合液，其吸光度记为A_B。根据（3）式计算样品的DPPH自由基清除率（DPPH radical scavenging rate，DRSR）：

\mathrm{D}\mathrm{R}\mathrm{S}\mathrm{R}=\frac{A_{\mathrm{C}}-A+A_{\mathrm{B}}}{A_{\mathrm{B}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（3）

1.2.4.2 清除羟基自由基能力测定

按文献方法测试HPCS-SFP清除羟基自由基的能力^[24]。配制浓度为1.5 mmol/L的1,10-菲啰啉溶液和硫酸铁溶液。取1.0 mL待测样品和1.0 mL 1,10-菲啰啉溶液混合均匀，加入1.0 mL 0.03%（V/V）的过氧化氢溶液，于37 ℃反应1 h。由于Fe²⁺与1,10-菲啰啉形成的络合物在536 nm波长处有最大吸收，故可测试反应后溶液在536 nm处的吸光度，记为A_t。对照组为用1.0 mL水替代待测样品，其吸光度记为A_n。空白组用1.0 mL水替代过氧化氢，其吸光度记为A_b。根据（4）式计算样品的羟基自由基清除率（hydroxyl radical scavenging rate，HRSR）：

\mathrm{H}\mathrm{R}\mathrm{S}\mathrm{R}=\frac{A_t-A_{\mathrm{n}}}{A_{\mathrm{b}}-A_{\mathrm{n}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（4）

1.2.5　吸湿性能检测

将壳聚糖、羟丙基壳聚糖、HPCS-SFP1、HPCS-SFP2、HPCS-SFP3、HA在恒温烘箱中干燥至恒重，研磨成粉末。准确称取0.500 0 g上述待测样品各两份，分别放入放置了饱和碳酸钠溶液（相对湿度RH=43%）和饱和硫酸铵溶液（RH=81%）的干燥器中，然后将干燥器置于25 ℃烘箱中。放置48 h后，取出干燥器，再次称量样品质量，根据放置前后质量（分别记作m_t 、m₀）按照（5）式计算样品的吸湿率（R_a）：

R_{\mathrm{a}}=\frac{m_t-m_{\mathrm{0}}}{m_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（5）

1.2.6　保湿性能检测

准确称取0.500 0 g 壳聚糖、羟丙基壳聚糖、HPCS-SFP1、HPCS-SFP2、HPCS-SFP3、HA放入称量瓶中，然后向各称量瓶中加入一定量水，最后将各称量瓶放入装有硅胶的干燥器中。放置48 h后，将称量瓶取出称重。根据（6）式计算样品的保湿率（R_h）：

R_{\mathrm{h}}=\frac{m_t-m_{\mathrm{0}}}{m-m_{\mathrm{0}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（6）

式中，m₀为空称量瓶质量，m为加入待测样品和水后称量瓶的质量，m_t 为放置48 h后称量瓶的质量。

1.2.7　HPCS-SFP体外细胞实验

分别将HPCS、HPCS-SFP1、HPCS-SFP2和HPCS-SFP3溶于水中，配制成一系列浓度（10、50、100、500、1 000 mg/L）的样品溶液，灭菌后备用。

将传至第三代的人皮肤成纤维细胞接种到96孔板中，置于CO₂培养箱中培养，使细胞贴壁生长，24 h后，向各孔中加入10 µL样品溶液，继续放入CO₂培养箱中培养24 h。然后，将各孔中的细胞培养液吸出，换入新鲜的细胞培养液，随后加入10 µL的CCK-8试剂。实验对照组用水代替样品溶液，空白组只加培养基。2 h后，用酶标仪测试各孔溶液的光密度，实验组记为OD₁，对照组记为OD₂，空白组记为OD₃。按照（7）式计算细胞存活率（cell viability，CV）。

\mathrm{C}\mathrm{V}=\frac{\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{1}}-\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{3}}}{\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{2}}-\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{\mathrm{3}}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（7）

