小粒径、高稳定性多隔室及单室脂质体的制备工艺

Preparation Technology of Multilamellar and Unilamellar Vesicles with Small Particle Size and High Stability

摘要

小粒径、高稳定性脂质体的获得一直是脂质体制备技术领域的一项挑战。本文以脂质体粒径为控制对象，利用单因素实验对影响粒径的工艺条件进行优化，采用改良薄膜分散法制备了粒径约110 nm的多隔室脂质体，并通过上调水合温度至55 ℃，实现了多隔室脂质体向单室脂质体的转变。利用动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）技术检测了多隔室和单室脂质体的分散性和形态学特征。该制备工艺简单，可同时实现多隔室脂质体和单室脂质体的制备，制得的多隔室和单室脂质体粒径均一、表面光滑、分散性良好，且具有良好的储存稳定性。

Abstract

The preparation of vesicles with small size and high stability has always been a challenge in the field of liposome preparation technology. Taking particle size as control object, the process conditions affecting the particle size were optimized by single factor experiment, and the multilamellar vesicles with particle size of ~110 nm were successfully prepared by improved thin film dispersion method. On this foundation, the transformation from multilamellar vesicles to unilamellar vesicles was realized only by increasing the hydration temperature to 55 ℃. The morphological characteristics of multilamellar vesicles and unilamellar vesicles were examined by dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscope (TEM) technology. The preparation process in this paper is simple, and the multilamellar vesicles and unilamellar vesicles can be obtained simultaneously. The results show that the multilamellar vesicles and unilamellar vesicles have the characteristics of uniform particle size, smooth surface, good dispersion and excellent storage stability.

Graphical abstract

关键词

脂质体 / 粒径 / 制备工艺 / 水合温度

Key words

vesicles / particle size / preparation technology / hydration temperature

0　 引 言

脂质体是由大豆卵磷脂和胆固醇等两亲性分子组成的双分子层脂质囊泡^［1］，其粒径从10 nm到2 μm不等。根据结构的不同，脂质体可以分为以下3类^［2］：粒径10~100 nm的单层脂质体称为小单室脂质体（small unilamellar vesicles，SUVs）；粒径100 nm~1 μm的单层脂质体称为大单室脂质体（large unilamellar vesicles，LUVs）；粒径1~5 μm的多层囊泡称为多隔室脂质体（multilamellar lipid vesicles，MLVs）。其中，小粒径的多隔室脂质体比较少见。脂质体的粒径是决定其稳定性和生物体内应用的关键参数^［3~5］。多隔室脂质体由几个脂质同心圆囊泡叠加而成，由于脂质层数较多，脂质层间隙脂溶性药物的包封率高，但层与层之间距离较小容易发生膜融合从而使脂质体粒径变大且不稳定^［6］。粒径过大的单室脂质体存在稳定性差、粒径大小不均等问题。通常，脂质体的粒径越小，脂质体越稳定，粒径100 nm左右的脂质体由于在肿瘤部位具有较好的EPR效应（enhanced permeability and retention effect）而受到极大青睐^［7］。另外，脂质体粒径的大小还直接影响载体是否能够顺利进入组织和细胞发挥作用^［8］。

影响脂质体粒径的因素包括制备脂质体时所用的磷脂种类、磷脂与胆固醇的质量比以及磷脂的相变温度（T_c）等。相变温度是影响脂质体形态的很重要的因素之一^［9］：当温度低于磷脂相变温度时，脂质体中磷脂之间的排列较为紧凑，脂质体状态稳定；当环境温度高于磷脂相变温度时，磷脂排列松散，脂质体内部及脂质体之间的流动性增大。除此之外，对脂质体进行机械挤压、离心或过凝胶色谱柱等物理方法也可以较好控制脂质体粒径大小。