2　 结果与讨论

2.1　FT-IR谱图分析

图1为壳聚糖、羟丙基壳聚糖、和HPCS-SFP的FT-IR谱图。壳聚糖的谱图中，3 419 cm^-1附近的强吸收峰为O—H的伸缩振动吸收峰，2 926 cm^-1处为亚甲基的反对称伸缩振动吸收峰，2 864 cm^-1为C—H的伸缩振动吸收峰，1 659 cm^-1处吸收峰归属于C=O的特征峰，此峰出现是因为CS分子链上还残留一定的乙酰基，1 597 cm^-1为N—H弯曲振动的特征峰，1 088 cm^-1和1 026 cm^-1为C—O的伸缩振动吸收峰^[25]。羟丙基壳聚糖的谱图出现了2 973 cm^-1和1 378 cm^-1两个新的特征峰分别是甲基的C—H伸缩振动和弯曲振动吸收峰，证明成功引入了—CH₃^[26]。此外，相比于壳聚糖的谱图，羟丙基壳聚糖谱图中1 159 cm^-1和1 026 cm^-1处的特征峰消失（这两个峰分别为仲醇和伯醇中O—H的弯曲振动峰），且在1 597 cm^-1处的N—H弯曲振动峰未减弱，说明羟丙基化反应主要发生在C3和C6位上^[22]。HPCS-SFP的红外光谱出现了1 652 cm^-1和1 553 cm^-1两个新的特征峰，分属于酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带吸收峰^[27]，证明SFP被接枝到了羟丙基壳聚糖上。

2.2　HPCS-SFP取代度的影响因素

2.2.1　反应温度

在探究温度对取代度影响时，设置反应时间为2 h，m_SFP∶m_HPCS=1.2。图2反映了反应温度不同时HPCS-SFP的取代度，可以看出，当温度从30 ℃上升至40 ℃时，取代度从0.228增加至0.377，但随着温度继续升高，取代度逐渐降低，70 ℃时，取代度降为0.098。HPCS-SFP取代度出现这样的变化趋势可能与催化剂的活性有关。转谷氨酰胺酶作为催化剂，活性越高，其能催化的反应底物的量越多，反应速率也越快。由于酶的活性会受到温度影响：当温度达到最适温度时，其活性最强；当温度小于最适温度时，活性随温度升高而增强；当温度大于最适温度时，酶的活性随温度升高反而会减弱，温度升高到一定限度时，甚至会导致酶失活变性。因此，HPCS-SFP的取代度随温度升高出现了先上升后下降的趋势。

2.2.2　反应时间

在探究反应时间对HPCS-SFP取代度影响时，设置反应温度为40 ℃，m_SFP∶m_HPCS=1.2。图3比较了反应时间不同时HPCS-SFP的取代度，反应时间从1 h 延长至2 h时，HPCS-SFP的取代度会从0.305增加至0.377，但是当反应时间继续延长时，HPCS-SFP取代度会逐渐减小。推测其原因是：在反应刚开始的阶段，反应物逐渐向转谷氨酰胺酶的活性中心扩散，故随着反应时间的延长，酶的活性中心上结合的反应物增多，HPCS-SFP的取代度增加；但是当反应进行到一定时间时，反应物与酶活性中心的结合达到饱和，此时随着反应时间的继续增加，产物的水解和副反应的发生可能阻碍反应的进行，导致了HPCS-SFP的取代度降低。

2.2.3　反应底物质量比

在探究反应底物质量比对取代度影响时，设置反应温度为40 ℃，反应时间为2 h。图4比较了反应底物质量比不同时HPCS-SFP的取代度，可以看出，当m_SFP∶m_HPCS从0.8增加至1.2时，HPCS-SFP的取代度从0.207增加至0.377；当m_SFP∶m_HPCS从1.2增加至1.6时，HPCS-SFP的取代度从0.377下降至0.266。其原因可能是：当SFP浓度相对较低时，发生的主要反应是SFP与羟丙基壳聚糖反应，故此阶段随着SFP浓度的增加，HPCS-SFP的取代度也随之增加；但由于转谷氨酰胺酶也能催化赖氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-羟酰胺发生酰基转移反应，使蛋白质或多肽分子间和分子内发生共价交联^[28，29]，故当SFP浓度较大时，发生的主反应为SFP的自聚反应。