本论文对脂质体制备过程中影响粒径的工艺参数进行了筛选和优化，得到粒径约110 nm的多隔室脂质体和单室脂质体的最佳制备工艺，并对脂质体的外观和稳定性进行了考察。

1　 实验部分

1.1　试剂和仪器

试剂：胆固醇购自西安化学试剂厂；大豆卵磷脂为市售食品级，购自上海金穗生物科技有限公司；维生素C购自天津巴斯夫化工有限公司；三氯甲烷、无水乙醇、乙醚均为市售分析纯试剂；实验室用水购自中国娃哈哈集团有限公司；玻璃珠购自南京奥多福尼生物有限公司。

仪器：JEM-2100（UHR）型高分辨透射电子显微镜（JEOL公司），JEM 1200EX型透射电子显微镜（JEOL公司），Nano-ZS ZEN3600型粒径电位仪（Malvern Instrument），TGL离心机-16G（上海安亭科学仪器厂），SZ-93型自动双显纯化水蒸馏器（上海精密科学仪器有限公司），RE-52型旋转蒸发仪（郑州凯鹏实验仪器有限公司）。

1.2　脂质体的制备方法

本实验脂质体的制备是在传统薄膜分散法^［10］的基础上进行工艺改进，以粒径为考察对象，引入水合温度变量和超声整粒步骤。称取适量大豆卵磷脂、胆固醇和维生素C于500 mL圆底烧瓶中，加入适量三氯甲烷溶解，再加入0.1 mm玻璃珠于旋转蒸发仪上旋蒸至溶剂挥发完毕。此时圆底烧瓶壁上形成一层均匀薄膜。将圆底烧瓶置于真空干燥箱中干燥过夜。取出圆底烧瓶后，加入0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4）适量进行水合，控制水合温度，氮气环境下涡旋2 h，置于超声仪中超声处理30 min。离心，取上清液，用0.22 μm滤膜过滤，于4 ℃冷藏、备用。

1.3　制备工艺优化

利用单因素方法对卵磷脂与胆固醇的配比、水合时PBS的加入量、离心转速以及水合温度等制备工艺进行优化。这些工艺条件对脂质体的粒径和稳定性具有较大影响。

1.3.1　卵磷脂与胆固醇的质量比

设置4组不同的卵磷脂与胆固醇的质量比8∶1、10∶1、12∶1、14∶1，控制卵磷脂和胆固醇总质量为0.11 g。将上述4组卵磷脂和胆固醇分别与0.001 g维生素C置于500 mL圆底烧瓶中，加入2.5 mL三氯甲烷完全溶解，加入直径为0.1 mm的玻璃珠，置于旋转蒸发仪上旋蒸至溶剂挥发完全，放入真空干燥箱中干燥过夜。取出，再加入70 mL磷酸盐缓冲液35 ℃进行水合，室温涡旋2 h，超声30 min，然后以15 000 r/min转速离心30 min，取上清液过0.22 μm滤膜。测脂质体粒径，考察卵磷脂与胆固醇质量比对脂质体粒径的影响。

1.3.2　水合时PBS用量

PBS的用量决定着最后脂质体悬液的浓度。本实验将PBS用量分别设为60、70、80、90 mL，其他条件不变，对不同PBS用量制得的脂质体进行粒径检测，考察其对脂质体粒径的影响。

1.3.3　离心转速

离心可以去除粒径过大的脂质体，使脂质体粒径更为均一，因此离心转速对脂质体粒径具有重要影响。本实验设置4组离心转速10 000、12 500、15 000、20 000 r/min，考察转速对脂质体粒径和分散状态的影响。

1.3.4　水合温度

在脂质体制备过程中引入温度控制变量，将水合时的温度分别控制在35、45、55、65 ℃，其他条件不变，考察水合温度对于脂质体粒径和分散状态的影响。

1.3.5　重现性实验

综合以上的工艺优化方案，在最佳工艺条件下，制备3批脂质体，采用动态光散射法（DLS）测定3组脂质体的粒径，考察制备工艺的重现性。

1.4　脂质体粒径、分散性的测定

室温条件下，取适量脂质体悬液，用PBS稀释至适当浓度。将稀释后的1 mL脂质体溶液置于样品皿中，放入激光粒度分析仪样品池中，测其粒径和多分散性指数（PDI）值，每个样品测定3次。