2.3　HPCS-SFP的抗氧化性能

2.3.1　清除DPPH自由基能力

DPPH是一种稳定的自由基，具有一个单电子，在517 nm处有强吸收，当有自由基清除剂存在时，它能够迅速捕获一个电子，与其配对，其在517 nm处的吸收会减弱^[30]。因此，DPPH自由基清除率是评价材料抗氧化性能的常用指标之一。图5为不同浓度HPCS、HPCS-SFP1、HPCS-SFP2、HPCS-SFP3和SFP的DPPH自由基清除率。从图5中可以看出，5组待测样品清除DPPH自由基的能力均随着浓度的增加而增强，其中SFP的清除能力最强，浓度为2.0 g/L时DPPH自由基清除率达到43.9%；羟丙基壳聚糖清除DPPH自由基的能力最弱，浓度为2.0 g/L时清除率为9.6%；随着具有良好抗氧化性的SFP的接入，相较于羟丙基壳聚糖，HPCS-SFP清除DPPH自由基的能力均有所增强，且其清除DPPH自由基的能力随取代度的增加而增强。浓度为0.1 g/L时，HPCS-SFP1对DPPH的清除率为3.5%，而HPCS-SFP3对DPPH自由基的清除率增加了1.22倍，达到7.6%。另一方面，随着浓度的增加，清除DPPH自由基的能力也明显增强：浓度为0.1 g/L 的HPCS-SFP2对DPPH自由基清除率为5.8%，当浓度为2.0 g/L 时，DPPH自由基清除率增加了3.83倍，达到28.2%。

2.3.2　清除羟基自由基能力

羟基自由基是一种活性极强的活性氧自由基，过量的羟基自由基会破坏细胞膜结构和DNA的分子结构，对人体造成极大的危害^[31]。所以，在评价材料抗氧化性能时，常常会考察其对羟基自由基的清除能力。图6显示了不同浓度HPCS、HPCS-SFP1、HPCS-SFP2、HPCS-SFP3和SFP对羟基自由基的清除能力。由图6可知，5组待测样品清除羟基自由基的能力均随着浓度的增加而增强，其中SFP的清除能力最强，浓度为2.0 g/L时羟基自由基清除率达到62.5%；羟丙基壳聚糖清除羟基自由基的能力最弱，浓度为2.0 g/L时清除率为37.8%；HPCS-SFP随着取代度的增加，其清除羟基自由基的能力均有所增加，其羟基自由基清除能力介于羟丙基壳聚糖和SFP之间，这表明HPCS-SFP羟基自由基清除能力与SFP含量有关。SFP富含多种氨基酸，其独特的氨基酸排列结构使其具有优良的抗氧化性能^[32]，故SFP含量越高，样品羟基自由基清除率越高。

2.4　HPCS-SFP的吸湿性能

HA具有良好的吸湿保湿性，被广泛应用于化妆品中，将其作为对照组，比较其与待测样品的吸湿率大小。图7比较了CS、HPCS、HPCS-SFP1、HPCS-SFP2、HPCS-SFP3和HA的吸湿性能。由图7可知，当相对湿度为43%时，各样品的吸湿率均较低，均低于16.0%；当相对湿度增加为81%时，上述各样品的吸湿率均明显增大，CS的吸湿率最小，但也达到了19.4%。两种湿度条件下吸湿能力强弱顺序一致，从大到小依次为HA、HPCS-SFP3、HPCS-SFP2、HPCS-SFP1、HPCS、CS。羟丙基壳聚糖是壳聚糖的一种重要的衍生物，其结晶度较低，更易与水分子结合，故羟丙基壳聚糖的吸湿性能要优于壳聚糖。SFP中含有人体所必需的的8种氨基酸，分子中有许多亲水性基团，因此SFP具有良好的吸湿性能。所以，随着取代度的增加，HPCS-SFP的吸湿性能呈出现上升的趋势，且逐渐接近于HA。

2.5　HPCS-SFP的保湿性能

图8比较了CS、HPCS、HPCS-SFP1、HPCS-SFP2、HPCS-SFP3和HA的保湿性能。从图8可以看出，几种样品的保湿率从高到低依次为HA、HPCS-SFP3、HPCS-SFP2、HPCS-SFP1、HPCS、CS，趋势与吸湿率相同。HPCS的保湿率大于CS是因为HPCS中的氨基和羟基充分暴露，与水分子之间形成了大量的氢键，氢键相互作用使水分子不易流失。SFP的肽链上有大量的氨基、羧基等亲水性基团，能与水分子结合，更好地锁住水分，所以，随着取代度的增加，HPCS-SFP的保湿率随之增加，当取代度从0.228增加至0.377时，保湿率从51.5%提高至77.1%，表明小分子SFP接枝到羟丙基壳聚糖的分子链上能有效地改善保湿性能。湿态伤口愈合理论提出在伤口处保持湿润的愈合环境能够有效促进伤口的愈合^[33]。因此，良好的吸湿保湿性能使HPCS-SFP有望用于促进伤口愈合。

2.6　HPCS-SFP的体外细胞相容性

成纤维细胞在伤口愈合的过程中起着非常重要的作用，它能够分泌胶原纤维和细胞外基质成分、促进肉芽组织形成，进而填补创面组织^[34]。本实验选取人皮肤成纤维细胞为研究对象，考察HPCS、HPCS-SFP1、HPCS-SFP2、HPCS-SFP3的生物相容性。图9比较了不同浓度HPCS、HPCS-SFP1、HPCS-SFP2和HPCS-SFP3对人皮肤成纤维细胞生长的影响。如图9所示，加入不同浓度的各样品后，细胞存活率均在80.0%以上，说明所有材料均具有良好的细胞相容性。在HPCS-SFP浓度较低（10、50 mg/L）时，细胞存活率会随着取代度的增加而增大，浓度为50 mg/L时，HPCS-SFP3组的细胞存活率最大，达到107.3%，表明一定浓度的HPCS-SFP能够促进人皮肤成纤维细胞的增殖。这可能是由于SFP的氨基酸结构能够促进细胞的粘附与增殖^[35]。但当浓度继续增加时，细胞存活率会随取代度增加呈现先增大后减小的趋势。这可能是由于细胞存活率下降与高浓度的HPCS-SFP引起了细胞渗透压的变化所致。

3　 结 语

本文以转谷氨酰胺酶作为催化剂，将丝素肽接枝到羟丙基壳聚糖分子链上，制备了一系列不同取代度的HPCS-SFP。通过单因素实验法，探究了反应温度、反应时间及反应底物质量比对HPCS-SFP取代度的影响。实验结果表明温度为40 °C，丝素肽与羟丙基壳聚糖质量比为1.2，反应时间为2 h时，HPCS-SFP取代度最高（0.377）。选取了3种不同取代度的HPCS-SFP（0.228、0.305、0.377）进行了一系列性能测试。结果表明，随着取代度的增加，HPCS-SFP对DPPH自由基和羟基自由基的清除率均会增加，证明丝素肽的加入提高了HPCS-SFP的抗氧化性；HPCS-SFP的吸湿保湿性能也会随着取代度的增加得到改善； HPCS-SFP还具有良好的细胞相容性，在一定浓度下能促进人皮肤成纤维细胞的增殖。综上所述，HPCS-SFP在促进伤口愈合方面有较大应用潜力。

参考文献

[1] SHAH S A, SOHAIL M, KHAN S, et al. Biopolymer-based biomaterials for accelerated diabetic wound healing: A critical review [J]. International Journal of Biological Macromolecules,2019,139:975-993. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2019.08.007 .

[2] CLARK R A F, GHOSH K, TONNESEN M G. Tissue engineering for cutaneous wounds [J]. Journal of Investigative Dermatology,2007,127(5):1018-1029. DOI:10.1038/sj.jid.5700715 .

[3] SNTAR I, AKKOL E K, NAHAR L, et al. Wound healing and antioxidant properties: Do they coexist in plants [J]. Free Radicals and Antioxidants,2012,2(2):1-7. DOI:10.5530/ax.2012.2.2.1 .

[4] HOFFMANN M H, GRIFFITHS H R. The dual role of reactive oxygen species in autoimmune and inflammatory diseases: Evidence from preclinical models [J]. Free Radical Biology and Medicine,2018,125:62-71. DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2018.03.016 .