1.5　脂质体形态观察

用移液枪吸取10 μL稀释后的脂质体悬液滴于铜网上，静置15 min，自然晾干，于透射电子显微镜下观察脂质体的形态。

1.6　脂质体储存稳定性考察

将脂质体悬液置于4 ℃环境，间隔一定时间观察脂质体颜色变化以及是否有沉淀产生，并分别于1、6、30、60 d测其粒径和PDI值，考察脂质体的储存稳定性。

2　 实验结果

2.1　脂质体制备的工艺优化

2.1.1　卵磷脂与胆固醇质量比

不同质量比卵磷脂与胆固醇制得的脂质体粒径、PDI值汇总结果如表1所示。从表1中可以看出，随着卵磷脂与胆固醇的质量比从8∶1增加到12∶1，脂质体粒径逐渐减小，12∶1时粒径最小（约137 nm），此时PDI=0.212，分散性良好；但随着比例继续增加至14∶1，脂质体粒径增加到约147 nm，此时PDI=0.267，脂质体的分散性变差。后续实验将卵磷脂与胆固醇的质量比设定为12∶1。

2.1.2　PBS用量

将卵磷脂与胆固醇质量比固定为12∶1，改变水合时PBS用量，得到的脂质体粒径和PDI的结果如表2所示。从表2中可以看出，当PBS用量为80 mL时，得到的脂质体的粒径约为121 nm， PDI为0.198，粒径较小，分散性良好。后续实验将PBS用量设定为80 mL。

2.1.3　离心转速

将卵磷脂与胆固醇质量比固定为12∶1，水合时PBS用量固定为80 mL，改变离心转速，得到的脂质体粒径和PDI 结果如表3所示。从表3可以看出，当离心转速为20 000 r/min时，得到的脂质体粒径最小，约为114 nm，PDI值为0.214。

2.1.4　水合温度

将卵磷脂与胆固醇质量比固定为12∶1，水合时PBS用量固定为80 mL，离心转速设定为20 000 r/min，改变水合温度，得到的脂质体粒径、PDI结果如表4所示。由于水合温度对脂质体的形态具有重要影响，因此，在优化水合温度时利用TEM对脂质体的微观形貌进行了考察。从表4中可以看出，水合温度对脂质体的粒径影响不大，但对脂质体的形貌影响较大，当温度上调至55 ℃（卵磷脂的相变温度）时，脂质体从多隔室转变为单室。后续多隔室脂质体制备时的水合温度控制在35 ℃，单室脂质体的水合温度控制在55 ℃。

2.1.5　方法的重现性

在多隔室和单室脂质体的最佳制备工艺条件下，分别进行3次平行实验，结果如表5和表6所示。其中，多隔室脂质体的平均粒径约为109 nm，单室脂质体的平均粒径约为108 nm，且两种形态的脂质体的PDI值均小于0.2，分散性良好。据此可以说明本文制备脂质体的工艺方法重现性较好。

2.2　脂质体粒径分布

最佳工艺条件下制备的多隔室和单室脂质体的DLS图谱如图1所示。多隔室（MVs）和单室（UVs）脂质体DLS图谱均呈现尖锐单峰，粒径分别约为110、106 nm，PDI分别为0.185、0.167，说明脂质体粒径大小均一、分散性良好。

2.3　脂质体的微观形貌

于透射电子显微镜下观察最佳工艺条件制得脂质体的微观形貌，如图2所示。从图2A和2B中可以很清晰地看到，视野中出现一个大囊泡里面包裹数个小囊泡的脂质体，显示出典型多隔室脂质体的特征^［11］。图2C和2D则显示为单室囊泡形貌，囊泡表面光滑。