[5] DENG Z, SHI F, ZHOU Z, et al. M1 macrophage mediated increased reactive oxygen species (ROS) influence wound healing via the MAPK signaling in vitro and in vivo [J]. Toxicology and Applied Pharmacology,2019,366:83-95. DOI:10.1016/j.taap.2019.01.022 .

[6] GHUMAN S, NCUBE B, FINNIE J F, et al. Antioxidant, anti-inflammatory and wound healing properties of medicinal plant extracts used to treat wounds and dermatological disorders [J]. South African Journal of Botany,2019,126:232-240. DOI:10.1016/j.sajb.2019.07.013 .

[7] KUNDU B, RAJKHOWA R, KUNDU S C, et al. Silk fibroin biomaterials for tissue regenerations [J]. Advanced Drug Delivery Reviews,2013,65(4):457-470. DOI:10.1016/j.addr.2012.09.043 .

[8] VEPARI C, KAPLAN D L. Silk as a biomaterial [J]. Progress in Polymer Science,2007,32(8):991-1007. DOI:10.1016/j.progpolymsci.2007.05.013 .

[9] MELKE J, MIDHA S, GHOSH S, et al. Silk fibroin as biomaterial for bone tissue engineering [J]. Acta Biomaterialia,2016,31:1-16. DOI:10.1016/j.actbio.2015.09.005 .

[10] MOTTAGHITALAB F, FAROKHI M, SHOKRGOZAR M A, et al. Silk fibroin nanoparticle as a novel drug delivery system [J]. Journal of Controlled Release,2015,206:161-176. DOI:10.1016/j.jconrel.2015.03.020 .

[11] 张媚.丝素肽的制备及其对细胞的作用研究[D].重庆：重庆理工大学,2019.

[12] ZHANG M. Preparation of Silk Fibroin Peptide and Its Effect on Cells [D]. Chongqing: Chongqing University of Technology,2019(Ch).

[13] MIN L, LIU M, LIU L L, et al. Enzymatic synthesis of quaternary ammonium chitosan-silk fibroin peptide copolymer and its characterization [J]. International Journal of Biological Macromolecules,2018,109:1125-1131. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2017.11.108 .

[14] LUO Q, CHEN Z M, HAO X F, et al. Preparation and properties of nanometer silk fibroin peptide/polyvinyl alcohol blend films for cell growth [J]. International Journal of Biological Macromolecules,2013,61:135-141. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2013.06.050 .

[15] KHAN F, PHAM D T N, OLOKETUYI S F, et al. Chitosan and their derivatives: Antibiofilm drugs against pathogenic bacteria [J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces,2020,185:110627. DOI:10.1016/j.colsurfb.2019.110627 .

[16] RINAUDO M. Chitin and chitosan: Properties and applications [J]. Progress in Polymer Science,2006,31(7):603-632. DOI:10.1016/j.progpolymsci.2006.06.001 .

[17] BAKSHI P S, SELVAKUMAR D, KADIRVELU K, et al. Chitosan as an environment friendly biomaterial—A review on recent modifications and applications [J]. International Journal of Biological Macromolecules,2020,150:1072-1083. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2019.10.113 .

[18] BHATTARAI N, GUNN J, ZHANG M Q. Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery [J]. Advanced Drug Delivery Reviews,2010,62(1):83-99. DOI:10.1016/j.addr.2009.07.019 .

[19] DASH M, CHIELLINI F, OTTENBRITE R M, et al. Chitosan—A versatile semi-synthetic polymer in biomedical applications [J]. Progress in Polymer Science,2011,36(8):981-1014. DOI:10.1016/j.progpolymsci.2011.02.001 .

[20] LI J J, SHI Q F, WU X Y, et al. In vitro and in vivo evaluation of 3D biodegradable thermo/pH sensitive sol-gel reversible hydroxybutyl chitosan hydrogel [J]. Materials Science and Engineering: C,2019,108:110419. DOI:10.1016/j.msec.2019.110419 .

[21] PENG Y F, HAN B Q, LIU W S, et al. Preparation and antimicrobial activity of hydroxypropyl chitosan [J]. Carbohydrate Research,2005,340(11):1846-1851. DOI:10.1016/j.carres.2005.05.009 .

[22] CHENG Z H, HUANG J, HU S, et al. Effects of hydroxypropyl degree on physiochemical activities of chitosan from squid pens [J]. International Journal of Biological Macromolecules,2014,65:246-251. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2014.01.048 .

[23] SHAO K, HAN B Q, DONG W, et al. Pharmacokinetics and biodegradation performance of a hydroxypropyl chitosan derivative [J]. Journal of Ocean University of China,2015,14(5):888-896. DOI:10.1007/s11802-015-2600-6 .

[24] ZHANG S H, HOU J Y, YUAN Q J, et al. Arginine derivatives assist dopamine-hyaluronic acid hybrid hydrogels to have enhanced antioxidant activity for wound healing [J]. Chemical Engineering Journal,2019:123775.DOI:10.1016/j.cej.2019.123775 .

[25] LI Z R, WANG B, ZHANG Q H, et al. Preparation and antioxidant property of extract and semipurified fractions of Caulerpa racemosa [J]. Journal of Applied Phycology,2012,24(6):1527-1536. DOI:10.1007/s10811-012-9813-5 .

[26] GE H, WANG S K. Thermal preparation of chitosan-acrylic acid superabsorbent: Optimization, characteristic and water absorbency [J]. Carbohydrate Polymers,2014,113:296-303. DOI:10.1016/j.carbpol.2014.06.078 .

[27] PRABAHARAN M, MANO J F. Hydroxypropyl chitosan bearing β-cyclodextrin cavities: Synthesis and slow release of its inclusion complex with a model hydrophobic drug [J]. Macromolecular Bioscience,2005,5(10):965-973. DOI:10.1002/mabi.200500087 .

[28] FAN L H, WU H, ZHOU X Q, et al. Transglutaminase-catalyzed grafting collagen on chitosan and its characterization [J]. Carbohydrate Polymers,2014,105:253-259. DOI:10.1016/j.carbpol.2014.01.065 .

[29] WILHELMUS M M M, JONGENELEN C A, BOL J G J M, et al. Interaction between tissue transglutaminase and amyloid-beta: Protein-protein binding versus enzymatic crosslinking [J]. Analytical Biochemistry,2020, 592:113578. DOI:10.1016/j.ab.2020.113578 .

[30] 钱镭,任德财,刘婷,等.海藻酸钠固定化转谷氨酰胺酶催化大豆蛋白聚合的研究[J].食品工业,2014(4):113-117.

[31] QIAN L, REN D C, LIU T, et al. Polymerization of soybean proteins by sodium alginate immobilized tranglutaminase [J]. The Food Industry,2014(4):113-117 (Ch).

[32] SUN X Q, ZHANG J J, MI Y Q, et al. Synthesis, characterization, and the antioxidant activity of the acetylated chitosan derivatives containing sulfonium salts [J].International Journal of Biological Macromolecules,2020,152:349-358.DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2020.02.177 .

[33] YU M E, CHEN M J, GUI J L, et al.Preparation of Chlorella vulgaris polysaccharides and their antioxidant activity in vitro and in vivo [J].International Journal of Biological Macromolecules,2019,137:139-150. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2019.06.222 .

[34] NAN X Y, SUN L L, SONG X M, et al. Antioxidant activity of silk peptide and co-initiation behavior in free radical photopolymerization of acrylamide [J]. Fibers and Polymers,2019,20(8):1555-1563. DOI:10.1007/s12221-019-9079-5 .

[35] BAGHER Z, EHTERAMI A, SAFDEL M H, et al. Wound healing with alginate/chitosan hydrogel containing hesperidin in rat model [J]. Journal of Drug Delivery Science and Technology,2020,55:101379. DOI:10.1016/j.jddst.2019.101379 .

[36] DRISKELL R R, WATT F M. Understanding fibroblast heterogeneity in the skin [J].Trends in Cell Biology,2015,25(2):92-99. DOI:10.1016/j.tcb.2014.10.001 .

[37] CHOUHAN D, MANDAL B B. Silk biomaterials in wound healing and skin regeneration therapeutics: From bench to bedside [J]. Acta Biomaterialia,2020,103:24-51. DOI:10.1016/j.actbio.2019.11.050 .

基金资助

国家自然科学基金(51773161)