2.4　脂质体的外观及储存稳定性

从外观来看，制得的多隔室和单室脂质体悬液均为无色透明且有乳光的液体，4 ℃下存放60 d后依然清澈无沉淀产生。将5组最佳工艺条件下制备的多隔室和单室脂质体放入4 ℃环境中，分别在1、6、30、60 d测其粒径，结果如表7和表8所示。从表中可以看出，30 d后多隔室和单室脂质体粒径无明显变化，60 d后脂质体粒径略有增加，但增加幅度不大，表明该工艺条件下制得的多隔室和单室脂质体具有良好的储存稳定性。

3　 分析和结论

本实验对卵磷脂与胆固醇质量比、水合时PBS的用量、离心转速和水合温度4个脂质体制备过程中的重要变量进行工艺优化，以达到制备粒径较小、分散性良好且储存稳定性良好的脂质体的目的。脂质体制备过程中胆固醇的加入有利于增大膜的刚性和减小粒径，使卵磷脂双分子层结构更稳固。然而当胆固醇的添加量超过了双分子层的容纳限度后，反而会造成膜结构的破坏，使脂质体失去稳定性 ^［11］。根据表1的结果，卵磷脂与胆固醇的质量比为12∶1时，制备的脂质体粒径最小，且分散性良好。因此，合适的卵磷脂与胆固醇质量比是脂质体稳定的必要条件。同时，卵磷脂和胆固醇的质量比为12∶1时，制备的脂质体具有良好的储存稳定性。

水合时PBS的用量对脂质体的粒径和储存稳定性也有重要的影响。PBS用量过少，则脂质体悬液浓度过大，脂质体之间容易相互融合^［12］。因此，合适的PBS用量也是制备性能良好脂质体必须考虑的因素。离心转速也是影响脂质体粒径和均一性的重要因素。表3实验结果显示，随着离心转速的增加，脂质体粒径随之减小，当转速达到20 000 r/min时，所得的脂质体粒径最小。

根据文献报道^{［11，12］}，当温度高于磷脂的相变温度55 ℃时，脂质体的结构相对松散，磷脂分子间的距离较大，多层囊泡容易破裂为单层囊泡。Paleos等报道^［13］，当水合温度从45 ℃增加到50 ℃时，通过诱导小囊泡的融合，可制备得到大单室脂质体，粒径约为400 nm。由于粒径较大，该脂质体在体内的生物分布度较低。张斌等^［14］曾报道，传统薄膜分散法中，在旋转蒸发时加入直径为0.1 mm的玻璃珠，可以使脂质体粒径大小均一，经过超声处理也能够降低脂质体的粒径。为了得到小粒径的单室脂质体，本课题组在前期多隔室脂质体制备的最佳工艺条件下，将水合温度作为控制变量，上调水合温度至磷脂的相变温度55 ℃，旋转蒸发时加入直径为0.1 mm的玻璃珠，后续超声处理30 min。结果显示，当水合温度大于55 ℃时，制得的脂质体从多隔室转变为单室脂质体，并且粒径成功控制在110 nm左右。本文仅利用水合温度的控制，即可实现多隔室和单室脂质体的同时制备。

脂质体的粒径对于脂质体的体内生物学效应影响较大，当粒径小于20 nm时，脂质体容易被肾脏清除排出体外，体内半衰期短，不容易在靶细胞积累，但脂质体粒径过大则容易被体内巨噬细胞识别并吞噬，同样缩短体内的半衰期^［14］。文献报道显示^［15］，粒径在100 nm左右的脂质体具有较好的体内稳定性和肿瘤部位蓄积的能力。因此，本文制备的分散均一、稳定性良好，粒径约110 nm的多隔室和单室脂质体，预期可以实现较好的体内生物学效应。

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基金资助

国家自然科学基金(51403055)

国家自然科学基金(U1704150)